Name: Sistemas de ingeniería de tejidos en 3D para enfoques regenerativos, descubrimiento de fármacos y detección de toxicidad - ANUNCIO (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Descubre cómo los sistemas de ingeniería de tejidos en 3D superan las limitaciones del cultivo celular 2D tradicional. Estos modelos mejoran la relevancia fisiológica para aplicaciones regenerativas y descubrimiento de fármacos.

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Sistemas de cultivo 3D
A. 3D Cultivos que utilizan hidrogeles y andamios
Los hidrogeles están formados por redes de cadenas poliméricas reticuladas o moléculas complejas de proteínas o polisacáridos de origen natural o sintético. Debido a su importante contenido de agua y a su gama de propiedades mecánicas ajustables, los hidrogeles poseen características biofísicas similares a las del tejido natural y sirven como matrices muy eficaces para el cultivo de células en 3D. Los hidrogeles se pueden utilizar como matrices 3D independientes, como recubrimiento o como método de encapsulación de células para combinarlas con otras tecnologías, como andamios sólidos, soportes permeables, microarrays celulares, impresión 3D o dispositivos de microfluídica. La morfología, el crecimiento y la funcionalidad de las células dentro del hidrogel dependen de la presentación de señales biofísicas y bioquímicas, así como de las propiedades físicas como la permeabilidad y la rigidez de la matriz.
Hidrogeles Naturales y Matrices Extracelulares (ECMs)
Los hidrogeles de origen natural para el cultivo celular suelen estar formados por proteínas, polisacáridos y componentes de la MEC como colágeno, laminina, fibrina, ácido hialurónico, quitosano o Matrigelä (un extracto de membrana basal reconstituida de tumores de ratón Engelbreth-Holm-Swarm que contiene una mezcla de laminina, colágeno IV, proteoglicano sulfato de heparina y nidogeno/entactina19, Figura 1). Los geles derivados de fuentes naturales son inherentemente biocompatibles y bioactivos20. También promueven muchas funciones celulares debido a la presencia de diversos factores endógenos, que pueden ser ventajosos para apoyar la viabilidad, la proliferación, la función y el desarrollo de muchos tipos de células21.
Sin embargo, los hidrogeles naturales presentan algunas desventajas, incluyendo su aislamiento de fuentes de origen animal, y la variabilidad inherente de lote a lote en la composición. Además, contienen componentes bioactivos endógenos, como factores de crecimiento, que pueden ser ventajosos para crear algunos modelos 3D, pero en otros casos, pueden confundir el comportamiento o la respuesta celular específica que se está investigando. Por ejemplo, Matrigel activa vías que controlan la angiogénesis22,23, la motilidad de las células cancerosas24 y la sensibilidad a los fármacos25, mientras que el colágeno tipo 1 altera la producción de metaloproteinasas de la matriz (MMP), enzimas que degradan los componentes de la MEC y permiten la invasión de las células tumorales26, la sensibilidad celular a los fármacos anticancerígenos27, la proliferación celular y la migración28,29.
Para eludir algunos de los problemas asociados con los biomateriales de origen animal, se han desarrollado matrices en organismos que están libres de animales, o derivados de la tecnología de ácidos nucleicos recombinantes. El ácido hialurónico (hialurónico o HA) es una matriz de origen biológico a base de polisacáridos cada vez más popular30-32. La mayoría de los AH de grado comercial son de origen bacteriano y se caracterizan por su alta pureza y calidad homogénea. Estos geles pueden modificarse mediante la adición de componentes de ECM para mejorar la adhesión celular y las propiedades de crecimiento.
Hidrogeles Sintéticos y Matrices Extracelulares
Los hidrogeles sintéticos son una opción para aplicaciones de cultivo celular en 3D cuando las matrices biológicas de origen natural no son adecuadas. Los hidrogeles sintéticos están formados por moléculas puramente no naturales33 como el poli(etilenglicol) (PEG)34, el poli(alcohol vinílico)35 y el poli(2-hidroxietacrilato de etilo)36. Son biológicamente inertes, pero proporcionan soporte estructural para varios tipos de células. También son altamente reproducibles, permiten un ajuste fácil de las propiedades mecánicas y son fáciles de procesar y fabricar.
Los hidrogeles sintéticos pueden mantener la viabilidad de las células encapsuladas al tiempo que permiten la deposición de ECM a medida que el hidrogel se degrada37, demostrando así que los geles sintéticos pueden funcionar como plataformas de cultivo celular 3D en ausencia de ligandos de unión a integrinas. Como enfoque alternativo, los hidrogeles sintéticos inertes pueden modificarse con componentes biológicos adecuados. Un ejemplo de un hidrogel sintético que es sintonizable es el hidrogel de péptidos PuraMatrix™ de Corning, un oligopéptido sintético autoensamblable que exhibe fibras a escala nanométrica (Figura 2). Los hidrogeles sintéticos se pueden personalizar con secuencias peptídicas específicas para mejorar la unión celular, la localización celular y otros comportamientos38 o los hidrogeles se pueden complementar con moléculas bioactivas (por ejemplo, factores de crecimiento o proteínas ECM). Además, dispositivos como los soportes permeables (por ejemplo, insertos Transwell®) se pueden incorporar en modelos de cultivo 3D con sustratos de hidrogel para estudiar la interacción entre diferentes tipos de células, factores solubles y el entorno de cultivo.
Andamios sólidos
Los andamios sólidos para el cultivo celular en 3D se fabrican con una amplia gama de materiales, incluidos metal, cerámica, vidrio y polímeros. En particular, los polímeros son una opción común para generar andamios sólidos de diverso tamaño, estructura variable, rigidez, porosidad y permeabilidad39. Se están utilizando una multitud de técnicas de fabricación para generar andamios sólidos para el cultivo de células en 3D, incluida la litografía blanda, el electrohilado, la micromatriz, la bioimpresión y muchas otras. Los principales inconvenientes del uso de andamios sólidos son el alcance limitado de las imágenes celulares y las dificultades que se encuentran al recuperar células de la matriz.
Una consideración importante para el diseño de andamios para el cultivo celular en 3D es la escala y la topografía de las estructuras internas dentro del andamio. En el cuerpo, el ECM proporciona una intrincada infraestructura a nanoescala para apoyar a las células, y presenta un trasfondo instructivo que gobierna su comportamiento40-44. Las células que se unen a andamios que exhiben arquitecturas a microescala generalmente se aplanan y se extienden como lo harían si se cultivaran en superficies planas45. Incluso diminutas alteraciones a nivel de nanoescala en la topografía del entorno de la célula pueden provocar diversos efectos en el comportamiento de la célula46. Además de la escala y la estructura, el material utilizado para construir el andamio, las propiedades químicas de la superficie, la rigidez de la matriz, la permeabilidad y las fuerzas mecánicas pueden afectar significativamente la adhesión, el crecimiento y el comportamiento de las células.
B. Esferoides
Los esferoides celulares son modelos 3D simples que se pueden generar a partir de una amplia gama de tipos de células, que forman esferoides de forma natural debido a la tendencia de las células adherentes a agregarse. Ejemplos comunes de esferoides incluyen cuerpos embrioides, mamósferas, esferoides tumorales, hepatosferas y neurosferas. En particular, las células adherentes tienden a agregarse en circunstancias que impiden la adhesión a los sustratos de cultivo celular. Los métodos comunes sin matriz empleados para generar esferoides incluyen el uso de superficies de unión ultra bajas para el cultivo celular, o mediante el mantenimiento de las células como cultivos en suspensión en medios (por ejemplo, tecnología de gota colgante, cultivos rotativos y biorreactores). Varios tipos de células también forman esferoides en hidrogeles 3D y, hasta cierto punto, en algunos andamios sólidos, dependiendo de las propiedades estructurales y mecánicas del material. El tamaño total de los esferoides se limita a unos pocos cientos de micrómetros, más allá de los cuales, se produce necrosis dentro del núcleo de los esferoides48.
A medida que las células se agregan espontáneamente en esferoides, imitan naturalmente varios aspectos de los tejidos sólidos y están equipadas con gradientes inherentes para la difusión eficiente de oxígeno y nutrientes, así como para la eliminación de desechos metabólicos. Estos agregados celulares pueden emular el comportamiento avascular de los tumores sólidos de manera más efectiva que los entornos 2D estándar porque los esferoides, al igual que los tumores, generalmente contienen una población heterogénea de células expuestas en la superficie y profundamente enterradas, células proliferantes y no proliferantes, y células bien oxigenadas e hipóxicas49. Además, la diferenciación de las células madre pluripotentes suele implicar la formación de estructuras esféricas llamadas cuerpos embrioides, un paso importante para los estudios posteriores de diferenciación celular in vitro. Por lo tanto, los esferoides representan un modelo fisiológico 3D especialmente bueno para estudiar la tumorigénesis sólida y la diferenciación de células madre. Además, los esferoides se pueden analizar fácilmente mediante imágenes mediante microscopías de luz, fluorescencia y confocal, lo cual es una ventaja sobre los modelos de cultivo celular 3D más complejos. Además, es relativamente sencillo producir en masa esferoides 3D de tamaño uniforme, lo que los hace muy susceptibles para muchas aplicaciones de cribado in vitro de alto rendimiento (HTP) y toxicidad.
C. Organoides
Otro avance importante en la diferenciación de células madre es la formación de mini "órganos" 3D autoorganizados conocidos como organoides. Los organoides pueden recapitular detalles histológicos y proporcionar una representación funcional de múltiples tipos de células que están presentes dentro de los órganos nativos. Recientemente se han desarrollado organoides representativos de los tejidos intestinales50,51, retinales52, pancreáticos53, mamarios54, colónicos55 y cerebrales56 utilizando modelos 3D compuestos por Matrigel Matrix. La Figura 3 ilustra un esquema de las condiciones de cultivo en 3D que permitieron la expansión eficiente de progenitores pancreáticos embrionarios de ratón disociados53. Otro ejemplo se muestra en la Figura 4, donde Lancaster et al. generaron organoides cerebrales con similitud estructural con el tejido cerebral57 . Si bien el cultivo in vitro de organoides es un paso importante hacia la elucidación de los principios del desarrollo de los órganos y los mecanismos responsables de las enfermedades genéticas, la consistencia y la previsibilidad de la obtención de las mismas estructuras varía de una muestra a otra57. Al igual que los esferoides, también están limitados en tamaño por el desarrollo de núcleos necróticos, lo que limita su utilidad para enfoques regenerativos.
D. Biorreactores de perfusión
Uno de los principales desafíos de la creación de cultivos 3D in vitro son las limitadas distancias de transferencia de masa necesarias para el suministro y la eliminación de nutrientes. Los biorreactores abordan este desafío controlando el entorno fisiológico que rodea a las construcciones 3D (es decir, el suministro de nutrientes, la tensión de oxígeno, la eliminación de desechos, los insumos mecánicos, el pH y la temperatura). Por lo tanto, los biorreactores son esenciales cuando se requieren construcciones de tejidos más grandes y también para mantener los tejidos in vitro durante largos períodos de tiempo, ya que el aumento del transporte a través de la perfusión ayuda a evitar los centros necróticos. En particular, los biorreactores pueden utilizarse para mantener cultivos a largo plazo en los que se pueden controlar los cambios dinámicos58. Además, los biorreactores controlan el tamaño y la forma de los cultivos 3D, y promueven distribuciones celulares uniformes59-64. Los biorreactores vienen en muchos formatos diferentes, incluidos: biorreactores de perfusión (directa)65, biorreactores de perfusión de fibra hueca (indirectos)66, biorreactores de perfusión con estimulación mecánica67, biorreactores de recipientes de pared giratoria68, matraces giratorios69 y agitadores orbitales70.
E. Otras formas de abordar la transferencia de masa limitada
Otra solución fisiológicamente relevante para abordar la transferencia de masa limitada en construcciones de tejido grandes es recrear la vasculatura del tejido (que proporciona y elimina nutrientes in vivo) con canales vascularizables interconectados 71. Como sustituto artificial para apoyar el crecimiento celular de alta densidad, la "pseudovascularización" a través de biorreactores de membrana de fibra hueca también ha mostrado resultados prometedores 66,72-74. Las fibras huecas actúan como los vasos sanguíneos que transfieren el medio de cultivo a través de las construcciones de ingeniería tisular, mientras que la mayor parte se puede sembrar con matriz extracelular u otros materiales y células de andamio.
Las recientes mejoras en las técnicas de ingeniería a microescala, como la fabricación de dispositivos microfluídicos y microarrays, tienen el potencial de abordar los problemas de suministro de nutrientes mediante la creación de modelos a microescala. Los dispositivos microfluídicos manipulan pequeños volúmenes (10-9 a 10-6 L) para generar y controlar con precisión el flujo dinámico de fluidos y los gradientes espacio-temporales, así como para entregar nutrientes y otras señales químicas a las células de manera controlada75. Las redes microfluídicas se han incorporado directamente dentro de los hidrogeles incrustados en las células, así como en varias otras matrices, para permitir el transporte convectivo eficiente de nutrientes y otras señales solubles a través de los andamios3D 76. Los microarrays consisten en un soporte sólido en el que se pueden colocar pequeños volúmenes de diferentes biomoléculas y células en ubicaciones definidas, lo que permite la investigación multiplexada de células vivas y sus respuestas a los estímulos. El uso de estas tecnologías puede mejorar la viabilidad y las funciones de las células. Además, las tecnologías microfluídicas pueden aumentar el rendimiento y reducir significativamente el costo del cultivo debido a los requisitos de bajo volumen de reactivos.
F. Consideraciones sobre la celda
Se pueden incorporar diferentes tipos de células en modelos 3D, lo que resulta en resultados alterados. Hay tres clasificaciones principales de células que se pueden utilizar: células madre, células primarias y líneas celulares inmortalizadas. Las células madre son células indiferenciadas que pueden ser estimuladas para diferenciarse en diferentes linajes. Las células madre son una opción atractiva, ya que se autorrenuevan en cultivo y se pueden utilizar para crear modelos específicos para cada paciente. Hay muchos tipos de células madre que se definen por su etapa de desarrollo. Los diferentes tipos incluyen: células madre adultas (a menudo de médula ósea o tejido adiposo), células madre fetales, tallos de la sangre del cordón umbilical, células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas. Las células primarias, por otro lado, se obtienen directamente de un tejido específico y, por lo tanto, ya están comprometidas con un linaje específico. Tienen una vida limitada en cultura y, por lo tanto, son más limitados en número, y eventualmente sufren senescencia y dejan de proliferar. Las células inmortalizadas, por el contrario, han sido alteradas para proliferar y evadir la senescencia celular. Los sistemas de administración de genes también son una opción para modular un fenotipo específico en modelos de ingeniería tisular.
En el cuerpo, la comunicación entre los diferentes tipos de células es fundamental para mantener la homeostasis y la especificidad de los tejidos. La mejora de la diferenciación y la supervivencia se logra mediante el cocultivo de los tipos de células apropiados77-81. Además, los cocultivos conducen a un aumento de la deposición de ECM82,83, a una mejora de las mediciones de los resultados funcionales84, a una morfología adecuada83,84 y a estructuras vasculares81 que no se logran en los monocultivos. Además de imitar mejor la fisiología normal, los modelos de cocultivo en 3D han sido útiles para estudiar interacciones complejas entre las células cancerosas y otros tipos de células, dilucidando su contribución al crecimiento tumoral, la vascularización y la metástasis.
Las consideraciones celulares únicas para los órganos que interactúan con el aire han dado lugar a cultivos de múltiples tipos de células en una interfaz aire-líquido, incluyendo el pulmón85, la epidermis86, la córnea87 y los modelos de mejillas internas88.
El cultivo de células en una interfaz aire-líquido utilizando soportes permeables ha permitido el desarrollo de modelos 3Din vitropara el descubrimiento de fármacos, incluido el modelado del epitelio pulmonar. Utilizando células de donantes enfermos, estos modelos celulares se utilizan para estudiar una variedad de trastornos pulmonares.

No se declaran conflictos de intereses.

La construcción de tejidos 3D fisiológicamente relevantes es una iniciativa de investigación multifacética en la que los tejidos resultantes se pueden utilizar para muchas aplicaciones. Dado que los sistemas de cultivo celular 3D proporcionan un entorno más preciso para el crecimiento celular, la morfogénesis de los tejidos y la diferenciación de las células madre, tienen potencial para ser utilizados para modelar el desarrollo de tejidos, la progresión de la enfermedad y para la implantación in situ de grandes defectos tisulares. Los modelos de cultivo celular 3D también son adecuados para cerrar la brecha entre los modelos preclínicos 2D convencionales para la detección de fármacos y toxicidad y los estudios clínicos in vivo en humanos. Los modelos preclínicos 3D mejorados recapitularán mejor los procesos patobiológicos subyacentes a enfermedades de tejidos y órganos específicos en humanos, y también predecirán con mayor precisión las respuestas fisiológicas a los compuestos terapéuticos.
Ya se han logrado grandes avances en las últimas décadas en este campo, pero siguen existiendo muchas limitaciones prácticas antes de que los modelos de cultivo celular 3D puedan implementarse ampliamente en muchas aplicaciones. Para empezar, muchos de los modelos 3D son novedosos, y los datos generados con estos métodos deben validarse con las respuestas in vivo establecidas para la calibración. Además, el resultado de los ensayos 3D puede ser muy variable debido a la falta de protocolos estandarizados y al uso de poblaciones celulares heterogéneas y, a veces, múltiples. Por lo tanto, las técnicas de análisis de datos no destructivas (factores secretados, cambios morfológicos y/o marcadores funcionales no invasivos) son esenciales para rastrear el mismo constructo 3D sobre el cultivo. Además, algunas matrices 3D tienen una permeabilidad limitada o una dinámica de difusión deficiente y, por lo tanto, deben incorporar sistemas de perfusión para mantener la viabilidad y la función. Además, la recuperación y visualización celular puede restringirse en ciertos andamios 3D. Otra limitación importante es que muchos de los modelos de cultivo 3D no se pueden automatizar o escalar fácilmente para una detección de alto rendimiento.
Sin embargo, estas limitaciones se están superando con tecnologías emergentes y ensayos in vitro 3D más nuevos. Los modelos de cultivo celular 3D in vitro han progresado en el apoyo al crecimiento celular, la morfogénesis de tejidos, la diferenciación de células madre, el modelado de enfermedades, el descubrimiento de fármacos y las pruebas de toxicidad. También es evidente que se requieren diferentes modelos 3D con diferentes características para satisfacer las necesidades de tipos de células o aplicaciones específicas. La combinación de tecnologías más nuevas, como microarrays en un chip, microfluidos o bioimpresión, con matrices biológicamente relevantes podría ayudar a ampliar e impulsar algunos de estos complejos modelos de cultivo celular 3D a ensayos de detección de fármacos y pruebas de toxicidad altamente predictivos y relevantes, así como proporcionar nuevos sistemas para la investigación regenerativa.

El cultivo in vitro de células de mamíferos ha servido como una herramienta invaluable en biología celular durante varias décadas. Clásicamente, los cultivos monocapa de células adherentes se cultivaron en sustratos bidimensionales (2D) planos y rígidos, como el poliestireno o el vidrio. Sin embargo, muchas células, cuando se aíslan de los tejidos y se colocan sobre superficies rígidas planas de cultivo celular 2D, como el plástico de cultivo de tejidos, se vuelven progresivamente más planas, se dividen aberrantemente y pierden su fenotipodiferenciado 1,2. Si bien estos estudios de cultivos celulares bidimensionales han desempeñado un papel fundamental en el avance de nuestra comprensión de muchos procesos biológicos, no emulan las condiciones in vivo.
En el cuerpo, las células residen en una compleja matriz extracelular (ECM) que consiste en una arquitectura tridimensional (3D) que permite interacciones directas con las células vecinas y las moléculas de la matriz a través de señales bioquímicas y mecánicas. Las interacciones célula-célula y célula-ECM establecen una red de comunicación 3D que mantiene la especificidad y homeostasis del tejido3. Por lo tanto, no es sorprendente que las diferencias fundamentales en el microambiente de los sistemas de cultivo celular 2D y 3D influyan en varios comportamientos celulares, incluida la forma en que las células se adhieren, se propagan y crecen, su morfología y polaridad, expresión de genes y proteínas, viabilidad, proliferación, motilidad, diferenciación, respuesta a estímulos, metabolismo celular y función general 1,2,4-16.
El ECM 3D que rodea una célula realiza varias funciones críticas. Para empezar, proporciona una arquitectura compleja a nanoescala de proteínas estructurales como el colágeno, la laminina, la fibronectina y los glicosaminoglicanos para establecer las propiedades mecánicas inherentes al microambiente celular17,18. Las células detectan estos mecanismos a través de sus integrinas de la superficie celular y se unen a motivos de adhesión específicos presentes en las proteínas de la MEC y los glicosaminoglicanos. Además, la MEC es vital para el secuestro de biomoléculas solubles y factores de crecimiento, y la liberación de estas moléculas de señalización con control espacio-temporal para guiar procesos como la migración celular, la degradación de la matriz y la deposición17,18. Por lo tanto, para imitar realmente la ECM nativa, es necesario desarrollar modelos de cultivo en 3D que exhiban las propiedades mecánicas y químicas de la ECM, no solo en la etapa inicial de siembra de las células, sino más bien, de manera dinámica y sintonizable a medida que las células crecen y se desarrollan. Para abordar los requisitos de los diferentes tipos de células y aplicaciones en el cuerpo, se ha empleado una amplia gama de materiales y técnicas de fabricación para desarrollar microentornos 3D con diferentes características físicas, biológicas y mecánicas. Cada modelo viene con su propio conjunto de ventajas y limitaciones, y un modelo distinto no es adecuado para todas las aplicaciones.

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3D Tissue Engineered Systems for Regenerative Approaches, Drug Discovery, and Toxicity Screening - ADVERTISEMENT

El cultivo in vitro de células de mamíferos ha servido como una herramienta invaluable en biología celular durante varias décadas. Clásicamente, los cultivos monocapa de células adherentes se cultivaron en sustratos bidimensionales (2D) planos y rígidos, como el poliestireno o el vidrio. Sin embargo, muchas células, cuando se aíslan de los tejidos y se colocan sobre superficies rígidas planas de cultivo celular 2D, como el plástico de cultivo de tejidos, se vuelven progresivamente más planas, se dividen aberrantemente y pierden su fenotipodiferenciado 1,2. Si bien estos estudios de cultivos celulares bidimensionales han desempeñado un papel fundamental en el avance de nuestra comprensión de muchos procesos biológicos, no emulan las condiciones in vivo.

<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1. Las glándulas endometriales desarrolladas in vitro muestran polaridad epitelial apicobasal. Doble inmunotinción de glándulas desarrolladas in vitro cultivadas durante 8 días en medio BIE (A-E) o secciones de criostato obtenidas de endometrio de ratón (F-I). A y F: Citoqueratina (verde) y vimentina (rojo). B y G: Laminina (verde) y faloidina (rojo). C e I: GM130 (verde) y faloidina (rojo). D y H: ZO-1 (verde) y E-cadherina (rojo). E: ZO-1 (verde) y b-catenina (rojo). Barra de escala blanca = 20 mm. Medio BIE = medio basal suplementado con 5ng/mL de EGF y dilución 1:100 del suplemento ITS y 3% de Matrigel™ Matrix fresco; FEAG = factor de crecimiento epidérmico; ITS = insulina transferrina selenio (Eritja et al., 2010)89.
Figura 1 descripción - La organización, señalización y secreción de las células epiteliales glandulares se asemejan más a las propiedades observadas in vivo cuando se cultivan en un entorno 3D, en contraste con el comportamiento que ocurre en superficies 2D 10,11. En la Figura 1 se muestra un modelo 3D in vitro de glándulas endometriales. En este modelo, las células epiteliales endometriales se cultivaron en un medio que contenía Matrigel™ Matrix durante 7-8 días, seguido de una tinción por inmunofluorescencia de varios marcadores de polaridad. El análisis de la expresión de marcadores confirmó que las estructuras glandulares estaban compuestas exclusivamente por células de origen epitelial (1A y 1F). Además, los esferoides que representan glándulas endometriales mostraron una correcta polaridad apical-basolateral (1B y 1G), posicionamiento del aparato de Golgi (1C y 1I), uniones adherentes (ID e IH) y uniones estrechas (IE). 
<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2. Proliferación y diferenciación en andamio 3D. (A + B) Imagen de luz de transmisión de células en proliferación en PuraMatrix con 0,25 % de laminina (PML) y células diferenciadas en PML 0,25 % (C + D). Imagen de microscopio electrónico de barrido de células en proliferación y células diferenciadas en PML 0,25%. (B + D) Tras la inducción de la diferenciación, se observa el desarrollo de una densa red tridimensional de procesos. (E) La inmunocitoquímica para bIII-tubulina y TH de células no inducidas en PML 0.25% y (F) Células después de 7 días de diferenciación reveló una densa red de células bIII-tubulina positivas. Se encontró que las células TH+ poseen procesos, pero sin construir una red densa (Ortinau et al. 2010)90.
Figura 2 descripción - En este estudio, Ortinau y sus colegas utilizaron un hidrogel sintético, PuraMatrix™ suplementado con laminina (PML 0,25%) para la diferenciación neuronal de células progenitoras neurales humanas90. Utilizando microscopía óptica de transmisión (FIGURA 2A + B) y microscopía electrónica de barrido (FIGURA 2C + D), los investigadores demostraron que las células progenitoras neuronales pueden convertirse en una densa red de procesos neuronales (FIGURA 2B + D). Además, la inmunocitoquímica reveló que después de 7 días de diferenciación, las células precursoras neuronales comenzaron a expresar marcadores neuronales (bIII-tubulina y tirosina hidroxilasa (TH)) (FIGURA 2E + F). Estas observaciones demuestran cómo la funcionalización con factores biológicos apropiados puede convertir matrices sintéticas inertes en modelos in vitro útiles para apoyar la diferenciación de células madre y progenitoras.
<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3. Los organoides recapitulan la expansión de los progenitores y la diferenciación organizada.
(A-E) Inmunohistoquímica en secciones de organoides de 7 días que muestra que (A) todas las células (DRAQ5, núcleos rojos) son epiteliales (E-cadherina) y muchas proliferan [fosfohistona H3 (pHH3)] y (B, C) retienen los marcadores pancreáticos PDX1, SOX9 y HNF1B. (C) Las células se polarizan y forman tubos recubiertos de mucina 1. (D) La diferenciación exocrina (amilasa) se observa en la periferia. (E) La diferenciación endocrina (insulina) se detecta en el centro. La sección de B es similar a la de A, y la sección de D es similar a la de C. (F) Esquema experimental para probar la diferenciación endocrina después de un trasplante posterior de células cultivadas en un organoide en un nicho pancreático. WT, tipo salvaje. (G-J) Las células que se cultivaron primero in vitro se integran en el epitelio del huésped (blanco en G y verde en H-J). Algunos siguen siendo progenitores (G; HNF1B), algunos se vuelven acinares (H; amilasa) o ductales (I; DBA) y otros se vuelven endocrinos (glucagón o insulina). Los recuadros son aumentos de las cajas discontinuas. Barras de escala: 50 μm (Greggio et al., 2013)53.
Figura 3 descripción – La Figura 3 ilustra un esquema de las condiciones de cultivo en 3D que permitieron la expansión eficiente de progenitores pancreáticos embrionarios de ratón disociados53. Al manipular la composición del medio, los investigadores generaron esferas huecas, que están compuestas principalmente por progenitores pancreáticos, u organoides complejos que experimentan espontáneamente la morfogénesis y diferenciación pancreática.
<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4 | Descripción del sistema de cultivo de organoides cerebrales. un Esquema del sistema de cultivo utilizado para generar organoides cerebrales. Se muestran imágenes de ejemplo de cada etapa. bFGF: factor básico de crecimiento de fibroblastos; hES: célula madre embrionaria humana; hPSCs, células madre pluripotentes humanas; AR: ácido retinoico. B, Los tejidos neuroepiteliales generados con este enfoque (izquierda) exhibieron grandes cavidades llenas de líquido y una localización apical típica de la N-cadherina neural (flecha). Estos tejidos eran más grandes y más continuos que los tejidos cultivados en suspensión estacionaria sin Matrigel (derecha). C, El seccionamiento y la inmunohistoquímica revelaron una morfología compleja con regiones heterogéneas que contenían progenitores neuronales (SOX2, rojo) y neuronas (TUJ1, verde) (flecha). D, Imágenes de campo claro de baja ampliación que revelan cavidades llenas de líquido que recuerdan a los ventrículos (flecha blanca) y al tejido de la retina, como lo indica el epitelio pigmentado de la retina (flecha negra). Barras de escala, 200 mm (Lancaster et al., 2013)57.
Figura 4 descripción – Lancaster et al. generaron organoides cerebrales con notable similitud estructural con el tejido cerebral57. Estos organoides cerebrales crecieron más que los esferoides celulares típicos y sobrevivieron durante semanas o meses.

Sistemas de ingeniería de tejidos en 3D para enfoques regenerativos, descubrimiento de fármacos y detección de toxicidad - ANUNCIO

In vitro mammalian cell culture has served as an invaluable tool in cell biology for several decades. Classically, monolayer cultures of adherent cells ...

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