Name: Un sensor basado en aptámero para no quelado de gadolinio (III) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Aprende a detectar iones de gadolinio no quelados tóxicos mediante un ensayo basado en fluorescencia con aptámeros de polidesoxinucleótidos. Este método ofrece alta sensibilidad y selectividad para garantizar la seguridad de agentes de contraste de MRI.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Milan N Stojanovic de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY por su valiosa contribución científica. Este trabajo cuenta con el apoyo financiero de la Universidad Estatal de California en el Este de la Bahía (CSUEB) y la Beca de Apoyo a la Facultad de CSUEB para Investigadores Individuales. O.E., T.C. y A.L. contaron con el apoyo de la beca del Centro de Investigación Estudiantil (CSR) de CSUEB.

NOTA: agua de calidad de biología molecular se utiliza en todas las preparaciones de tampón y de solución. Todos los tubos de microcentrífuga desechables (y PCR) y puntas de pipeta son DNasa y RNasa libre. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) para todos los productos químicos antes de su uso. Se recomienda el uso de equipo de protección personal (EPP) apropiado. 1. Preparación de los aptámeros de archivo Soluciones <ol><li> Compra 2 hebras de polidesoxinucleótido comercialmente. Ordenar ambas cadenas con la purificación mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). MODALIDAD 1 (Gd-aptámero): 5 &#39;- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3&#39; Capítulo 2 (QS): 5&#39;-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 &#39; </li><li> Disolver cada hebra en agua para hacer 100 mM de soluciones madre individuales del Gd-aptámero y el QS. </li><li> Almacenar estas soluciones a -20 ° C. Las soluciones son estables hasta la fecha, durante 3 años. </li><li> Para minimizar Freezciclos de e-descongelación, almacenar las soluciones madre en 10 alícuotas. </li></ol> 2. Preparación de la 2x Gd-sensor Solution <ol><li> Preparar el tampón de ensayo (HEPES 20 mM, 2 mM MgCl2, NaCl 150 mM, KCl 5 mM). Ajustar el pH a ~ 7,4 con NaOH y HCl, y filtrar a través de filtros estériles desechables botella superiores a los 0,2 micras membrana de PES. Almacenar en frascos estériles. Si se filtra y se almacena adecuadamente (a temperatura ambiente), el tampón es estable hasta el momento, por 2 años. </li><li> Diluir 1 l de la solución de Gd-aptámero de la (del paso 1.2) y 2 l de la solución madre de QS (de la etapa 1.2) en 497 l de tampón de ensayo. Mezclar bien usando un vórtice. Sus concentraciones en la solución de Gd-sensor 2x son 200 nM y 400 nM, respectivamente. Nota: El volumen de la solución de Gd-sensor 2x preparado en este paso es de 500 l, que es suficiente para poner a prueba 6 - 7 concentraciones variables de Gd 3+ para la curva de calibración y las soluciones de agentes de contraste(paso 3). Cada muestra dará a pocillos duplicados de una placa de 384 pocillos. <ol><li> Ajustar el volumen de la solución de Gd-sensor 2x de acuerdo con el número de soluciones de Gd 3+ que tiene que ser probado. </li></ol></li><li> Transferir la solución de Gd-sensor de 2x en 9 tubos de PCR, con 50 l en cada tubo. Colocar los tubos en un termociclador. </li><li> Ajuste el programa en el ciclador térmico para calentar la solución en los tubos a 95 ° C, mantener durante 5 min, y luego enfriar lentamente las soluciones a 25 ° C durante ~ 15 min (a razón de ~ 0,05-0,1 ° C / s). El ciclo de calentamiento y enfriamiento es asegurar la hibridación óptima entre el Di-s-aptámero y el QS. resultados de la hibridación parciales en temple incompleta y un fondo más alta de fluorescencia del sensor. Si un termociclador no está disponible, llevar a cabo este procedimiento utilizando un baño de agua caliente en su lugar. </li><li> Una vez enfriado a 25 ° C, utilizar inmediatamente la solución, o mantener en el termociclador (hasta alrededor de 2 h) hasta que esté listo para serusado. Cuando se utiliza un baño de agua para el calentamiento, dejar los tubos en el baño como el agua se enfría lentamente a temperatura ambiente. </li></ol> 3. La construcción de la curva de calibración de fluorescencia y detectar la presencia de no quelado Gd 3+ en una solución de agente de contraste Gd <ol><li> Disolver GdCl 3 sólido en el tampón de ensayo (el mismo tampón que en el paso 2.1). </li><li> A través de dilución en serie, preparar 100 l cada uno de 6 diferentes soluciones Gd 3+ en tubos de microcentrífuga a doble de las concentraciones finales deseadas para la curva de calibración (2x soluciones). <ol><li> Por ejemplo, para construir una calibración para 0 (sólo tampón sin GdCl 3), 50, 100, 200, 400, y 800 nM de Gd 3+, preparar soluciones que contienen 0, 100, 200, 400, 800, y 1600 nM del ión. Asegúrese de que siempre incluyen el &quot;blanco&quot; con 0 nM Gd 3 + como control negativo. </li></ol></li><li> Se disuelve el agente de contraste para ser pruebaed en el tampón de ensayo. Preparar 2 o 3 concentraciones diferentes de las soluciones de agentes de contraste a través de dilución en serie. NOTA: Prueba de 3 concentraciones diferentes de la solución de agente de contraste se recomienda. Esto es para asegurar que estas concentraciones están dentro del rango lineal. Si las muestras analizadas no muestran una relación lineal, reducen las concentraciones del agente de contraste utilizado. </li><li> Tomar los tubos de PCR que contienen la solución 2x ​​Di-s-sensor desde el paso 2.5 del termociclador. </li><li> Añadir 50 l de cada solución de Gd 3+ desde el paso 3.2 en 6 de los 9 tubos de PCR que contienen la solución 2x Di-s-sensor. Mezclar pipeteando arriba y abajo. Cada tubo de PCR contiene ahora la concentración deseada de Gd 3+ a ensayar, 100 nM Gd-aptámero, y 200 QS nm. </li><li> Para los tubos de PCR restantes que contienen la solución de Gd-sensor de 2x, se añaden 50 l de las soluciones de agentes de contraste desde el paso 3.3. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces. </li><li> Se incuban las soluciones en los tubos de PCR para alrededor de 5 min a temperatura ambiente. Pueden dejarse reposar durante hasta 30 minutos. </li><li> Transferir 45 l de cada tubo en una placa de 384 pocillos. Cada tubo de PCR dará pocillos duplicados. </li><li> Registrar la fluorescencia de cada pocillo en un lector de placas. El fluoróforo (FAM) utilizado en el diseño de Gd-sensor tiene máximos de excitación y emisión de 495 y 520 nm, respectivamente, como se indica en el sitio web del proveedor. Elija longitudes de onda de excitación y emisión apropiados o filtros en función de si el lector de placas es monochromator- o basado en filtro. </li><li> Trazar la gráfica de la fluorescencia en unidades arbitrarias de fluorescencia (AFU) frente a la concentración de Gd 3+. </li><li> Hacer el gráfico como factor de cambio de fluorescencia frente a la concentración de Gd 3+. Calcular el factor de cambio de fluorescencia dividiendo el AFU de cada concentración por el AFU de la solución &quot;en blanco&quot; (con 0 nM de Gd 3+). El pliegue del cambio de fluorescencia permitirá la normalization de los resultados, en caso de que la pantalla AFU algunos periódica (diferentes días, etc.) variaciones. </li><li> Comparación de la emisión de fluorescencia de la solución que contiene el agente de contraste y el &quot;en blanco&quot;, que es la solución que contiene 0 nM GdCl 3 (sólo tampón). NOTA: una mayor fluorescencia de la solución GBCA implica la presencia de no quelado Gd 3+, que pueden requerir una purificación adicional del agente de contraste. La cantidad de presente no quelado Gd 3+ se puede estimar utilizando la curva de calibración construida en el paso 3.10 o 3.11. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Usando el Gd-sensor basado en aptámero, un aumento en la emisión de fluorescencia que es proporcional a la concentración de Gd no quelado 3+ se observa. Para minimizar la cantidad de muestra utilizada, el ensayo se puede ejecutar en una microplaca de 384 pocillos con un volumen total de la muestra de 45 l por pocillo. En este diseño, la elección de fluoresceína (FAM) y DABCYL (Dab) se basa principalmente en el coste de los reactivos; para modificar la longitud de onda de emisión, una pareja diferente de fluor...

La creciente importancia de la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) en el diagnóstico clínico, que está limitado por la sensibilidad inherente de la técnica, ha dado como resultado el rápido crecimiento de la investigación en el desarrollo de nuevos agentes de contraste a base de gadolinio (GBCAs) 1. GBCAs son moléculas que se administran para mejorar la calidad de la imagen, y por lo general tienen la estructura química de un ion trivalente de gadolinio (Gd 3+) coordinado a un ligando polidentado. Esta formación de complejos es de importancia crítica que no quelado Gd 3+ es tóxico; se ha implicado en el desarrollo de fibrosis sistémica nefrogénica en algunos pacientes con enfermedad renal o insuficiencia 2. En consecuencia, la detección del ion libre acuosa es fundamental para garantizar la seguridad de GBCAs. La presencia de no quelado Gd 3+ en soluciones GBCA a menudo es el resultado de una reacción incompleta entre el ligando y el de iones, la disociación del complejo, o displacement por otros cationes metálicos biológicos 3. Entre las diversas técnicas que actualmente se utilizan para determinar la presencia de Di-s 3+, aquellos que dependen de cromatografía y / o rango más alto espectrometría en términos de versatilidad y aplicabilidad 4. Entre sus puntos fuertes son de alta sensibilidad y precisión, la capacidad de analizar diversas matrices de muestra (incluyendo suero humano 5, la orina y el pelo 6, aguas residuales 7, y formulaciones de agentes de contraste 8), y la cuantificación simultánea de múltiples complejos de Gd + 3 (un listado de los estudios anteriores a 2013 se describe en una revisión exhaustiva por Telgmann et al.) 4. El único inconveniente es que varios de estos métodos requieren instrumentaciones (como la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente) 4 que algunos laboratorios no pueden tener acceso a. En el contexto de descubrimiento novedoso GBCA en la investigación y los niveles de prueba de concepto, arbasado en el método espectroscópico elatively más conveniente, rápida y rentable (tales como absorción UV-Vis o fluorescencia) puede servir como una alternativa valiosa. Con estas aplicaciones en mente, un sensor basado en aptámero fluorescente para acuosa Gd 3 + 9 fue desarrollado. El aptámero (Gd-aptámero) es una larga molécula de ADN de una sola hebra 44-base con una secuencia específica de bases que se aisló a través del proceso de evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) 9. Para adaptar el aptámero en un sensor fluorescente, un fluoróforo está unido al terminal 5 &#39;de la hebra, que después se hibridó con una hebra de temple (QS) a través de 13 bases complementarias (Figura 1). El QS está marcado con una molécula extintor oscuro en el extremo 3 &#39;. En ausencia de Gd 3 +, el sensor (Gd-sensor), compuesto por una relación molar 1: 2 de Gd-aptámero y QS, respectivamente, tendrán mínima emisión de fluorescencia debido to transferencia de energía desde el fluoróforo al extintor. La adición de acuoso Gd 3+ desplazará al QS del Gd-aptámero, resultando en un aumento de la emisión de fluorescencia. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" /> La Figura 1. El sensor (Gd-sensor) que consiste en el largo aptámero 44-base (Gd-aptámero) etiquetadas con fluoresceína (un fluoróforo) y el filamento 13-base largo de temple (QS) etiquetadas con DABCYL (un extintor oscuro) . En ausencia de no quelado Gd 3+, la fluorescencia del sensor es mínimo. Con la adición de Gd 3+, el desplazamiento de la QS se produce y se observa un aumento en la emisión de fluorescencia. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Hay en la actualidad, un método basado en la espectroscopia de uso general para detectaring 3+ acuosa Di-s. Este ensayo utiliza el anaranjado de xilenol molécula, que se somete a un cambio en la longitud de onda de absorción máxima 433 a 573 nm sobre la quelación con el ion 10. La relación de estos máximos dos absorbancia se puede utilizar para cuantificar la cantidad de no quelado Gd 3+. El sensor de aptámero es una alternativa (también puede ser complementaria) con el ensayo de naranja de xilenol, como los dos métodos tienen diferentes condiciones de reacción (tales como el pH y la composición de las soluciones tampón se utiliza), selectividades de destino, los rangos lineales de cuantificación, y las modalidades de detección 9.

<table><tbody><tr><td>Gd-aptámero</td><td>IDTDNA</td><td>Secuencia de entrada y modificación del fluoróforo en la forma de pedido</td><td>Se puede utilizar un fluoróforo con una longitud de onda de emisión diferente. El aptámero también se puede pedir a otra empresa.</td></tr><tr><td>Filamento de enfriamiento</td><td>IDTDNA</td><td>Secuencia de entrada y modificación del enfriador en la forma de pedido</td><td>Se puede utilizar un enfriador diferente para una transferencia de energía óptima desde el fluoróforo. El aptámero también se puede pedir a otra empresa.</td></tr><tr>Agua <td></td><td></td><td>de grado de biología molecular</td><td>Ningún fabricante específico, tanto con DEPC como sin DEPC funcionan igual</td></tr><tr><td>de bien Cloruro de gadolinio (III) anhidro</td><td>Strem</td><td>936416</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td> tóxicos <td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio anhidro</td><td>MP Biomedicals</td><td>0520984480 - 100 g</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>327300025</tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td> corrosivo <td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Tóxico y corrosivo</td></tr><tr><td>Placas de poliestireno NBS de fondo plano negro de brida baja de 384 pocillos</td><td>Placas Corning</td><td>3575</td><td>que son adecuadas para fluorescencia lectura.</td></tr><tr><td>Filtro estéril desechable para biberones Nalgene Rapid-Flow</td><td>Thermo Scientific</td><td>5680020</td><td>La tapa de la botella está equipada con una membrana PES de 0,2 micras</td></tr><tr><td>Frascos estériles desechables de 250 ml</td><td>430281</td><td>Corning Se puede utilizar un frasco más grande o más pequeño</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL Sin</td><td></td><td></td><td>fabricante específico, siempre que estén libres de ADNasa y ARNasa</td></tr><tr><td>Tubos de PCR de</td><td></td><td></td> <td>0,2 mLNingún fabricante específico, siempre que estén libres de ADNasa y ARNasa</td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td></td><td></td><td>Ningún fabricante específico</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (sin filtro) de tamaños apropiados</td><td></td><td></td><td>Ningún fabricante específico, siempre que estén libres de ADNasa y ARNasa</td></tr><tr><td>EquipmentLector de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>placas</td><td>Biotek Synergy H1</td><td></td><td>Los lectores de placas de otros fabricantes funcionarían igual de bien</td></tr></tbody></table>

un sensor basado en aptámero para no quelado de gadolinio (iii)

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

Se demuestra un método para determinar la presencia de ion gadolinio trivalente no quelado (Gd3+) en solución acuosa. Gd3+ a menudo está presente en muestras de agentes de contraste a base de gadolinio como resultado de reacciones incompletas entre el ligando y el ion, o como un producto de disociación. Dado que el ion es tóxico, su detección es de vital importancia. En este trabajo, se describe el diseño y el uso de un sensor basado en aptámero (sensor Gd) para Gd3+. El sensor produce un cambio de fluorescencia en respuesta al aumento de las concentraciones del ion y tiene un límite de detección en el rango nanomolar (~100 nM con una relación señal-ruido de 3). El ensayo puede ejecutarse en un tampón acuoso a pH ambiente (~7 - 7,4) en una microplaca de 384 pocillos. El sensor es relativamente poco reactivo hacia otros iones metálicos fisiológicamente relevantes, como los iones de sodio, potasio y calcio, aunque no es específico para Gd3+ sobre otros lantánidos trivalentes como el europio (III) y el terbio (III). Sin embargo, los lantánidos no se encuentran comúnmente en los agentes de contraste o en los sistemas biológicos, por lo que el sensor puede usarse para determinar selectivamente Gd3+ no quelado en condiciones acuosas.

Un cambio de fluorescencia típico de la solución de Gd-sensor en presencia de no quelado Gd 3+ se muestra en la Figura 2. La emisión puede ser trazado como el pliegue del cambio de fluorescencia (Figura 2A) o de la lectura de fluorescencia en bruto (Figura 2B) en unidades arbitrarias (AFU). Ambas parcelas producen curvas de calibración muy similares con un rango lineal para las concentraciones de Gd 3+ por debajo de...

Se describe el uso de moléculas de polidesoxinucleótidos (aptámero de 44 meros) para detectar iones de gadolinio (III) no quelados en una solución acuosa. La presencia del ion se detecta a través de un aumento en la emisión de fluorescencia del sensor.

Un sensor basado en aptámero para no quelado de gadolinio (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

El objetivo general de este ensayo basado en fluorescencia es detectar la presencia de iones de gadolinio tóxicos no quelados en soluciones acuosas que contienen agentes de contraste para resonancia magnética. Este método puede ayudar a facilitar los agentes de contraste para RMN basados en gadolinio al proporcionar un medio para garantizar una alta paridad de los agentes sintetizados. La principal ventaja de esta técnica es que puede detectar concentraciones submicromolares de gadolinio tóxico no quelado con una selectividad relativamente alta frente a otros cationes metálicos biológicos.Para comenzar este procedimiento, prepare el tampón de ensayo según se describe en el protocolo escrito. Utilizando hidróxido de sodio y ácido clorhídrico, ajuste el pH a 7.4. A continuación, filtre el tampón a través de un filtro estéril desechable para frascos con membrana de PES de 0,2 micrones.A continuación, transfiera 497 microlitros del tampón de ensayo a un tubo microcéntrifugo nuevo. Añada un microlitro de la solución stock del aptámero de gadolinio preparada y dos microlitros de la solución stock de QS preparada. Transfiera 50 microlitros de esta solución sensora de gadolinio 2X a cada u

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Investigación

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Química

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Preparación, purificación y caracterización de los complejos lantánidos para el uso de agentes de contraste para resonancia magnética

Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un...

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Selección de aptámeros ADN enlace de éster ácido ftálico, caracterización y aplicación a un Aptasensor electroquímico

Aquí, presentamos un protocolo para obtener68Ga dopado a base de óxido de hierro nanopartículas vía rápida basada en microondas síntesis de. La metodología hace PET/MRI (T1) las nanopartículas con radiolabeling eficiencias superiores al 90% y la pureza radioquímica del 99% en una síntesis de 20 minutos.

Síntesis de 68Ga dopado a base de óxido de hierro nanopartículas de doble emisión de positrones/proyección de imagen de resonancia magnética (T1)

El protocolo actual demuestra el uso de un ensayo de amplificación exponencial rápido, de 3 etapas, basado en aptámeros para detectar objetivos. La preparación de la muestra, la amplificación de la señal y el desarrollo del color están cubiertos para implementar este sistema para reconocer la presencia de teofilina sobre la de cafeína.

Detección de objetivos basada en aptámeros facilitada por una reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 etapas

Aprende a detectar iones de gadolinio no quelados tóxicos mediante un ensayo basado en fluorescencia con aptámeros de polidesoxinucleótidos. Este método ofrece alta sensibilidad y selectividad para garantizar la seguridad de agentes de contraste de MRI.

Un sensor basado en aptámero para no quelado de gadolinio (III)

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