Análisis de la segregación cromosómica, acetilación de histonas y morfología de huso en ovocitos de caballo
11 de mayo de 2017
Este manuscrito describe un enfoque experimental para caracterizar morfológicamente y bioquímicamente ovocitos de caballo. Específicamente, el presente trabajo ilustra cómo recolectar ovocitos de caballo inmaduros y maduros mediante recogida de óvulos guiada por ultrasonido (OPU) y cómo investigar la segregación de cromosomas, morfología de huso, acetilación de histonas globales y expresión de mRNA.
Los objetivos generales de este enfoque experimental son, en primer lugar, caracterizar morfológica y bioquímicamente los ovocitos de caballo y, en segundo lugar, comparar gametos del mismo animal que fueron procesados in vitro o in vivo. Este enfoque experimental puede ayudar a responder preguntas clave en la biología de los ovocitos y la fertilidad en especies monovulatorias. También podría mejorar la seguridad de los procedimientos de manipulación de gametos.
Este enfoque se desarrolló para superar la disponibilidad restringida de muestras de ovocitos, especialmente de especies monovulatorias. El profesor Stefan Deleuze, de la Universidad de Lieja, Cecile Douet, directora de laboratorio de mi laboratorio, y Fabrice Reigner, director de la unidad equina del INRA Centre Val de Loire, demostrarán los procedimientos de la OPU. Diariamente, evalúe el diámetro de los folículos ováricos en una cohorte de yeguas adultas mediante ecografía.
Busca un folículo grande con un diámetro superior a 33 milímetros. Una vez encontrado, prepárese para inyectar 1.500 unidades de gonadotropina coriónica humana para inducir la maduración del ovocito en un folículo dominante. A continuación, localice el surco de la yugular y frote el lugar de la inyección con alcohol.
Luego, para hacer que la vena suba, aplique algo de fuerza dos o tres centímetros por debajo del sitio de inyección. Inserte la aguja casi paralela al cuello, aspire ligeramente para asegurarse de que la aguja esté en la vena e inyecte la hormona. Prepare una sonda de ultrasonido para el acceso vaginal.
Luego, conecte la aguja a un sistema de succión. 35 horas después de la inyección de hCG, configure la instrumentación para OPU y seda a la yegua. Una buena analgesia es extremadamente importante para la seguridad del animal y del operador.
Un animal que no sienta dolor ni molestias permitirá la manipulación del ovario, lo que facilitará la realización de pinchazos y lavados. Una vez que se inserta la sonda de aguja, un operador debe manipular el ovario para que mire hacia la sonda mientras el otro operador manipula la aguja. Localice el folículo dominante en la imagen ecográfica.
Luego, use la aguja para perforar la pared vaginal y la pared del folículo dominante. Una vez que se accede al espacio folicular, aspire el líquido folicular. Gire la aguja para raspar la pared folicular y unir el complejo cúmulo-ovocito.
Luego, vierte el líquido en una placa de Petri grande. Y bajo un estereoscopio, busque el COC. Mientras tanto, enjuague el folículo con PBS modificado tibio de Dulbecco que contiene heparina.
Es posible que se necesiten varias descargas para recoger el COC. Una vez encontrado el COC, cambie la aguja por una aguja de doble lumen y recoja los AOC inmaduros de todos los folículos que tengan entre cinco y 25 milímetros de diámetro. Estos se utilizarán para la maduración in vitro.
Una vez que se aspiran todos los folículos de un ovario, repita los mismos procedimientos para recolectar los AOC inmaduros del otro ovario. Ahora, elija entre los COC. Conserve solo AOC con varias capas completas de células cúmulos y un ooplasma marrón finamente granulado.
Desecha los demás. Al final del procedimiento, inyecte a la yegua 15.000 unidades de bencil-penicilina para prevenir la infección. Luego, aloja a la yegua en un establo tranquilo y limpio durante al menos dos horas mientras se recupera.
Antes de que comience la OPU, caliente una botella de TCM-199 suplementado con tampones HEPES a 37 grados centígrados. A continuación, prepare el medio IVM. Dispense 500 microlitros de TCM-199 tamponado con bicarbonato de sodio suplementado en los pocillos de un plato de cuatro pocillos.
A continuación, incuba el plato a 38,5 grados centígrados durante al menos dos horas. Transfiera los AOC inmaduros recuperados a un plato de 3,5 centímetros lleno con dos mililitros del HEPES TCM-199 calentado. Mueva los AOC a través de diferentes regiones del plato para lavar suavemente los desechos circundantes.
Ahora, transfiera los COC al medio IVM e incube durante 28 horas a 38,5 grados centígrados. Para realizar un recuento de cromosomas en AOC maduros, incubarlos en monastrol de 100 micromolares durante una hora a 38,5 grados centígrados. A continuación, extraiga las células del cúmulo tratando los AOC con hialuronidasa al 0,5% en TCM-199 tamponado con HEPES.
Controle esta reacción en un escenario climatizado a 38 grados centígrados. En unos cinco minutos, retire todas las células. Utilice un pipeteo suave para eliminar las últimas células rebeldes.
A continuación, extirpe la zona pelúcida utilizando pronasa al 0,2% en TCM-199 tamponado con HEPES. Monitorea esta reacción en un escenario calentado también. Debería tardar unos cinco minutos en completarse.
A continuación, fije los ovocitos en paraformaldehído al 4% en DPBS durante 15 minutos a 38,5 grados centígrados, seguidos de 45 minutos más de fijación a cuatro grados centígrados. Después de la fijación, lavar los ovocitos transfiriéndolos secuencialmente entre tres pocillos de alcohol polivinílico al 0,1% en DPBS. Use aproximadamente medio mililitro de solución por pocillo.
A continuación, transfiera los ovocitos a un pocillo lleno de 0,3%Triton X-100 en PBS, y déjelos incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para bloquear las señales inespecíficas, bañe las células en DPBS con 1% de BSA y 10% de suero de burro normal. Incubar las células durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente.
Después de 30 minutos, aplique el anticuerpo primario y luego incube las células a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, lavar los ovocitos y aplicar el anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente, protegido de la exposición a la luz. Después de aplicar el secundario, volver a lavar los ovocitos.
Luego, antes de montar, fije tiras de cinta adhesiva de doble cara a las guías para que sirvan como soportes de cubreobjetos. Ahora, monte los ovocitos de tres a cuatro por portaobjetos en una gota de medio de montaje antidecoloración que no se endurece y que se complementa con 20 micromolares de YO-PRO-1. Deje que los ovocitos se asienten durante unos 10 minutos y luego aplique los cubreobjetos.
De los 32 AOC recuperados por OPU de folículos dominantes, 28 estaban en metafase II. Utilizando la maduración in vitro, 37 de los 44 COC recolectados de folículos no dominantes maduraron hasta metafase II. Luego se compararon los cromosomas de ambos grupos. Los ovocitos madurados in vitro a menudo se vieron afectados por aneuploidía, principalmente hiperploidía. Esto no se observó en los ovocitos madurados in vivo.
A continuación, se midió la longitud del husillo de polo a polo y el diámetro del husillo en su máximo. Los ovocitos madurados in vitro eran significativamente más largos y anchos que los ovocitos madurados in vivo. En las mismas muestras, se midió el nivel global de acetilación de H4K16.
Los resultados fueron los esperados. La acetilación de H4K16 fue significativamente menor en los ovocitos madurados in vitro que en los ovocitos madurados in vivo. Un equipo bien entrenado puede procesar cinco yeguas en una mañana de OPU con una tasa de recuperación del 80% para el ovocito preovulatorio y del 50 al 60% de recuperación de los ovocitos inmaduros.
Durante la OPU, siempre controle la salud y el bienestar del animal, y esté listo para brindar atención veterinaria adecuada si es necesario. El enfoque experimental también se puede aplicar a ovocitos de otras especies y es especialmente aplicable cuando la disponibilidad de muestras es un problema, como en el caso de los humanos. Con base en nuestros resultados, se deben realizar estudios para comprender mejor las condiciones de cultivo necesarias para la segregación cromosómica adecuada y los cambios epigenéticos.
El objetivo general es mejorar la eficiencia de la maduración in vitro tanto para la medicina veterinaria como para el tratamiento de la fertilidad humana.
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Resumen
Este manuscrito presenta un enfoque experimental para caracterizar morfológica y bioquímicamente los ovocitos equinos. Describe la recolección de ovocitos inmaduros y maduros de caballo mediante la técnica de aspiración de óvulos guiada por ultrasonido (OPU) y examina la segregación cromosómica, la morfología del huso, la acetilación global de histonas y la expresión de ARNm.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología del ovocito
- Fertilidad en especies monovulatorias
- Procedimientos de manipulación de gametos
Antecedentes
- Comprender las características del ovocito es fundamental para la investigación de la fertilidad.
- Las especies monovulatorias tienen una disponibilidad limitada de ovocitos.
- La PVO guiada por ultrasonido puede mejorar la recolección de muestras.
- El análisis comparativo de gametos procesados in vitro e in vivo es esencial.
Objetivo del estudio
- Caracterizar morfológica y bioquímicamente los ovocitos equinos.
- Comparar gametos del mismo animal procesados en diferentes entornos.
- Mejorar la seguridad en los procedimientos de manipulación de gametos.
Métodos Utilizados
- Recogida de óvulos guiada por ultrasonido (OPU) para la colección de ovocitos.
- Evaluación del diámetro folicular ovárico en yeguas adultas.
- Estudio de la segregación cromosómica y la morfología del huso.
- Análisis de la acetilación global de histonas y la expresión de ARNm.
Resultados principales
- Recolección exitosa de ovocitos inmaduros y maduros de caballo.
- Información sobre la segregación cromosómica y la morfología del huso.
- Datos sobre los niveles globales de acetilación de histonas.
- Se establecieron los perfiles de expresión de ARNm relevantes.
Conclusiones
- El estudio proporciona un marco para la caracterización de ovocitos en caballos.
- Los hallazgos podrían mejorar la comprensión de la fertilidad en especies monovulatorias.
- Las técnicas de OPU pueden mejorar la seguridad en la manipulación de gametos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La caracterización de la biología de los ovocitos en especies monovulatorias aborda un cuello de botella crítico en la investigación y desarrollo reproductivo, donde la disponibilidad limitada de muestras dificulta los estudios mecanicistas. Este enfoque permite el análisis comparativo de los efectos de la maduración in vitro frente a la maduración in vivo sobre la integridad cromosómica y la regulación epigenética, proporcionando información predictiva para la optimización de las condiciones de cultivo. Estos datos contribuyen a reducir los riesgos de las tecnologías de reproducción asistida mediante la identificación de aneuploidías y defectos del huso inducidos por el cultivo antes de su traslación clínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos de fidelidad meiótica mediante la cuantificación de la incidencia de aneuploidía como lectura funcional de la competencia en la segregación cromosómica.
- Valor científico: El perfilado de acetilación de histonas (H4K16) vincula el estado epigenético con la morfología del huso, apoyando la validación de dianas en las vías HDAC/HAT durante la maduración del ovocito.
- Valor operativo: Proporciona un marco citológico estandarizado para evaluar parámetros de calidad ovocitaria aplicable en especies con acceso limitado a ovocitos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Los morfométricos cuantitativos de cromosomas y husos establecen métricas objetivas y reproducibles para evaluar condiciones de cultivo de maduración.
- Valor operativo: Los protocolos de inmunotinción para tubulina e histonas acetiladas crean ensayos transferibles para la selección de alta densidad de modificadores epigenéticos.
- Valor científico: El análisis de estabilidad de ARNm mediante qPCR bajo silenciamiento transcripcional aporta información para la identificación de objetivos reguladores postranscripcionales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: La comparación directa de ovocitos madurados in vitro e in vivo procedentes del mismo animal aísla los efectos específicos del cultivo, mejorando la relevancia traslacional de los modelos preclínicos.
- Valor operativo: Establece dimensiones de referencia del huso acromático y umbrales de acetilación para definir estados fisiológicos de maduración en especies con limitaciones monovulatorias.
- Valor científico: Los conjuntos de datos sobre modificaciones de histonas apoyan el descubrimiento de biomarcadores para la predicción de la competencia ovocitaria en procesos de reproducción asistida.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se enmarca en la fase de biología de descubrimiento, en la que los conocimientos mecanicistas sobre la calidad de los gametos informan la validación de dianas en etapas iniciales y el desarrollo de ensayos posteriores para terapéuticas reproductivas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la disregulación epigenética inducida por cultivo y su impacto en la fidelidad de la segregación cromosómica.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas estandarizadas (recuentos cromosómicos, morfometría del huso, niveles de acetilación) para evaluar los efectos de compuestos o condiciones en la maduración del ovocito.
- Análisis: Genera resultados medibles (tasas de aneuploidía, intensidad de H4K16, dimensiones del huso) que permiten comparaciones estadísticas entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con puntos de referencia in vivo, reduciendo el riesgo de extrapolación específica de especie en el desarrollo de modelos preclínicos de fertilidad.
- Reutilización Empresarial: Los protocolos de OPU y fijación crean una plataforma reutilizable de caracterización de ovocitos aplicable a otras especies monovulatorias que enfrentan escasez de muestras.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la seguridad del protocolo de maduración mediante la vinculación directa de las condiciones de cultivo con métricas de integridad epigenética y cromosómica.
- Valor operativo: Los procedimientos estandarizados de recolección y procesamiento de ovocitos mejoran la reproducibilidad entre laboratorios y especies.
- Valor estratégico: La detección temprana de defectos meióticos inducidos por el cultivo reduce el riesgo de fracaso en fases avanzadas del desarrollo de tecnologías reproductivas asistidas.
- Impacto en la cartera: La priorización basada en datos de las formulaciones de medios de maduración según umbrales de aneuploidía y normalidad del huso.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en el manejo de ovocitos, micromanipulación y microscopía de fluorescencia para un análisis preciso de cromosomas y husos.
- La microscopía confocal de barrido láser y los sistemas con platina calefactable son esenciales para la fijación e imagen en función del tiempo de estructuras meióticas.
- La estandarización entre laboratorios de la validación de anticuerpos (tubulina, H4K16ac) y los protocolos de montaje garantiza resultados cuantitativos comparables.
- La adaptación a diferentes especies requiere la optimización de los umbrales de tamaño folicular en la PVO y de las dosis hormonales según la fisiología reproductiva.
- Las limitaciones incluyen el bajo rendimiento de ovocitos por sesión y la imposibilidad de evaluar la actividad transcripcional debido al silenciamiento global durante la maduración, lo que desplaza el enfoque hacia la regulación postranscripcional.
