Name: Aislamiento de ratón endometrial epiteliales y células del estroma de In Vitro decidualization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a aislar células epiteliales y del estroma endometrial de ratón para estudiar la descidualización in vitro mediante cocultivo. Este método permite investigar la señalización paracrina entre ambos tipos celulares.

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Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO G.0856.13N) y el Consejo de Investigación de la Universidad Católica de Lovaina (OT / 13/113). KDC es financiado por el FWO Bélgica. AH es financiado por OT / 13/113. Nos gustaría dar las gracias a la instalación Cell Imaging Core de la Universidad Católica de Lovaina (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) para el uso del microscopio confocal.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Decidualization es la diferenciación de progesterona dependiente de las células del estroma endometrial a las células deciduales ronda secretoras. En humanos, este proceso se produce de forma espontánea durante la fase lútea del ciclo menstrual y se inicia en las células del estroma que rodean a las células vasculares para formar el predecidua. Sin embargo, en los roedores, la presencia de un blastocisto es imperativo para inducir decidualization. El hecho de que decidualization sólo se produce después del contacto con las células epiteliales del endometrio implica que los factores importantes son secretadas por las células epiteliales para inducir decidualization en el estroma subyacente. Aunque esta diferencia en la iniciación del proceso de decidualization debe ser reconocido, el hecho de que decidualization humano se vuelve más robusta a la implantación del embrión sugiere que mecanismos similares podrían estar involucrados. In vitro de cultivos celulares a menudo se utilizan para estudiar el efecto de moléculas específicas durante el proceso de decidualization.Sin embargo, la disponibilidad y la cantidad de tejido humano que puede ser recogida suele ser limitada y acompañadas de variaciones, por ejemplo, la fase del ciclo, número de embarazos y la presencia de enfermedades ginecológicas como la endometriosis o adenomiosis. Muchos de estos problemas pueden evitarse con el uso de tejido murino que es fácilmente accesible y la fase del ciclo independiente. Otra gran ventaja de la utilización de tejido murino es la oportunidad de utilizar los roedores modificados genéticamente y por la posibilidad de instalar un gran número de experimentos. Por el momento, muchos protocolos de aislamiento diferentes se han descrito en la literatura con alta variabilidad en la edad de los animales y el período en la fase de estro en el momento de uso. En este estudio se presenta un nuevo método para endometriales co-cultivos primarios de células estromales y epiteliales en el que se aprovechó de un ciclo estral estandarizada por una inyección diaria de estrógeno antes del aislamiento. Además, el estrógeno es known para inducir la proliferación en las células epiteliales y estromales que aumenta aún más el rendimiento por aislamiento. El protocolo de aislamiento descrito en este documento se basa en Grant et al. 7, sin embargo, se incluyeron otras medidas de optimización para aumentar el rendimiento, la pureza y la viabilidad de los diferentes cultivos celulares. En primer lugar, HBSS siempre fue suplementado con antibióticos para evitar la contaminación del cultivo primario. Durante el aislamiento de MEEC, se llevó a cabo una adaptación de la temperatura (15 min a 37 ° C) para aumentar la cosecha de las células epiteliales durante la primera digestión. A continuación, se incluye un paso adicional para moderar la actividad enzimática después de digestión con tripsina mediante la adición de medio que contiene FBS para inhibir su actividad. Además, MEECs se pasaron a través de un filtro de la cual la malla era más grande que lo que se describe comúnmente (100 micras) ya que a menudo vienen en racimos y láminas de células. Por otra parte, la contaminación por células estromales se redujo mediante la realización de un complementoitional etapa en la que MEECs y mESCs fueron separados basados ​​en la sedimentación por gravedad. Finalmente, MEECs se sembraron en cubreobjetos recubiertos con colágeno para aumentar la unión de las células a cubreobjetos de vidrio, como se puso de manifiesto que el apego a cubreobjetos de vidrio no recubiertas o-PLL era insuficiente. Durante el aislamiento de los mESCs, se complementó colagenasa (1 mg / ml) para mejorar la digestión. Además, esta etapa de digestión se realizó por duplicado para evitar la contaminación de MEECs restantes. Todos estos pasos adicionales resultaron en cultivos puros y viables de poblaciones celulares homogéneas. La pureza de la población de células se evaluó con inmunotinción y QRT-PCR usando vimentina como marcador del estroma y citoqueratina como un marcador epitelial. Claramente, se observó un patrón de expresión opuesto de vimentina y citoqueratina en MEEC y MESC. Sin embargo, se puede notar que la expresión mRNA relativa de vimentina y citoqueratina es similar en los cultivos MEEC. similar resultados son publicados por otros grupos de investigación, en el que las células epiteliales en la expresión de vimentina cultura adquieren 9. Más importante es la diferencia en la expresión de proteínas entre vimentina y citoqueratina como se observó en los inmunohistoquímico coloraciones de las diferentes poblaciones de células. inmunotinción doble mostró que EECs fueron positivas para citoqueratina y ESC fueron positivas para vimentina. El uso de estos marcadores en la inmunotinción es un método establecido y de manera estándar utiliza para indicar los tipos de células 10. Aunque una gran cantidad de investigación se ha realizado en el decidualization de MESC, sigue siendo posible que la presencia de células epiteliales en este modelo puede alterar los resultados de decidualization. En primer lugar, se ha demostrado que si MEEC crecer a una monocapa en presencia de medio MESC acondicionado o en un entorno de co-cultivo, la monocapa tiene una resistencia eléctrica transepitelial mejorada de células epiteliales (TEER), como resultado de factores secretados por MESC 7. Por otra parte, Pierro et al. 11 proporcionan evidencia de que la proliferación epitelial, influenciado por 17β-estradiol, podría estar mediado por factores secretados por las células del estroma, y de forma alternativa, las células epiteliales pueden liberar factores que modulan decidualization estroma 12, 13. En general, es evidente que el entorno de co-cultivo epitelial-estromal ofrece una situación más fisiológica que permite la interacción paracrina y la comunicación. El método de cultivo de dos tipos de células diferentes utilizando un sistema de co-cultivo inserto se ha descrito anteriormente 14, 15 y se ha adaptado para el uso de células primarias de múrido. Por la detección de los niveles de mRNA de prolactina como de salida para leer decidualization, la técnica descrita tiene un muy reproducible de lectura de salida para decidualization disponible y permitirs así el estudio de la relación epitelial-estromal durante decidualization. paracrinos señales mediadas de MEEC podrían alterar el alcance de decidualization en las células del estroma. Además, el modelo permite la modulación específica de la parte epitelial sin afectar directamente a las células del estroma. Por lo tanto, esta co-cultivo de MEEC y MESC ofrece una herramienta perfecta para evaluar el efecto de las hormonas, citoquinas, etc., en las células epiteliales con una lectura de datos en decidualization estromal. Otra ventaja de este sistema de cultivo es que permite a los investigadores estudiar la implicación de una proteína específica en el decidualization-proceso, ya sea en el epitelial o compartimiento del estroma mediante el uso de células aisladas de animales transgénicos. Además, esta técnica será muy útil para investigar la adhesión de blastocisto para evaluar si los factores paracrinos secretadas por las células epiteliales en presencia de un blastocisto son suficientes para inducir decidualization de la estroma subyacenteCélulas. Un paso importante en la invasión del trofoblasto correlacionada con degradación de la matriz extracelular, que está mediada por la acción de enzimas proteolíticas. La técnica propuesta se puede aplicar como un modelo in vitro para investigar la diafonía entre el blastocisto, las células epiteliales y del estroma de soporte. Sin embargo, por el momento se sabe poco sobre el origen de las células epiteliales que pueden ser, así como luminal glandular. Por lo tanto, se requiere una mayor caracterización del perfil genético y molecular de las células epiteliales. Además, el método descrito está limitado en el conocimiento disponible acerca de la polarización de las células epiteliales. Por el momento, la polarización de las células epiteliales no se tuvo en cuenta. Sin embargo, diferencias en la expresión de proteínas de membrana se describen en las membranas apicales y basales. la polarización inadecuado de la capa epitelial podría tener un impacto en la interacción paracrina entre epitheliAl y las células del estroma. Sin embargo, los métodos para obtener células epiteliales polarizadas se ha descrito y se podrían incluir en la técnica descrita 15, 16. En total, el protocolo descrito propone una técnica para establecer con éxito cultivos celulares primarios de ratón epitelial endometrial y células del estroma. Esta técnica resulta en cultivos de células puras como se confirma por QRT-PCR y la inmunotinción de vimentina y citoqueratina. En última instancia, se introdujo una epiteliales y del estroma de co-cultivo que permite la investigación de las señales paracrinas mediadas por cualquiera de MEEC y / o MESC en el proceso decidualization.

El endometrio humano es el revestimiento interno del útero y se somete a ciclos mensuales de descomposición y la reparación como una preparación para posibles embarazos. Se compone de una sola capa de células epiteliales que recubren el lumen uterino y el estroma subyacente que varía de espesor de acuerdo con las fluctuaciones de las hormonas ováricas estrógenos y progesterona. Durante la fase luteal, el aumento de la progesterona posovulatorio inducirá la diferenciación de las células del estroma endometrial a las células deciduales más grandes, redondas, un proceso llamado decidualization 1, 2. En humanos, este fenómeno se produce de forma espontánea para formar el predecidua, pero se hace más pronunciada después de la implantación del embrión. A consecuencia funcional de decidualization es que el útero se vuelve transitoriamente receptivo a la implantación del embrión. Este intervalo se denomina como la &quot;ventana de implantación&quot;. Durante el período inicial de la implantación del embrión, el correo decidualizedlas células del estroma que rodean ndometrial el embrión implante proporcionarán una barrera para impedir el paso de sustancias perjudiciales para el embrión 3. Durante el embarazo, este decidua proporcionará nutrientes para el desarrollo del feto antes de placentación ha tenido lugar, y más tarde formará la parte materna de la placenta 4. Consideraciones éticas y prácticas limitan el diseño de los estudios en humanos para investigar el proceso de decidualization y han impulsado el uso de modelos animales. Al ser un miembro del grupo de placentación hemochorial, el endometrio de roedores también va a sufrir decidualization antes de la placentación 5. En los roedores, sin embargo, el inicio del proceso de decidualization depende de la presencia de los blastocistos en el lumen uterino, lo que indica que un estímulo extra es necesario para activar las respuestas deciduales 6. Esto implica una compleja comunicación entre THe células endometriales epiteliales que tienen contacto directo con el blastocisto y las células del estroma subyacente. Sin embargo, decidualization puede inducirse artificialmente mediante estímulos como el rascado mecánico o la instilación de aceite en un útero preparado hormonal. Aunque los estudios in vivo utilizando modelos artificiales decidualization nos han permitido mejorar nuestros conocimientos en el proceso complejo de señalización de decidualization, mecanicistas estudios en profundidad, por ejemplo, la investigación de la comunicación indispensable entre las células epiteliales y del estroma, son limitadas. Por lo tanto, en estudios in vitro decidualization se pueden utilizar para manipular vías importantes y estudiar los procesos fundamentales. Con este fin, los cultivos de células estromales endometriales primarios se pueden configurar de endometrio humano o de roedores. El empleo de los roedores consiente el uso de animales modificados genéticamente para investigar el papel de una proteína específica de interés durante el proceso de decidualization. Sin embargo, no maduro, prepúberratones ty se utilizan a menudo con el fin de evitar complicaciones del ciclo estral, mientras que en otros casos úteros se recogen de todas las fases del ciclo estral, lo que resulta en una heterogeneidad en los cultivos. Además, el proceso de decidualization se ha estudiado en diferentes protocolos, por ejemplo, por (i) las hormonas que complementa (estrógeno, progesterona o monofosfato de adenosina cíclico (cAMP)) al medio de cultivo, o por (ii) el aislamiento de las células deciduales de los ratones en día 4,5 de la gestación (pseudo), que exigen la necesidad adicional para la comprobación de enchufe y machos vasectomizados. Estas limitaciones demuestran la necesidad de un método estandarizado para estudiar en decidualization vitro. En este estudio, un modelo fisiológico para examinar decidualization in vitro a partir de adulto, se presentarán (pseudo) ratones no embarazadas. En este método, la inyección diaria de 17β-estradiol (E2) se induce la proliferación de las células del endometrio, dando como resultado un aumento del rendimiento de homogénea y ppoblaciones de células ure. Además, el uso de un sistema de cocultivo permite el estudio de la diafonía epitelial-estromal y la capacidad de manipular el proceso de decidualization en diferentes niveles.

<table><tbody><tr><td>Inserto de cultivo de tejidos ThinCert para placas de 24 pocillos; 1 y micro; m tamaño de los poros; </td> Los insertos <td>transparentes Greiner Bio-one</td><td>662610</td><td>también se proporcionan para otras placas de pocillos múltiples y/u otros tamaños de poro. Otros proveedores: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/&nbsp;</td></tr><tr><td>Cultivo celular Nunc tratado con placas de 24 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475 8-bromoadenosina 3&prime;,5&prime;-sal sódica monofosfato cíclico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7880</td><td>Prepare una solución madre de 100 mM en agua Milli Q. Almacene las alícuotas en -20 &deg;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>Medroxiprogesterona 17-acetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1629</td><td>Prepare una solución madre de 250 &micro; M en etanol. Almacene las alícuotas a -20 &deg;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>Aceite de arachis</td><td>Supermercado</td><td></td><td>El aceite de arachis de cocina estándar que se puede encontrar en todos los supermercados se utiliza</td></tr><tr><td>Reactivo de viabilidad celular PrestoBlue</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13261</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1 HBSS 1x, sin calcio, sin magnesio, sin fenol rojo</td><td>Gibco</td><td>14175-046</td><td>Almacene en el refrigerador el mayor tiempo posible. Utilice HBSS+ frío durante el protocolo. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&nbsp; </td></tr><tr><td>17-y beta; Estradiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8875</td><td>Prepare una solución madre de 1 mg/mL en EtOH antes de diluirla en aceite de arachis (1:1.000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&amp; region=BE</td></tr><tr><td>Filtro de medio celular Stericup, 0.22 &micro; m, polietersulfona, 500 mL, radioesterilizada</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (5.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063</td></tr><tr><td>DMEM/F12, rojo fenol, L-glutamina, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, calificado, inactivado por calor, aprobado por la UE, Sudamérica Origen</td><td>Gibco</td><td>10500-056</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018</td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037 DMEM, glucosa baja, piruvato, sin glutamina, sin rojo de fenol</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D5921</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>MCDB-105</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6395</td><td>Diluir en agua Milli Q, ajustar el pH a 7 con NaOH y filtrar antes de usar. Almacenar en la oscuridad. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>Insulina de páncreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1882</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Cubreobjetos, vidrio, 18 mm &Oslash;</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td><td>1001/18</td><td>http://www.hecht-assistant.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 & tx_rmproducts_pi1[p]=3504 & tx_rmproducts_pi1[v]=20088 & cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IA de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094 Tripsina de páncreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7409</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Calentar a temperatura ambiente antes de usar. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&nbsp; </td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 y micro; m mesh, desechable</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>Filtro de células, 100 &micro; m mesh, desechable</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>Millex-GP Unidad de filtro de jeringa, 0.22&nbsp; y micro; m, polietersulfona, 33&nbsp; mm, esterilizado con rayos gamma</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1</td></tr><tr><td>Ácido acético (glacial) 100%</td><td>Merck Millipore</td><td>1.00063</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063</td></tr><tr><td>Colágeno I</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354236</td><td>De rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&amp; productid=354236%28 Lifesciences%29#&nbsp; </td></tr><tr><td>Pancreatina de páncreas porcino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3292</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>35 mm Placas de cultivo de tejidos, poliestireno, estéril</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630</td></tr><tr><td>etanol absoluto AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. reactivo analítico</td><td>VWR Chemicals 20821296</td><td></td><td>https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP</td></tr><tr><td>vimentina monoclonal antihumana de conejo (D21H3)&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>#5741</td><td>Utilice 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 </td></tr><tr><td>Citoqueratina panhumana anti-ratón monoclonal &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2562</td><td>Uso 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&amp; region=BE</td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído, 4% en PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ</td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo Alexa Fluor 488</td><td>Termo Científico</td><td>A-11034</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&amp; resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=anticuerpo& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;; genérico6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;; conjugados:^\%22Alexa%20Fluor& reg;%20488\%22$;;</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11032</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&amp; resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=anticuerpo& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2: \%22Capra%20hircus\%22;; generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;</td></tr><tr><td>Medio de montaje VECTASHIELD con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html DPBS, con https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133</td><td>Gibco</td><td>14040174</td><td></td> de calcio y magnesio</tr></tbody></table>

aislamiento de ratón endometrial epiteliales y células del estroma de<em&gt; in vitro</em&gt; decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization es un proceso de diferenciación de progesterona dependiente de las células del estroma endometrial y es un requisito previo para el éxito de la implantación del embrión. Aunque se han hecho muchos esfuerzos para revelar los mecanismos subyacentes de decidualization, la señalización exacta entre las células epiteliales que están en contacto con el embrión y las células del estroma subyacente sigue siendo poco conocida. Por lo tanto, el estudio de decidualization de una manera que toma tanto el epitelio y las células del estroma en cuenta podría mejorar nuestro conocimiento sobre los detalles moleculares de decidualization. Para este propósito, en modelos in vivo de decidualization artificial son fisiológicamente más relevantes; Sin embargo, la manipulación de la comunicación intercelular es limitado. Actualmente, en cultivos in vitro de células del estroma endometrial se utilizan para investigar la modulación de decidualization por varias moléculas de señalización. Convencionalmente, las células estromales humanas o de ratón endometriales sonusado. Sin embargo, la disponibilidad de muestras humanas se limita, con frecuencia. Además, el uso de tejidos murinos se acompaña con variedad en el método de cultivo. Este estudio presenta un método validado y estandarizado para obtener pura de la célula epitelial endometrial (CEE) y las culturas del estroma celular (CES) que utilizan ratones intactos adultos tratados con estrógenos durante tres días consecutivos. El protocolo se ha optimizado para mejorar el rendimiento, la viabilidad y la pureza de las células y se amplió con el fin de estudiar decidualization en un cocultivo de CEE y ESC. Este modelo puede ser adecuado para explotar la importancia de ambos tipos de células en decidualization y evaluar la contribución de las moléculas de señalización importantes secretadas por la CEE o ESC durante la comunicación intercelular.

Descripción general de Protocolo La figura 1A ilustra una visión general del protocolo. Una inyección diaria de E2 (100 ng) durante tres días consecutivos se utiliza para sincronizar los animales y estandarizar la fase del ciclo estral. El ciclo estral se puede evaluar mediante lavados vaginales y se divide en el proestro, estro, diestro, y la fase metaestro. La fase del ciclo puede ser designado de acuerdo con la proporción de células descamadas en el lavado, que están sometidos a cambios hormonales. El aumento de los niveles de estrógeno hará que los animales evolucionan a la fase de estro. Esta fase puede ser fácilmente detectado por la presencia de células epiteliales cornificadas exclusivamente y la ausencia de leucocitos (Figura 1B). El día 4, úteros de los animales que se encuentran en fase de estro se recogen y MEEC y MESC están aislados (Figura 1C). c decidualizationun ser inducida mediante la adición de AMPc 0,5 mM y 1 M MPA al medio FBS 2% durante un período de incubación de 5 d. Control de calidad de MEEC y MESC culturas La pureza de los cultivos de células primarias se puede evaluar por la diferencia de vimentina y citoqueratina expresión. La vimentina es un filamento intermedio que se expresa en las células mesenquimales, por lo tanto, en las células del estroma endometrial. La citoqueratina es un filamento intermedio que se encuentra en el citoesqueleto de tejido epitelial. La figura 2A muestra el nivel de expresión de ARNm de vimentina y citoqueratina en MEEC y MESC evaluó mediante QRT-PCR. vimentina niveles son altos en MESC y baja en MEEC (2,2 veces más alta, p &lt;0,001), mientras que los niveles de citoqueratina son altos en MEEC y baja en MESC (36x más alta, p &lt;0,001). Un vimentina / doble tinción de citoqueratina se realizó e indicó que las células estromales expresan vimentina, mientras que Epitcélulas helial expresan citoqueratina (Figura 2B, C). La ausencia de anticuerpo primario se utilizó como control negativo para la inmunotinción (Figura 2D, E). Estos inmunohistoquímico coloraciones muestran que tanto los cultivos de células de endometrio (MEEC y MESC) tienen una pureza de hasta el 90%. Decidualization en MEEC / cocultivos MESC Después del aislamiento, las células endometriales estromales de ratón y se sembraron en un sistema de co-cultivo para imitar el entorno de endometrio. Las células se cultivaron hasta que las células epiteliales forman una monocapa en el inserto de cultivo celular (valores de TEER de 800 - 1.000 / pocillo), y las células del estroma llegado a un estado sub-confluente. Decidualization se indujo en las células del estroma con la aplicación de cAMP 0,5 mM y 1 M MPA. Después de cinco días de incubación, los niveles de mRNA de prolactina se evaluaron en las células del estroma de QRT-PCR como una indicación para DECIDualization (Figura 3A). Los niveles de prolactina fueron altamente expresado en células sometidas a las hormonas y no detectables en las células incubadas con el medio de control (p &lt;0,01). Dado que las células epiteliales son difíciles de visualizar el interior de los insertos de cultivo celular, un ensayo de viabilidad se realizó inmediatamente después del período de incubación de cinco días (Figura 3B). Se añadió una mezcla de medio de crecimiento normal y un reactivo de viabilidad a los pocillos y se incubó durante un período de un mínimo de 8 a 12 h. El cambio de color de azul a rosa brillante indicó la presencia de células epiteliales viables. Tenga en cuenta que el cambio de color sólo se producirá cuando las células viables están presentes. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" /> Figura 1: Descripción General del Protocolo. (A) Esquema de la protocolo de aislamiento a partir de tresdías consecutivos de inyecciones de estrógeno. El día 3, los preparativos necesarios deben estar preparados. En el día 4, se evalúa fase de estro (indicado por la estrella) mediante la realización de un lavado vaginal. MESC y MEEC se aísla a través de diferentes fases de digestión. En el día 6, o cuando las células son confluentes, decidualization puede ser inducida en el sistema de co-cultivo mediante la adición de cAMP y MPA para el medio y un periodo de incubación de cinco días (días 6-11). (B) imagen representativa de la fase de estro se caracteriza por la presencia de células epiteliales cornificadas en el lavado vaginal (magnificación 10X). (C) imagen representativa de MESC y MEEC (ampliación 20X, barra de escala: 100 micras). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2: La inmunotinción y RT-PCR cuantitativa para vimentina y citoqueratina en MEEC y MESC. (A) los niveles de ARN mensajero de vimentina y citoqueratina expresión para indicar la pureza de los cultivos. los niveles de ARN se cuantificaron relativamente a la media geométrica de los genes de limpieza ACTB y TBP. Los datos se muestran como la media ± SEM. Vimentina / doble tinción de citoqueratina en cultivos de MESC (B) y culturas MEEC (C). Insertar de la izquierda muestra una vista magnificación 63X. Control negativo con el anticuerpo primario omitido para MESC (D) y MEEC (E) (barra de escala: 50 micras). ***: P &lt;0,001 con ANOVA de dos vías con la corrección de Bonferroni para múltiples pruebas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3: Validación de decidualization a través de RT-PCR. Niveles (A) mRNA expresión de prolactina en las células del estroma para evaluar decidualization. los niveles de ARN se cuantificaron relativamente a la media geométrica de los genes de limpieza PGK1 y TBP. El factor de cambio en las células cultivadas en el control o medio decidual se muestra como media ± SEM. (B) imágenes ilustrativas de las células del estroma antes (arriba) y después (abajo) de estímulo decidualization. El inserto de la derecha ilustra una ampliación de una célula estromal decidualized. Decidualization se caracteriza por la presencia de células multinucleadas, indicado por flechas negras. (C) Imágenes representativas de la evaluación de la viabilidad de las células epiteliales en el inserto después del ensayo. Fotos fueron tomadas inmediatamente después de la administración del reactivo de viabilidad (Prestoblue) (0 h) y el fespués de la mañana (ON). **: P &lt;0,01 con la prueba de Mann-Whitney. ON: durante la noche. Barra de escala: 100 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este estudio presenta un método estandarizado y validado para el aislamiento y cultivo de ratón primario del estroma endometrial y células epiteliales, que se puede utilizar en un sistema de cocultivo para estudiar en decidualization vitro.

Aislamiento de ratón endometrial epiteliales y células del estroma de<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Los objetivos generales de este procedimiento son aislar y cultivar células primarias murinas endometriales, estromales y epiteliales para su co-cultivo con el fin de estudiar la decidualización in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina reproductiva, como cuál es la señalización paracrina entre las células epiteliales y estromales durante procesos importantes como la decidualización y la invasión de los trofoblastos, y cómo se regula esta vía de señalización. Estas técnicas pueden utilizarse para estudiar el proceso de decidualización en un sistema de co-cultivo epitelial y estromal.Mediante el uso de este sistema, se puede evaluar si las moléculas de señalización secretadas por una de las dos células pueden afectar este proceso. Antes de extraer el útero, realice un examen de frotis vaginal para verificar las fases del ciclo de los animales. Seleccione únicamente ratones en fase de estrus.Se caracteriza por la presencia de células epiteliales corneales en el lavado vaginal. A continuación, use pinzas y tijeras para abrir el abdomen del primer animal en estro y desplace los intestinos hacia un lado para visualizar ambos cuernos uterinos. Sujete un cuerno en su extremo más distal, debajo de la trompa de Falopio, y seccione el tejido uterino de la trompa de Falopio usando pinzas de disección y pinzas Dumont número cinco para eliminar los tejidos adiposo y conectivo.Luego, retire el cuerno en el extremo distal, por encima del cuerpo uterino. Después de retirar los cuernos uterinos, colóquelos en una placa de Petri de 35 milímetros con tres mililitros de HBSS. Cuando se hayan recolectado todos los cuernos uterinos, transfiera la placa bajo un microscopio estereoscópico y use pinzas para eliminar cualquier tejido adiposo y conectivo residual.Luego, utilizando pinzas Dumont número cinco, pinzas de disección y tijeras pequeñas de resorte, abra longitudinalmente los cuernos uterinos para exponer sus lúmenes y enjuague los tejidos en una nueva placa de Petri que contenga HBSS fresco. Ahora, transfiera todos los cuernos a un tubo de 15 mililitros que contenga pancreatina y tripsina. Incube los tejidos horizontalmente durante 60 minutos a cuatro grados centígrados y 50 rpm en un agitador orbital.Al finalizar la hora, transfiera el tubo al banco para un periodo de incubación horizontal de 45 minutos sin agitación, seguido por una incubación horizontal de 15 minutos sin agitación en un baño de agua a 37 grados celsius. Al finalizar la incubación en el baño de agua, vierta cuidadosamente el sobrenadante y transfiera los úteros a una placa de Petri que contenga medio frío para células epiteliales endometriales de ratón durante cinco minutos, con el fin de inactivar la actividad de la tripsina. A continuación, transfiera los tejidos a un tubo de 15 mililitros que contenga tres mililitros de HBSS frío, y vortexee los tejidos durante 10 segundos para liberar las láminas epiteliales.Luego, enjuague los úteros en una nueva placa de Petri que contenga tres mililitros de HBSS fresco, y recoja otras dos suspensiones de láminas epiteliales en dos nuevos tubos de 15 mililitros, tal como se acaba de demostrar. Después del tercer vortex del tejido, transfiera los úteros a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga la mezcla de digestión de células estromales endometriales de ratón para una incubación de 30 minutos a 37 grados celsius y 200 rpm. Recupere las láminas epiteliales pipeteando suavemente las tres suspensiones celulares a través de una malla de nylon de 100 micrones para eliminar los restos de tejido, seguido de la centrifugación de la suspensión celular resultante.Re-suspenda el precipitado en 12 mililitros de medio para células epiteliales endometriales de ratón con mezcla completa, luego deje reposar la solución durante cinco minutos para separar por gravedad las células estromales endometriales de ratón restantes. Al final de la sedimentación, use una pipeta de cinco mililitros para retirar cuidadosamente los dos mililitros superiores del sobrenadante y centrifugue las células recolectadas. A continuación, re-suspenda el precipitado epitelial de ratón en medio epitelial mediante pipeteo suave.Y siembre las células en cubreobjetos recubiertos con colágeno a la densidad adecuada para el análisis posterior planeado. Después del aislamiento de las células epiteliales, continúe con las células estromales y retire el tubo de digestión de células estromales de ratón con los úteros del incubador. Después de la incubación de 30 minutos, como se acaba de demostrar, agite suavemente el tubo a mano durante 10 segundos y transfiera los úteros a una placa de Petri que contenga tres mililitros de HBSS a cuatro grados Celsius.Lave bien los tejidos, luego agregue tres mililitros de medio para células estromales al tubo de digestión para inactivar la actividad de la tripsina y transfiera los úteros a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga tres mililitros de medio fresco para células estromales endometriales de ratón. Agite suavemente el tubo con el tejido durante 10 segundos. A continuación, transfiera los úteros a una placa con HBSS frío, seguido de su transferencia a un nuevo tubo de 15 mililitros con medio para células estromales.Después de un tercer lavado y traslado del tejido, incubar los tejidos uterinos en una mezcla fresca de digestión de células estromales endometriales de ratón durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Al final de la digestión, pasar las suspensiones celulares del tubo uno al tres y del tubo de tripsina a través de una malla de nailon de 40 micrones y lavar la malla con cinco mililitros adicionales de medio para células estromales endometriales de ratón. A continuación, recoger las células mediante centrifugación.Y resuspenda el sedimento en medio fresco para células estromáticas endometriales de ratón para su siembra en cubreobjetos recubiertos con polilisina a la densidad adecuada para el análisis posterior planeado. La pureza de los cultivos celulares primarios puede evaluarse mediante las diferencias en la expresión de vimentina y citoqueratina, ya que los niveles de vimentina son altos en las células estromáticas endometriales de ratón y bajos en las células epiteliales endometriales de ratón, mientras que los niveles de citoqueratina son altos en las células epiteliales endometriales de ratón y bajos en las células estromáticas endometriales de ratón.La doble tinción de mentina/citoqueratina ilustra además la expresión de la mentina por las células estromales, así como la expresión exclusiva de citoqueratina por las células epiteliales. La inducción de decidualización en cultivos de células estromales mediante la aplicación de adenosina monofosfato cíclico y MPA revela que los niveles de ARNm de prolactina aumentan drásticamente tras cinco días de tratamiento en comparación con los cultivos de células estromales control. Dado que las células epiteliales son difíciles de visualizar en insertos laterales de cultivo celular, se podría realizar un ensayo de viabilidad inmediatamente después de una simulación de decidualización de cinco días, en el que un cambio de color de azul a rosa brillante indicaría la presencia de células epiteliales viables.Tras aplicar esta técnica, se pueden realizar otros métodos, como ensayos de adhesión de blastocistos, con el fin de evaluar si los factores secretados por las células epiteliales en presencia de un blastocisto pueden inducir la decidualización de las células estromales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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