Un sensor basado en aptámero para no quelado de gadolinio (III)

El objetivo general de este ensayo basado en fluorescencia es detectar la presencia de iones de gadolinio no quelados tóxicos en soluciones acuosas que contienen agentes de contraste para imágenes por resonancia magnética. Este método puede ayudar a facilitar los agentes de contraste de resonancia magnética a base de gadolinio al proporcionar un medio para garantizar una alta paridad de los agentes sintetizados. La principal ventaja de esta técnica es que es capaz de detectar la concentración submicromolar de gadolinio tóxico no quelado con una selectividad relativamente alta sobre otros cationes metálicos biológicos.

Para comenzar este procedimiento, prepare el tampón de ensayo como se describe en el protocolo de texto. Usando hidróxido de sodio y ácido clorhídrico, ajuste el pH a 7.4. A continuación, filtre el tampón a través de un filtro estéril desechable con una membrana de PES de 0,2 micras.

A continuación, transfiera 497 microlitros del tampón de ensayo a un tubo de microcentrífuga nuevo. Agregue un microlitro de solución madre de aptámero de gadolinio preparada y dos microlitros de solución madre QS preparada. Transfiera 50 microlitros de esta solución de sensor de gadolinio 2X a cada uno de los nueve tubos de PCR.

Después de esto, coloque los tubos en un termociclador. Configure el termociclador para calentar las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos, luego enfríe lentamente las soluciones a 25 grados centígrados durante 15 minutos. Es importante recordar calentar las soluciones de sensor de gadolinio 2X a 95 grados, seguido de un enfriamiento lento a temperatura ambiente antes de agregar la solución de iones de gadolinio.

Para comenzar, disuelva el tricloruro de gadolinio sólido en un tampón de ensayo para crear una solución madre de tres gadolinio de la concentración deseada. Usando dilución en serie, prepare seis soluciones de gadolinio de 100 microlitros como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, disuelva el agente de contraste que se va a probar en el tampón de ensayo.

Utilice la dilución en serie para preparar tres concentraciones diferentes. A continuación, retire los tubos de PCR que contienen la solución del sensor de gadolinio 2X del termociclador. Transfiera 50 microlitros de cada solución de gadolinio tres a tubos de PCR separados.

Pipetea cada solución hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar. A continuación, transfiera 50 microlitros de cada solución de agente de contraste por separado a los tubos de PCR restantes. Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.

Incuba las nueve soluciones durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de esto, transfiera 45 microlitros de cada solución a una placa de 384 pocillos por duplicados. A continuación, registre y analice los datos de fluorescencia como se describe en el protocolo de texto.

En este estudio, el ion gadolinio trivalente no quelado se detecta en solución acuosa utilizando un método basado en fluorescencia. El sensor fluorescente se desarrolla conectando un fluoróforo al aptámero. A continuación, el sensor se hibrida con una hebra de enfriamiento, que se marca con una molécula de extinción oscura.

La adición de gadolinio tres desplaza la hebra de enfriamiento del aptámero, lo que provoca un aumento en la emisión de fluorescencia. Las curvas de calibración se obtienen utilizando 100 nanomolares de gadolinio aptámero y 200 nanomolares QS y se trazan mediante fluorescencia bruta o cambio de pliegue de fluorescencia. Ambas curvas muestran un rango lineal para el gadolinio a tres concentraciones por debajo de un micromolar y saturación de la señal a concentraciones superiores a tres micromolares.

A continuación, se analizan dos lotes diferentes de ácido gadotórico para obtener concentraciones que oscilan entre cero milimolares y 20 milimolares. Si bien la emisión de fluorescencia de la muestra de alta pureza no aumenta notablemente en este rango, se observa un cambio significativo en la muestra que contiene gadolinio tres no quelado a concentraciones tan bajas como cinco milimolares. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que no haya burbujas de aire en los pocillos de la microplaca, ya que esto alterará la lectura fluorescente.

Con este procedimiento, podemos ser capaces de detectar incluso pequeñas cantidades de iones de gadolinio calculados en soluciones que contienen agentes de contraste. Este será un buen método para determinar la pureza de los agentes. Trabajar con productos químicos puede ser peligroso y es importante tomar precauciones, como usar equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.