Aislamiento de células progenitoras endoteliales de voluntarios sanos y su potencial migratorio influenciado por las muestras de suero después de cirugía cardiaca

El objetivo general de este procedimiento de aislamiento celular y protocolo de migración es mostrar una forma fiable de aislar las células progenitoras endoteliales y su potencial migratorio hacia muestras de suero de pacientes quirúrgicos cardíacos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la regeneración del revestimiento endotelial y los vasos sanguíneos, que es necesaria después de una cirugía cardíaca debido a lesiones relacionadas con la isquemia y la reperfusión. La principal ventaja de esta técnica es la forma relativamente sencilla de aislar las células progenitoras, incluyendo el preaislamiento de las células CD-34 positivas.

Además de las muertes, las complicaciones mayores de la cirugía cardíaca siguen siendo demasiado comunes. Subrayando la necesidad de identificar el riesgo de corbata y los mecanismos de protección durante la cirugía cardíaca. Las células progenitoras endoteliales están implicadas de forma crucial en la neovascularización de los tejidos isquémicos y se sabe que proporcionan propiedades cardioprotectoras.

Para comenzar el experimento, mezcle sangre, uno a uno, con PBS sin calcio y sin magnesio. Agregue 15 mililitros de solución de gradiente de densidad a un tubo de 50 mililitros. Y coloque lentamente la sangre diluida sobre la solución de gradiente de densidad.

A continuación, centrifuga las muestras. Con una pipeta de plástico estéril, recoja con cuidado la capa de capa leucitaria de cada tubo y colóquela en otro tubo evitando la solución de gradiente de densidad. Diluir la célula mononuclear de sangre periférica, o fracción PBMC, con al menos tres volúmenes de PBS y mezclar la solución mediante pipeteo.

Centrifugar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos a 200 veces G. Luego, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender la pastilla celular en cinco mililitros de medio de crecimiento de células endoteliales, MV-2. Después de resuspender las células, agregue 100 microlitros de anticuerpo CD-34 humano por capa de leucitología usada y rote las células. Agregue 50 microlitros de perlas magnéticas recubiertas de Dextrano por cada capa de leucocitismo usada y gire las celdas.

Después de la incubación, transfiera la suspensión a tubos de fax con un máximo de tres mililitros en cada tubo. A continuación, inserte los tubos de fax en los imanes y espere cinco minutos. Deseche el sobrenadante sin sacar los tubos de fax del imán.

Luego, fuera de los imanes, vuelva a suspender las celdas en cada tubo de fax con tres mililitros de medio MV-2. Transfiera la suspensión de la celda a matraces T-75 prerrevestidos. Agregue 17 mililitros de medio MV-2 a cada matraz.

Para preparar el ensayo de migración, utilice una pipeta para eliminar el medio de las células progenitoras endoteliales o de las EPCs, en el matraz T-75. Lave las células con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS, y agite cuidadosamente el matraz. A continuación, retire el PBS y agregue cinco mililitros de solución comercial de desprendimiento de celdas.

Luego, espere hasta que las células se desprendan bajo un microscopio óptico. Acelere el desprendimiento golpeando con cuidado el fondo del matraz. Cuando las celdas estén separadas, agregue rápidamente cinco mililitros de medio completo MV-2 y transfiera la suspensión celular a otro tubo.

Centrifugar las células a 2.000 x G durante cinco minutos. Después de peletizar las células, vuelva a suspenderlas en cinco a diez mililitros de PBS. Y centrífugalos de nuevo.

Vuelva a suspender las células en cinco a diez mililitros de PBS y siga con la centrifugación. Vuelva a suspender el pellet de la célula en el medio hambriento MV-2. A continuación, diluya la muestra de suero de uno a cinco en medio hambriento de MV-2.

Prepare la placa de migración añadiendo 235 microlitros de la muestra de suero en la cámara inferior. Agregue el inserto poco antes de agregar la solución celular. Luego, agregue 75 microlitros de la solución celular en la cámara superior.

Permitir la migración de los EPC. Retire la cámara superior que contiene todas las células no migradas. Agregue 75 microlitros de solución de paraformaldehído al 3,6 por ciento, incluido el colorante Hoechst, diluido de uno a 1.000.

Centrifugar la placa brevemente para que todas las células estén en el mismo plano focal a 2.000 x G durante uno o dos minutos. Para evitar artefactos de autofluorescencia sérica, cuantifique las células migradas tomando cinco imágenes por pocillo con un aumento de 100x bajo un microscopio. Por último, cuente las celdas migradas utilizando el software semiautomatizado.

El análisis por fax de las EPC verifica la absorción de acLDL, así como la expresión de CD-31 en la superficie de la población de células aisladas. El aislamiento del análisis de acLDL y CD-31 revela una distribución homogénea de cada marcador. Elyso identificar la influencia de la cirugía cardíaca después de una lesión de reperfusión miocárdica en las concentraciones de niveles séricos circulantes de MIF, CXCL12, CXCL8 y VEGF.

Se extrajeron muestras de suero antes y durante el operatorio. Los niveles séricos de MIF, CXCL12 y CXCL8 mostraron un aumento intraoperatorio significativo en comparación con los valores basales. Por el contrario, las concentraciones de VEGF no mostraron cambios significativos.

Se realizó un ensayo de migración ex vivo, utilizando muestras de suero extraídas antes y durante la cirugía, utilizando EPC aisladas de voluntarios sanos, y reveló un aumento significativo de la tasa de migración hacia las muestras tomadas intraoperatoriamente. Siguiendo esta técnica, las células mononucleares de sangre periférica se pueden aislar fácilmente para responder a preguntas adicionales relacionadas con la inflamación.