Aislamiento de ratón endometrial epiteliales y células del estroma de

Los objetivos generales de este procedimiento son aislar y cultivar células primarias murinas endometriales, estromales y epiteliales para su co-cultivo con el fin de estudiar la decidualización in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina reproductiva, como cuál es la señalización paracrina entre las células epiteliales y estromales durante procesos importantes como la decidualización y la invasión de los trofoblastos, y cómo se regula esta vía de señalización. Estas técnicas pueden utilizarse para estudiar el proceso de decidualización en un sistema de co-cultivo epitelial y estromal.

Mediante el uso de este sistema, se puede evaluar si las moléculas de señalización secretadas por una de las dos células pueden afectar este proceso. Antes de extraer el útero, realice un examen de frotis vaginal para verificar las fases del ciclo de los animales. Seleccione únicamente ratones en fase de estrus.

Se caracteriza por la presencia de células epiteliales corneales en el lavado vaginal. A continuación, use pinzas y tijeras para abrir el abdomen del primer animal en estro y desplace los intestinos hacia un lado para visualizar ambos cuernos uterinos. Sujete un cuerno en su extremo más distal, debajo de la trompa de Falopio, y seccione el tejido uterino de la trompa de Falopio usando pinzas de disección y pinzas Dumont número cinco para eliminar los tejidos adiposo y conectivo.

Luego, retire el cuerno en el extremo distal, por encima del cuerpo uterino. Después de retirar los cuernos uterinos, colóquelos en una placa de Petri de 35 milímetros con tres mililitros de HBSS. Cuando se hayan recolectado todos los cuernos uterinos, transfiera la placa bajo un microscopio estereoscópico y use pinzas para eliminar cualquier tejido adiposo y conectivo residual.

Luego, utilizando pinzas Dumont número cinco, pinzas de disección y tijeras pequeñas de resorte, abra longitudinalmente los cuernos uterinos para exponer sus lúmenes y enjuague los tejidos en una nueva placa de Petri que contenga HBSS fresco. Ahora, transfiera todos los cuernos a un tubo de 15 mililitros que contenga pancreatina y tripsina. Incube los tejidos horizontalmente durante 60 minutos a cuatro grados centígrados y 50 rpm en un agitador orbital.

Al finalizar la hora, transfiera el tubo al banco para un periodo de incubación horizontal de 45 minutos sin agitación, seguido por una incubación horizontal de 15 minutos sin agitación en un baño de agua a 37 grados celsius. Al finalizar la incubación en el baño de agua, vierta cuidadosamente el sobrenadante y transfiera los úteros a una placa de Petri que contenga medio frío para células epiteliales endometriales de ratón durante cinco minutos, con el fin de inactivar la actividad de la tripsina. A continuación, transfiera los tejidos a un tubo de 15 mililitros que contenga tres mililitros de HBSS frío, y vortexee los tejidos durante 10 segundos para liberar las láminas epiteliales.

Luego, enjuague los úteros en una nueva placa de Petri que contenga tres mililitros de HBSS fresco, y recoja otras dos suspensiones de láminas epiteliales en dos nuevos tubos de 15 mililitros, tal como se acaba de demostrar. Después del tercer vortex del tejido, transfiera los úteros a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga la mezcla de digestión de células estromales endometriales de ratón para una incubación de 30 minutos a 37 grados celsius y 200 rpm. Recupere las láminas epiteliales pipeteando suavemente las tres suspensiones celulares a través de una malla de nylon de 100 micrones para eliminar los restos de tejido, seguido de la centrifugación de la suspensión celular resultante.

Re-suspenda el precipitado en 12 mililitros de medio para células epiteliales endometriales de ratón con mezcla completa, luego deje reposar la solución durante cinco minutos para separar por gravedad las células estromales endometriales de ratón restantes. Al final de la sedimentación, use una pipeta de cinco mililitros para retirar cuidadosamente los dos mililitros superiores del sobrenadante y centrifugue las células recolectadas. A continuación, re-suspenda el precipitado epitelial de ratón en medio epitelial mediante pipeteo suave.

Y siembre las células en cubreobjetos recubiertos con colágeno a la densidad adecuada para el análisis posterior planeado. Después del aislamiento de las células epiteliales, continúe con las células estromales y retire el tubo de digestión de células estromales de ratón con los úteros del incubador. Después de la incubación de 30 minutos, como se acaba de demostrar, agite suavemente el tubo a mano durante 10 segundos y transfiera los úteros a una placa de Petri que contenga tres mililitros de HBSS a cuatro grados Celsius.

Lave bien los tejidos, luego agregue tres mililitros de medio para células estromales al tubo de digestión para inactivar la actividad de la tripsina y transfiera los úteros a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga tres mililitros de medio fresco para células estromales endometriales de ratón. Agite suavemente el tubo con el tejido durante 10 segundos. A continuación, transfiera los úteros a una placa con HBSS frío, seguido de su transferencia a un nuevo tubo de 15 mililitros con medio para células estromales.

Después de un tercer lavado y traslado del tejido, incubar los tejidos uterinos en una mezcla fresca de digestión de células estromales endometriales de ratón durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Al final de la digestión, pasar las suspensiones celulares del tubo uno al tres y del tubo de tripsina a través de una malla de nailon de 40 micrones y lavar la malla con cinco mililitros adicionales de medio para células estromales endometriales de ratón. A continuación, recoger las células mediante centrifugación.

Y resuspenda el sedimento en medio fresco para células estromáticas endometriales de ratón para su siembra en cubreobjetos recubiertos con polilisina a la densidad adecuada para el análisis posterior planeado. La pureza de los cultivos celulares primarios puede evaluarse mediante las diferencias en la expresión de vimentina y citoqueratina, ya que los niveles de vimentina son altos en las células estromáticas endometriales de ratón y bajos en las células epiteliales endometriales de ratón, mientras que los niveles de citoqueratina son altos en las células epiteliales endometriales de ratón y bajos en las células estromáticas endometriales de ratón.

La doble tinción de mentina/citoqueratina ilustra además la expresión de la mentina por las células estromales, así como la expresión exclusiva de citoqueratina por las células epiteliales. La inducción de decidualización en cultivos de células estromales mediante la aplicación de adenosina monofosfato cíclico y MPA revela que los niveles de ARNm de prolactina aumentan drásticamente tras cinco días de tratamiento en comparación con los cultivos de células estromales control. Dado que las células epiteliales son difíciles de visualizar en insertos laterales de cultivo celular, se podría realizar un ensayo de viabilidad inmediatamente después de una simulación de decidualización de cinco días, en el que un cambio de color de azul a rosa brillante indicaría la presencia de células epiteliales viables.

Tras aplicar esta técnica, se pueden realizar otros métodos, como ensayos de adhesión de blastocistos, con el fin de evaluar si los factores secretados por las células epiteliales en presencia de un blastocisto pueden inducir la decidualización de las células estromales.