Name: Inducida por la forskolina Hinchazón en organoides intestinal: Una In Vitro Ensayo para evaluar la respuesta de drogas en pacientes con fibrosis quística (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprende a evaluar la función de CFTR y la eficacia de moduladores en organoides intestinales de pacientes con fibrosis quística mediante el ensayo de hinchazón inducido por forskolina. Este método permite personalizar tratamientos.

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Este trabajo fue apoyado por el programa HIT-CF de los holandeses CF fundación (CNSF), ZonMW (40-00812-98-14103), el Fondo de Investigación del Hospital Infantil Wilhelmina y CZ, y Zilverenkruis / Achmea. Nos gustaría dar las gracias a S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, y G. Berkers (Departamento de Neumología Pediátrica, el Hospital de Niños Wilhelmina, UMC Utrecht), y RHJ Houwen (Departamento de Gastroenterología Pediátrica, Wilhelmina hospital de niños, UMC Utrecht) para acercarse a los pacientes y obtener las biopsias para la generación de un CF Biobanco.

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Hans Clevers es un inventor de patentes para el cultivo de organoides y el ensayo de hinchazón inducida por forskolina. Jeffrey M Beekman es un inventor de una patente para el ensayo de hinchazón inducida por forskolina. Sylvia F Boj y Robert Vries son empleados de la Fundación Hubrecht Organoid Technology (HUB), que posee la licencia exclusiva de la tecnología Organoid. De lo contrario, los autores no tienen nada que revelar.

A continuación, ofrecemos un protocolo completo para la generación, la expansión, la congelación, descongelación y de organoides colorrectal humano. Si bien hemos establecido culturas organoides humanos alguna vez hace 17 años, que a veces ha sido difícil establecer la tecnología en otros laboratorios sin la formación práctica. Anticipamos que estos protocolos se sustituya dicha formación. Wnt-3A-medio condicionado es uno de los reactivos más importantes para tener éx...

CF está causada por mutaciones en el gen de la fibrosis quística regulador de la conductancia transmembrana (CFTR) que codifica un canal de aniones epitelial. CF afecta a aproximadamente 85.000 personas en todo el mundo 1. Más de 2.000 mutaciones CFTR se han identificado ( <a href="http://www.genet.sickkids.on.ca">www.genet.sickkids.on.ca</a> ). Esta diversidad explica parcialmente un amplio espectro de fenotipos de la enfermedad observados ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 2, 3. Seis clases de mutaciones CFTR se definen en función de su efecto sobre la expresión de la proteína CFTR y la función: (I) la síntesis de NO, (II) el tráfico deteriorado, (III) canal gating defectuoso, (IV) conductancia alterado, (V) niveles de reduce normalmente funcionamiento CFTR, y (VI) la estabilidad de la superficie celular alterada 4. Aunque las mutaciones CFTR comunes están bien estudiados, la función de CFTR y su relación con el estado clínico permanecen poorlY entiende a nivel del individuo, en particular para el gran grupo de mutaciones raras &quot;huérfanos&quot; ( <a href="http://www.CFTR2.org">www.CFTR2.org</a> ) 1, 3. Recientemente, se han desarrollado medicamentos que se dirigen a la proteína CFTR en una manera-mutación específica. Dos clases de fármacos de proteínas CFTR de metas se encuentran actualmente en uso clínico y tienen modos de acción diferentes. Potenciadores, como el VX-770, aumentan la probabilidad de apertura de-CFTR mutante localizada apicalmente y actúan directamente sobre su adición a las células 5. Correctores, tales como VX-809, restauran el tráfico de endoplásmico CFTR misfolded retículo-localizados y requieren pre-incubación con las células antes de que los efectos se observan 6. El potenciador CFTR, VX-770, ha sido registrada para los sujetos con la mutación G551D 7, 8, así como para otros ochoCFTR gating mutaciones, incluyendo S1251N 9; En conjunto, estas mutaciones se realizan en un 5% de todos los sujetos con FQ. Otros ensayos clínicos han indicado que VX-770, combinado con el corrector VX-809, ha limitado efectos todavía significativos sobre la función pulmonar y causa una disminución en las tasas de exacerbación en los sujetos homocigotos para la mutación F508del llevado por 45 a 50% de los pacientes 10, 11. ensayos clínicos convencionales para identificar sujetos sensibles al fármaco dentro del 50% restante de los pacientes con FQ son costosos y consumen mucho tiempo y no son factibles para los individuos con genotipos CFTR extremadamente raros. Novela, personalizados, métodos rentables son cruciales para que coincida con el creciente número de moduladores de CFTR a los individuos portadores de cualquier tipo de mutación CFTR. Hasta ahora, la inclusión de los ensayos de grupos de pacientes portadores de mutaciones CFTR específicos se ha guiado por los estudios que utilizan la transfección mutante del gen CFTR en hsistemas de células de eterologous, seguido de estudios electrofisiológicos en cámaras Ussing 5, 6, 12. Debido a la falta de modelos animales adecuados CF, estudios de eficacia de los medicamentos en las células epiteliales bronquiales de aire-líquido-interfaz-diferenciadas derivadas a partir de materiales de explantes de pulmón CF se han utilizado para el desarrollo de fármacos 13, 14, 15. Sin embargo, la limitada disponibilidad de tejidos de explantes de pulmón y los procedimientos invasivos para obtener células bronquiales de los sujetos sin enfermedad en fase terminal obstaculizar el análisis de mutaciones CFTR menos comunes y evitar las pruebas de drogas de una manera personalizada. Para superar estas limitaciones, los tejidos &quot;fácil acceso&quot;, como organoides colorrectal, células de las vías respiratorias nasales y las vías respiratorias células derivadas de células madre pluripotentes inducidas, están actualmente siendo explorado por los tratamientos farmacológicos personalizados. 16, 17. factores de crecimiento para el colon / recto humano, las condiciones de cultivo implican definido (factor de crecimiento epitelial (EGF), gastrina, Wnt-3A, R-espondina 3 (Rspo3), y Noggin) en combinación con moléculas pequeñas (nicotinamida, A83-01, y SB202190) en una matriz de membrana basal. En estas condiciones, las células madre individuales o fragmentos de tejido pequeños crecen hacia fuera en, quística, estructuras 3D cerrado formado por epitelio altamente polarizada con su lado basal orientada hacia el exterior. Todos los tipos de células suelen aparecer en sus proporciones y posiciones normales. Organoides pueden ampliarse durante períodos de tiempo largos por rotura mecánica semanal y re-recubrimiento. Ellos son genéticamente y fenotípicamente estables y pueden ser almacenados, lo que permite la expansión a largo plazo y bio-banca 17. Son susceptibles detodas las manipulaciones de células / biológica estándar genéticos y técnicas de análisis desarrolladas para líneas celulares 2D 18. Recientemente hemos demostrado que la función de CFTR se puede medir fácilmente en organoides colorrectal en un ensayo de inflamación inducida por la forskolina (FIS) 19, 20. Cuando se expone a la forskolina (FSK) o, alternativamente, a la toxina del cólera, organoides aumentan rápidamente su monofosfato de adenosina cíclico niveles (AMPc), que a su vez se traduce en la apertura del canal CFTR 19. Organoides de individuos sanos o de sujetos con mutaciones CFTR asociados con la función residual, posteriormente se hincharán como consecuencia de transporte de iones y agua al lumen de organoides, el equivalente in vitro de la diarrea secretora. La respuesta FIS de organoides colorrectal fue previamente demostrado ser totalmente dependiente de CFTR, como se indica por organoides derivados de individuos CFTR nulo unand por el uso de inhibidores de CFTR farmacológicas específicas 19. Grandes conjuntos de datos de temas específicos se pueden derivar dentro de varias semanas después de tomar una biopsia. Para el ensayo de la FIS se describe en detalle aquí, organoides se cultivan a partir de biopsias rectales que se pueden obtener a cualquier edad y con la única incomodidad limitada 21. Organoides se pasan semanalmente por la ruptura mecánica en criptas individuales que se vuelva a sellar y formar nuevos organoides fácilmente. Para ejecutar el ensayo de FIS, ~ 30-80 de estos pequeños organoides alterado son sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos 19. En el día del ensayo, los organoides se tiñeron con calceína verde, un colorante fluorescente de células permeable que está retenido dentro de las células vivas, lo que facilita imágenes en vivo. Entonces, FSK, lo que eleva el AMPc intracelular y por lo tanto activa CFTR, se añade con el fin de estimular la hinchazón organoide. Potenciadores que actúan sobre CFTR apical se añaden simultáneamente won la forskolina, mientras que los correctores que restauran el tráfico de CFTR se añaden 24 h antes de la adición de FSK. La hinchazón organoide se cuantifica mediante un análisis de imagen automatizado que calcula el aumento relativo de la superficie total de todos los objetos fluorescentes para cada punto de tiempo después de la adición de forskolina. 3D organoid hinchazón ofrece ventajas y desventajas sobre las lecturas de CFTR electrofisiológicos existentes en las vías respiratorias células cultivadas 2D en cámaras Ussing. Una ventaja importante es el rendimiento del ensayo de hinchamiento. Las células se cultivan y se ensayaron utilizando un único tipo de medio de cultivo, y un técnico con experiencia pueden cultivo hasta 25 muestras de organoides sobre una base semanal, mientras que la cuantificación de aproximadamente 1200 puntos de datos por semana en 12 muestras de pacientes. Que convencionalmente escribir una sola condición experimental por medio de mediciones por duplicado o triplicado por placa y repetir dichas mediciones en tres momentos de incubación independientes. En total, aproximadamente 300-500 single organoide estructuras se miden por condición experimental, lo que lleva a mediciones muy precisas de la función de CFTR con variabilidad técnica limitada. Esta precisión nos permite definir con claridad las diferencias en la función y la respuesta residual a moduladores de CFTR y nos permite recoger fácilmente a efectos de fondo genéticas entre los pacientes portadores de mutaciones CFTR idénticos 19, 22, 23, 24, 25. calidad de los datos se puede evaluar fácilmente a partir de imágenes de microscopio. Mientras FIS es totalmente dependiente de CFTR, que es una medida de resultado indirecto de la función de CFTR, su lectura fuera causado por el acoplamiento del transporte de iones para el transporte de fluidos. Esto contrasta con las mediciones de la función de CFTR directos en cámaras Ussing, que miden las corrientes de iones transepiteliales 26. cámaras Ussing permiten la estimulación de selección de c apical o basolateralompartments (que el ensayo no permite organoid); por permeabilización de la membrana basolateral, la secreción de aniones CFTR dependiente apical se puede medir de forma selectiva 27.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco avanzado' s Águilas Modificadas Medio con Mezcla de Nutrientes F-12 Jamones (Ad-DF) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#12634</td><td>almacenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#35050</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td># 15630-056</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>placa de cultivo de 96 pocillos</td><td>Cellstar</td><td>#655180</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de 24 pocillos</td><td>Cellstar</td><td>#662160</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de 6 pocillos</td><td>Cellstar</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#14190-094</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águilas Modificadas Medium&nbsp; (DMEM) 500 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#31966-021</td><td>para la producción de medios acondicionados Wnt-3A. Almacenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>#SFBS LOTE # 11113</td><td>para la producción de medio acondicionado Wnt-3A. Almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>L Wnt3A línea celular</td><td>ATCC</td><td>#CRL-2647</td><td>para la producción de medios de condición Wnt-3A.</td></tr><tr><td>Plásmidos TOP/FOP</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>#17-285</td><td>Para medir la actividad</td></tr><tr><td>de Wnt pTK-Renilla</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E2241</td><td>Para medir la actividad de Wnt</td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td>Para medir la actividad de Wnt</td></tr><tr><td>Sistema de ensayo reportero de luciferasa dual</td><td>Promega&nbsp;</td><td>#E1910</td><td>Para medir la actividad de Wnt</td></tr><tr><td>Zeocin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#R250-01</td><td>para Wnt-3A Selección de línea celular</td></tr><tr><td>B27 suplemento&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific:&nbsp; Invitrogen</td><td>#17504-044</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A9165-5G</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#N0636</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epitelial humano (hEGF)</td><td>PrepoTech</td><td>#AF-100-15</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G9145</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>TGFb tipo I Inhibidor del receptor (A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>#2939</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato (RhoKi)</td><td>Selleckchem</td><td>#S1049</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>p38 Inhibidor de MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#S7067</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>#ant-pm-1</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Human Noggin (hNoggin)</td><td>PrepoTech</td><td>#120-10C</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>R-espondina 3 humana (hRspo-3)</td><td>R& D Systems</td><td>#3500-RS/CF</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#861987- 250mg</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#15710-049</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ácido etilendiamina tetraacético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#431788</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td>almacenado a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>TryplE Express&nbsp;</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#12605-010</td><td>para tripsinizar organoides para congelar</td></tr><tr><td>Recovery Cell Culture Freezing Medium Life</td><td>Technologies: Gibco</td><td>#12648010</td><td>para congelar</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Life Technologies: Gibco</td><td>#C3100MP</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>R& D Systems</td><td>#1099-50 mg</td><td>almacenado a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1565</td><td>almacenado a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>Selleckchem</td><td>#s1144</td><td>almacenado a -80 &deg; C</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre de los reactivos/Material</fuerte></td><td><fuerte>Disolvente</fuerte></td><td><fuerte>Concentración de stock</fuerte></td><td><fuerte>Concentración final</fuerte></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td></td><td>200 mM</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td></td><td>10K U/ml 10K &micro; g/ml</td><td>100 U/ml 100 y micro; g/ml</td></tr><tr><td>de Zeocin&nbsp;</td><td></td><td>100 mg/ml&nbsp;</td><td>125 y micro; g/ml</td></tr><tr><td>de suplemento B27&nbsp;</td><td></td><td>100x</td><td>1x</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>MiliQ H2O</td><td>500 mM</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>DPBS</td><td>1 M</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epitelial humano (hEGF)</td><td>DPBS 0,1% BSA 0,5</td><td>mg/ml</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>DPBS</td><td>100 &micro; M</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Inhibidor del receptor TGFb tipo I (A83-01)&nbsp;</td><td>DMSO</td><td>5 mM</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato (RhoKi)</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>10 y micro; M</td></tr><tr><td>p38 Inhibidor de MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>DMSO</td><td>30 mM</td><td>10 y micro; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td></td><td>50 mg/ml&nbsp;</td><td>100 y micro; g/ml</td></tr><tr><td>Human Noggin (hNoggin)</td><td>DPBS 0.1%BSA</td><td>100 &micro; g/ml</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>R-espondina humana 3 (hRspo-3)</td><td></td><td>varía por lote</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 y micro; g/ml</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td></td><td>10 mg/ml</td><td>50 y micro; g/ml</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>MiliQ H2O</td><td>0,5 M</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Calceína</td><td>DMSO</td><td>10 &micro; g/ml</td><td>3,3 ng/ml</td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>DMSO</td><td>10 mM</td><td>variable</td></tr><tr><td>Lumacaftor (VX-809)</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>variable</td></tr><tr><td>Ivacaftor (VX-770)</td><td>DMSO</td><td>20 mM</td><td>variable</td></tr></tbody></table>

inducida por la forskolina hinchazón en organoides intestinal: una<em&gt; in vitro</em&gt; ensayo para evaluar la respuesta de drogas en pacientes con fibrosis quística

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Los fármacos moduladores del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) recientemente desarrollados corrigen la expresión superficial y/o la función del canal CFTR mutante en sujetos con fibrosis quística (FQ). La identificación de los sujetos que pueden beneficiarse de estos fármacos es difícil debido a la gran heterogeneidad de las mutaciones de CFTR, así como a otros factores desconocidos que contribuyen a la eficacia individual de los fármacos. Aquí, describimos un ensayo simple y relativamente rápido para medir la función y la respuesta individuales de CFTR a los moduladores de CFTR in vitro. Los organoides epiteliales tridimensionales (3D) se cultivan a partir de biopsias rectales en medio organoide estándar. Una vez establecidos, los organoides pueden ser bio-almacenados para análisis futuros. Para el ensayo, se siembran entre 30 y 80 organoides en placas de 96 pocillos en la matriz de la membrana basal y luego se exponen a fármacos. Un día después, los organoides se tiñen con verde calceína y la hinchazón inducida por forskolina se controla mediante microscopía confocal de células vivas a 37 °C. La hinchazón inducida por forskolina es totalmente dependiente de CFTR y es lo suficientemente sensible y precisa como para permitir la discriminación entre las respuestas a los fármacos de individuos con mutaciones de CFTR diferentes e incluso idénticas. Las respuestas de hinchamiento in vitro se correlacionan con la respuesta clínica al tratamiento. Este ensayo proporciona un enfoque rentable para la identificación de individuos sensibles a los fármacos, independientemente de sus mutaciones en CFTR. También puede ser fundamental en el desarrollo de futuros moduladores CFTR.

La figura 1A muestra un aislamiento fresca representante de criptas incrustados en BMM. Las criptas son de una biopsia de colon de un sujeto CF. Por lo general, un organoide se genera a partir de cada cripta (Figura 1A - C). Debido a la disfunción de la CFTR, la mayoría de los organoides de colon CF no son quística, sino más bien son compactos y con proyecciones y injertos (Figura 2A - 2B). Sin embargo, ...

Este protocolo describe un ensayo para medir la función de CFTR y las respuestas de los moduladores de CFTR en tejido cultivado de sujetos con fibrosis quística (FQ). Los organoides intestinales derivados de la biopsia se hinchan de forma impulsada por el AMPc, una respuesta que es defectuosa (o muy reducida) en los organoides de la FQ y que puede restaurarse mediante la exposición a los moduladores de CFTR.

Inducida por la forskolina Hinchazón en organoides intestinal: Una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la respuesta de drogas en pacientes con fibrosis quística

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función individual del CFTR y la eficacia de los tratamientos moduladores del CFTR mediante un ensayo de hinchazón inducida por forskolina, o ensayo FIS, en organoides intestinales generados a partir de pacientes con Fibrosis Quística. Este método aborda preguntas clave en el campo de la Fibrosis Quística. En particular, ayuda a identificar a los pacientes que pueden beneficiarse a largo plazo de fármacos existentes o experimentales.La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar un tejido fácilmente accesible para generar organoides de cualquier paciente con fibrosis quística, independientemente de la edad. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la ortoterapia de la fibrosis quística y abordan una necesidad urgente actual de evaluar la eficacia de fármacos de manera individual y rentable. Marvin Statia, del Hubrecht Organoid Technology, y Annelot Vonk, del grupo de Jeffrey Beekman, demostrarán el procedimiento.Para obtener datos óptimos del ensayo de hinchazón inducida por forskolina, es esencial trabajar con un cultivo que contenga organoides grandes con múltiples brotes. Tras identificar un cultivo d

forskolin-induced-swelling-intestinal-organoids-an-vitro-assay-for

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Aquí, se describe un protocolo para la cosecha, mantener y tratar de ratón pequeñas organoides intestinales con patrones patógenos asociados moleculares (PAMPs) y Listeria monocytogenes, así como énfasis en la expresión génica y las técnicas de normalización adecuados para las proteínas.

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

Aquí se describe un método para generar culturas esferoide tridimensional de células epiteliales nasales humanas. Esferoides son estimulados luego a unidad de regulador de conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR)-ion dependiente y secreción flúida, cuantificar el cambio en el tamaño luminal esferoide como un proxy para la función CFTR.

Generación de células epiteliales nasales humanas esferoides para estudio de regulador de conductancia de la transmembrana individualizada la Fibrosis quística

Aquí se presenta un protocolo detallado para describir un modelo organoide in vitro de células epiteliales nasales humanas. El protocolo tiene opciones para mediciones que requieren equipos de laboratorio estándar, con posibilidades adicionales para equipos y software especializados.

Cultivo e imágenes de organoides epiteliales nasales humanos

Este protocolo describe un método para el estudio de proteínas de membrana electrogénicas midiendo los cambios en el potencial de membrana. Este ensayo proporciona una plataforma para la lectura funcional de múltiples canales iónicos expresados endógenamente en líneas celulares epiteliales.

Un ensayo basado en fluorescencia del potencial de membrana para el estudio funcional de alto rendimiento de dos canales iónicos endógenos en dos líneas celulares epiteliales

Aquí, presentamos un protocolo que describe el cultivo de organoides intestinales caninos en un sistema de soporte permeable de doble cámara. Se describe la siembra de organoides en los soportes permeables, el mantenimiento de la monocapa y los experimentos posteriores de permeabilidad al fármaco.

Organoides intestinales caninos en un sistema de soporte permeable de doble cámara

Los organoides intestinales derivados de biopsias y las tecnologías de organ-on-a-chips se combinan en una plataforma microfisiológica para recapitular la funcionalidad intestinal específica de la región.

Combinación de organoides humanos y tecnología organ-on-a-chip para modelar la funcionalidad específica de la región intestinal

Este protocolo describe el análisis de morfología organoide rectal (ROMA), un nuevo ensayo diagnóstico para la fibrosis quística (FQ). Las características morfológicas, a saber, la redondez (índice de circularidad, IC) y la presencia de un lumen (relación de intensidad, IR), son una medida de la función CFTR. El análisis de 189 sujetos mostró una discriminación perfecta entre FQ y no FQ.

Análisis de morfología organoide rectal (ROMA): un ensayo de diagnóstico en fibrosis quística

Los cocultivos organoide-fibroblastos proporcionan un modelo para estudiar el nicho de células madre in vivo . Aquí, se describe un protocolo para los cocultivos organoide-fibroblastos esofágicos. Además, se utilizan imágenes de montaje completo para visualizar la interacción fibroblasto-organoide.

Caracterización funcional y visualización de fibroblastos esofágicos mediante cocultivos organoides

Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides intestinales de ratas y usarlos en varias aplicaciones posteriores. Las ratas suelen ser un modelo preclínico preferido, y el robusto sistema de organoides intestinales satisface la necesidad de un sistema in vitro para acompañar los estudios in vivo .

Generación y manipulación de organoides intestinales de rata

Este protocolo tiene como objetivo evaluar péptidos biofuncionales autoensamblables para la adhesión celular, la morfología de organoides y la expresión génica mediante inmunotinción. Utilizaremos una línea celular de cáncer colorrectal para proporcionar una forma rentable de obtener organoides para pruebas intensivas.

Fabricación y caracterización de organoides de cáncer colorrectal de la línea celular SW1222 en matriz de péptidos autoensamblables ultracortos

Este estudio describe un protocolo para generar monocapas 2D de organoides porcinos derivados del intestino delgado y grueso. El crecimiento de estas monocapas se caracteriza por el aumento de los valores de TEER, lo que indica una sólida integridad epitelial. Además, estas monocapas exhiben respuestas secretoras fisiológicas en experimentos en cámara de Ussing después de la aplicación de forskolina.

Organoides intestinales porcinos bidimensionales que reflejan las propiedades fisiológicas del intestino nativo

Aprende a evaluar la función de CFTR y la eficacia de moduladores en organoides intestinales de pacientes con fibrosis quística mediante el ensayo de hinchazón inducido por forskolina. Este método permite personalizar tratamientos.

Inducida por la forskolina Hinchazón en organoides intestinal: Una In Vitro Ensayo para evaluar la respuesta de drogas en pacientes con fibrosis quística (Video) | JoVE Journal

Inducida por la forskolina Hinchazón en organoides intestinal: Una

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