Name: Un procedimiento adecuado para evaluar la En Vivo Rendimiento de cáncer Nanomedicinas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprende a evaluar nanomedicinas contra cáncer en ratones con tumores usando liposomas marcados dualmente. Este método cuantifica la acumulación sistémica, tisular y subcelular para identificar candidatos prometedores con potencial clínico.

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Los autores desean agradecer a las Dras. Helene Salmon y Miriam Merad de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai por proporcionar las células B16-F10-YFP y por su asesoramiento experto en modelos de ratón con melanoma. Los autores agradecen además al Centro Central de Imágenes Animales, al Centro Central de Radioquímica y Sondas de Imágenes Moleculares y al Centro Central de Citología Molecular del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) por su apoyo. Este trabajo contó con el apoyo de las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) y P30 CA008748 (MSK Center Grant). Los autores también agradecen al Centro de Imágenes Moleculares y Nanotecnología (CMINT) de MSK por su apoyo financiero (T.R.).

El procedimiento consiste en la doble etiquetado radiactivo y de fluorescencia de nanopartículas, en vivo de imágenes PET-TAC, las mediciones de biodistribución ex vivo y ex vivo inmunotinción y análisis de citometría de flujo. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. 1. Preparación de liposomas marcados con dual NOTA: los tumores de melanoma B16 singénicos puede ser inducida por la inyección de 300.000 células B16-F10 en los costados traseros de ratones C57BL / 6 con anestesia de inhalación de 2% -isoflurane que contiene oxígeno. Utilizar los reactivos e instrumentos estériles en un área de trabajo estéril durante la cirugía. Después de la cirugía, observar cuidadosamente a los animales hasta su recuperación de la anestesia. Ponga los animales de nuevo en sus jaulas sólo cuando recuperan la consciencia y la movilidad completa. Alojarlos en habitaciones estériles para animales con tumores xenoinjertados. Los tumores con un tamañode 300 mm 3 son ideales para la caracterización de nanopartículas debido a sus pronunciadas de permeabilidad y retención efectos mejorados (EPR), que pueden aumentar la acumulación de nanopartículas. Los protocolos detallados se proporcionan a continuación. <ol><li> En un matraz de fondo redondo, disolver una mezcla de 20 mg de los lípidos en 2 ml de cloroformo que contiene 1,2-dipalmitoyl- sn -glicero-3-phophocholine (DPPC), colesterol, 1,2-disearoyl- sn -glycero- 3-fosfoetanolamina-poli (etilenglicol) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-deferoxamina (DSPE-DFO) 8, y ácido 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disulfónico ( DiIC12 [5] -DS) en relaciones molares de 61.3%, 33.4%, 5, 0,2% y 0,1%, respectivamente. NOTA: Esta composición de lípidos es muy similar a la formulación liposomal de doxorubicina utilizados actualmente en la clínica 2. Los liposomas resultantes de nuestro procedimiento imitan muy de cerca la actuación en vivo de la clínica nanomedicine. </li><li> Use un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente orgánico y formar una película lipídica delgada a temperatura ambiente. Añadir 20 ml de PBS y se somete a ultrasonidos durante 30 min para generar nanopartículas liposomales mediante el uso de una punta de sonicación 3,8 mm y una amplitud de 30 W, con una refrigeración suficiente en hielo. </li><li> Se centrifuga la disolución de liposomas a 4.000 xg durante 10 minutos para eliminar los agregados y lavar las nanopartículas con PBS utilizando filtración centrífuga (peso molecular de corte (MWCO:. 100 kDa) para eliminar los lípidos libres y disolvente orgánico residual Concentrar los liposomas, que se permanecen en la cámara superior, y los transfieren a un nuevo tubo. los liposomas se pueden almacenar en una nevera en PBS durante hasta 1 semana antes de las etapas posteriores. </li><li> Para el control de calidad, caracterización de los liposomas mediante dispersión de luz dinámica (DLS). Específicamente, la mezcla 50 l de liposomas con 950 l de PBS, y luego transferir la mezcla en la cubeta de encolado. Colocar la cubeta en el analizador y medir la partículatamaños y su distribución de tamaños. Los tamaños de partícula y su distribución de tamaños ((PDI) índice de polidispersidad) se espera que sean 90 a 120 nm y 0,1 a 0,2, respectivamente. </li><li> Para el radiomarcaje, mezclar los liposomas purificados, equivalente a 2 mg de los lípidos, en PBS a un pH entre 6,9 y 7,1 con 1 mCi 89 Zr-oxalato a 37 ° C durante 2 h en un tubo de 1,5 ml, (volumen total: ~ 100 l). Retire la libre, sin reaccionar 89 Zr por filtración centrífuga (corte de peso molecular = 100 kDa), similar a la etapa 1.3. Lavar el retenido con PBS estéril y se diluye hasta el volumen deseado. El rendimiento radioquímico debe ser de 80 - 95%. ¡PRECAUCIÓN! Trabajar con materiales radiactivos está muy regulada. Las instituciones deben estar certificados y proporcionar las instalaciones necesarias, la capacitación del personal, y la vigilancia estricta del uso de la radiactividad. Los investigadores tienen que recibir una formación adecuada y llevar equipo de protección personal y anillos de dosimetría / divisas al manipular la radiactividad. </li><li&gt; Determinar la pureza radioquímica de los liposomas radiomarcados por exclusión de tamaño de radio-HPLC, que normalmente debe ser más del 98% 10. purezas radioquímicos inferiores a 95% son indicativos de lavado insuficiente en el paso 1.5. </li><li> Después de radiomarcaje, determinar el tamaño de las nanopartículas mediante dispersión de luz dinámica. Se espera que el tamaño y la PDI que estén dentro del mismo rango que las medidas en el paso 1.4 10. NOTA: Si muestras radiactivas no están permitidos en el citómetro de flujo o un microscopio de fluorescencia, nat no radiactivo Zr-oxalato se puede utilizar para etiquetar los liposomas en el paso 1.5. Estos liposomas no radiactivos tienen características idénticas a sus análogos radiactivos. Una representación de este procedimiento se proporciona en la Figura 2. </li></ol> 2. En vivo de imágenes PET-TC y la biodistribución de los liposomas de doble etiquetado <ol><li> Inyectar aproximadamente 100 l de liposomas de doble etiquetado wITH aproximadamente 300 Ci de radiactividad en ratones con melanoma restringido (C57BL / 6, femenino, 10 - 16 semanas de edad) a través de sus venas de la cola, a aproximadamente 10 mCi 89 Zr / kg de peso corporal. </li><li> Para determinar la vida media, extraer la sangre de la vena de la cola de los animales anestesiados por debajo del 2% de isoflurano que contiene oxígeno usando 28-G jeringas de insulina. Recoger la sangre (10 a 20 l) en tubos previamente pesados ​​en 2 min, 15 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, y 48 h después de la inyección. Pesar la sangre por diferencia, determinar el contenido de radiactividad usando un contador gamma, y ​​calcular la concentración de radiactividad como porcentaje de la dosis inyectada por gramo (% ID / g). NOTA: Realice el procedimiento en un local equipado con un sistema de anestesia, jaulas de recuperación, calefacción y una campana de bioseguridad. Asegúrese de que los animales se recuperan por completo y ganan movilidad normal después del procedimiento antes de transferirlos de las jaulas de recuperación para la celebración de las jaulas. Casa los animales portadores de tumores en las habitaciones designadas para los animales administrados conmateriales radioactivos. </li><li> 24 o 48 h después de la inyección de la liposomas, la imagen de los ratones en un escáner CT-MicroPET de pequeños animales 10. Colocar el animal anestesiado en posición horizontal sobre su vientre y mantenerlo anestesiado. Administrar 2% de isoflurano en oxígeno a través de un cono de la nariz. Aplicar la pomada oftálmica de sus ojos antes de realizar el estudio para evitar que se sequen. </li><li> Realice una de todo el cuerpo de PET grabación de exploración estático al menos 50 millones de eventos coincidentes, con una duración aproximada de 15 minutos. Ajuste la ventana de tiempo de la energía y la coincidencia en 350-700 keV y 6 ns, respectivamente. A continuación, realice una exploración de 5 min la tomografía computarizada (TC). Ajuste el tubo de rayos X con una tensión de 80 kV y una corriente de 500 mu; la TC utiliza 120 pasos rotacionales para un total de 220 grados, con aproximadamente 145 ms por marco 10. </li><li> Después de la exploración PET-TAC, inmediatamente sacrificar los ratones mediante asfixia con dióxido de carbono y confirmar las muertes por Pinching de las patas de los animales. Una vez confirmado, realice luxaciones cervicales. </li><li> Retire la sangre en los tejidos del ratón por primera cortar y abrir la aurícula derecha y luego la inyección de 20 ml de PBS en el ventrículo izquierdo, y posteriormente recoger los tejidos pertinentes, tales como tumores, hígado, bazo, pulmón, riñón, músculo, y otras 16 personas. </li><li> Pesar los tejidos, medir su contenido de radiactividad mediante recuento gamma 8, 9, y calcular la acumulación de la radiactividad del tejido como un porcentaje de la dosis inyectada por g (% ID / g). </li></ol> 3. Ex Vivo citometría de flujo y Inmunoticción NOTA: Inyectar aproximadamente 100 l de liposomas fluorescentes en ratones de melanoma a través de su vena de la cola a una dosis de 0,5 mg de colorante por kg de peso corporal. Si las muestras radiactivas no están permitidos en el citómetro de flujo y microscopio de fluorescencia, se deben utilizar liposomas no radiactivos. <ol><li> Sacrificar la inyección de ratones h 24 puesto, como en el paso 2.5, y recoger los tumores, los cuales deben ser almacenados en PBS frío. </li><li> Por citometría de flujo, siga estos pasos 17: <ol><li> Preparar un cóctel de enzimas que consiste en una mezcla de colagenasa purificada I y II (4 U / ml), hialuronidasa (60 U / ml) y DNasa I (60 U / ml) en citometría de flujo de tampón (PBS con 0,5% de BSA y 1 EDTA mM). </li><li> Mezclar 100 mg de tejido tumoral con 200 l de tampón de cóctel de enzimas en un tubo de 1,5 ml y trocea el tejido a trozos pequeños con tijeras finas. Añadir otro 1,3 ml de cóctel de enzimas en el tubo y transferir su contenido a una placa de 6 pocillos. </li><li> Agitar la placa de 6 pocillos en un agitador horizontal colocado dentro de un horno de 37 ° C durante 60 minutos a 60 rpm. </li><li> Se lava el tejido homogeneizado con tampón de citometría de flujo 3 veces para obtener una suspensión de células individuales. </li><li> Teñir las células con un cóctel de anticuerpos específicos para marcadores biológicos incluyendo CD45, CD11b, Ly6C, CD11c,CD64, CD3, MHCII, y CD31 (dilución 1: 200 para todos los anticuerpos; información clon se proporciona en la hoja de cálculo materiales). Identificar los tipos de células relevantes y determinar su intensidad de fluorescencia media (MFI) de DiIC12 (5) -DS en cada población celular con un flujo apropiado de citometría de software de análisis. </li></ol></li><li> Para la inmunotinción, siga estos pasos: <ol><li> Colocar un tumor en un casete lleno de medio de corte óptimo (OCT) y congelarlo en hielo seco. </li><li> Hacer las secciones congeladas de 6 micras de tejido tumoral y colocarlos en portaobjetos de vidrio histología; las secciones deben cubrir las mayores secciones transversales del tumor, que proporcionan la información más representativo del tejido. </li><li> Manchar los biomarcadores (por ejemplo, CD31 de las células endoteliales) de interés con los anticuerpos correspondientes (por ejemplo, anti-CD31, clon MEC13.3). Fijar las secciones con paraformaldehido; bloquearlos con suero que coincida con el origen de la especie de los anticuerpos secundarios; incubcomió con anticuerpos primarios durante 12 horas a 4 ° C y luego con anticuerpos secundarios durante 2 h; y, por último, lavar con PBS y cubrir con cubreobjetos. La imagen de los portaobjetos teñidos con una Leica confocal en posición vertical microscopio SP5 13, 16. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen ninguna divulgación que hacer.

Los pasos críticos dentro del Protocolo: La alta calidad de los liposomas de doble etiquetado es la clave para producir resultados consistentes durante un largo período de tiempo. Tintes fluorescentes libres o iones de Zr 89 pueden generar totalmente diferentes patrones de segmentación y deben ser completamente eliminado durante la etapa de purificación. Además, si el sistema inmune afecta significativamente el rendimiento experimental nanomedicina cáncer, el uso de modelos de ratón ...

La nanomedicina está cambiando el paradigma del desarrollo del tratamiento del cáncer 1. Inspirado por el tremendo impacto clínico de cáncer nanomedicamentos anteriores, tales como liposomas y nanoterapias a base de albúmina 2, 3, muchas formulaciones novedosas se han producido en la última década. Sin embargo, los recientes análisis del éxito de la traducción clínica de estos nanomedicamentos cáncer indican que sólo unos pocos de ellos han sido aprobados para uso clínico 4, 5. Un obstáculo importante para la traducción clínica de nuevas nanomedicamentos cáncer es su limitada mejora del índice terapéutico en comparación con la administración directa de los compuestos terapéuticos gratuitos 6. Como tal evaluación, exacta del comportamiento in vivo de nanomedicamentos en sistémica, el tejido, y los niveles celulares en modelos animales preclínicos es esencial para identify aquellos con índices terapéuticos óptimos para futuro traducción clínica. Los nanomateriales pueden ser radiomarcados para la caracterización cuantitativa en animales vivos con tomografía por emisión de positrones (PET), que tiene excelente sensibilidad y reproducibilidad entre todas las modalidades de formación de imágenes clínicas 7. Por ejemplo, 89 Zr-etiquetado largo circulante nanomedicamentos se han caracterizado en modelos de ratón de cáncer de 8, 9, 10, así como en otros modelos de enfermedad 11. Además, la vida media en sangre y la biodistribución de los nanomedicamentos pueden ser evaluados ampliamente mediante el uso de mediciones ex vivo de radiactividad en los tejidos individuales 8. Por lo tanto, radiomarcaje permite la evaluación cuantitativa de nanomedicamentos en los niveles sistémicos y tejidos. Es importante destacar que, radiolabelenanomedicamentos d generalmente no se pueden analizar en el de una sola célula o los niveles subcelulares debido a la resolución espacial limitada de la señal radiactiva. Por lo tanto, el etiquetado fluorescente demuestra ser una modalidad complementaria para la evaluación de las nanopartículas con las técnicas de formación de imágenes ópticas tales como la citometría de flujo y microscopía de fluorescencia 12. Con este fin, las nanopartículas marcadas con radioisótopos y etiquetas fluorescentes se pueden evaluar cuantitativamente in vivo mediante formación de imágenes nuclear y ex vivo mediante recuento de radiactividad, y también pueden ser caracterizadas extensivamente a nivel celular por formación de imágenes ópticas. Anteriormente, hemos desarrollado procedimientos modulares para incorporar marcadores radiactivos y fluorescentes en varias nanopartículas, incluyendo lipoproteínas de alta densidad (HDL) 11, los liposomas 9, 10, las nanopartículas poliméricas, fragmentos de anticuerpos, y nanoemulsions 10, 13. Estas nanopartículas marcadas han permitido la caracterización cuantitativa en modelos animales pertinentes a distintos niveles, que han guiado a la optimización de estos nanomateriales para sus aplicaciones específicas. En el estudio actual, el objetivo es utilizar nanopartículas liposomales la plataforma de la nanomedicina más establecido 14 -como un ejemplo para demostrar procedimientos exhaustivos para generar una nanopartícula de doble etiquetado y caracterizar a fondo en un melanoma B16-F10 singénico clásico modelo de ratón 15 . A partir de los resultados, estamos seguros de este enfoque caracterización de nanopartículas se puede adaptar para evaluar otros nanomedicamentos cáncer en modelos de ratón pertinentes.

<table><tbody><tr><td>DPPC</td><td>Avantilipids</td><td>850355</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000</td><td>Avantilipids</td><td>880120P</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-DFO</td><td>Hecho en casa</td><td>110634</td><td>Perez-Medina et al., JNM, 2014</td></tr><tr><td>DiIC12[5]-DS</td><td>AAT Bioquest</td><td>22051</td><td></td></tr><tr><td>Filtro centrífugo</td><td>Vivaproducts</td><td>VS2061</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Buchi</td><td>R-100</td><td></td></tr><tr><td>Radio-HPLC</td><td>Shimadzu HPLC con 2 bombas LC-10AT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>89Zr-oxalato</td><td>MSKCC</td><td>Sintetizado internamente</td><td>Ciclotrón de haz variable TR19/9 (Ebco Industries Inc.)</td></tr><tr><td>Micro PET-CT</td><td>Siemens</td><td>Inveon Micro-PET/CT</td><td></td></tr><tr><td>Contador gamma</td><td>PerkinElmer</td><td>2470-0150</td><td></td></tr><tr><td>Citometría</td><td>de flujo BD Biosciences</td><td>Fortessa</td><td>Cualquier analizador de citometría de flujo multiparamétrico sería suficiente</td></tr><tr><td>Ratones C57BL/6</td><td>Células</td> de melanoma B16-YFP de Jackson Laboratories <td></td><td></td></tr><tr><td></td> Salmón <td>casero</td> N<td>/A</td><td>et al., Inmunidad, 2016</td></tr><tr><td>Ly6C (clon HK1.4)--APC-Cy7</td><td>128025</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>MHCII (M5/114/152)--APC</td><td>107613</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (30-F11)--BV510</td><td>103137</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7</td><td>139313</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (M1/70)--BV605</td><td>101237</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (17A2)--BV711</td><td>100241</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3)--PE</td><td>561073</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5</td><td>117327</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3) sin fluoróforo</td><td>550274</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr></tbody></table>

un procedimiento adecuado para evaluar la<em&gt; en vivo</em&gt; rendimiento de cáncer nanomedicinas

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspirado por el éxito de nanomedicamentos cáncer anteriores en la clínica, los investigadores han generado un gran número de nuevas formulaciones en la última década. Sin embargo, sólo un pequeño número de nanomedicamentos han sido aprobados para uso clínico, mientras que la mayoría de nanomedicamentos en desarrollo clínico han producido resultados decepcionantes. Un obstáculo importante para el éxito de la traducción clínica de nuevas nanomedicamentos cáncer es la falta de una comprensión exacta de su actuación en vivo. En este artículo se dispone de un procedimiento riguroso para caracterizar el comportamiento in vivo de nanomedicamentos en ratones portadores de tumor en sistémica, de tejidos, de una sola célula, y los niveles subcelulares a través de la integración de emisión de positrones tomografía computarizada (PET-CT), los métodos de la radiactividad de cuantificación , citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. Con este enfoque, los investigadores pueden evaluar con precisión nuevas formulaciones a nanoescala en modelos de ratón de signi pertinentesr. Estos protocolos pueden tener la capacidad de identificar los nanomedicamentos cáncer más prometedores con un alto potencial de traslación o para ayudar en la optimización de nanomedicamentos cáncer para la traducción futuro.

La Figura 1 muestra una visión general del procedimiento. La Figura 2 presenta el procedimiento de síntesis esquemática de los liposomas de doble etiquetado descrito en la etapa 1 10. La figura 3 muestra un representante de PET-CT de imagen (Figura 3a), cuantificación de la radiactividad de la PET (Figura 3b), la semivida en sangre (Figura 3c), y la biodistribució...

La escasa comprensión del rendimiento in vivo de las nanomedicinas obstaculiza su traslación clínica. Aquí se describen los procedimientos para evaluar el comportamiento in vivo de los nanomedicamentos contra el cáncer a nivel sistémico, tisular, unicelular y subcelular en ratones inmunocompetentes portadores de tumores. Este enfoque puede ayudar a los investigadores a identificar nanomedicamentos prometedores contra el cáncer para su traslación clínica.

Un procedimiento adecuado para evaluar la<em&gt; En Vivo</em&gt; Rendimiento de cáncer Nanomedicinas

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el comportamiento in vivo de nanomedicamentos contra el cáncer a niveles sistémico, tisular, celular individual y subcelular en ratones inmunocompetentes con tumores. Este método puede ayudar a responder la pregunta clave en el campo de la nanomedicina contra el cáncer: ¿cómo se acumulan cuantitativamente los nanomedicamentos en diferentes tejidos de animales vivos a lo largo del tiempo? La principal ventaja de esta técnica es que este enfoque de doble marcado permite la caracterización de nanomedicinas in vivo desde el nivel macroscópico hasta el microscópico. Elegimos liposomas como ejemplo para demostrar nuestro procedimiento porque los liposomas están actualmente en uso clínico y también son una plataforma común para nanomedicinas experimentales. Para comenzar el procedimiento, disuelva 20 miligramos de una mezcla de lípidos, que incluye 0,1 % en mol de un colorante fluorescente catiónico lipofílico y dos mililitros de cloroformo.Luego, seque los lípidos con un evaporador rotatorio. Añada 20 mililitros de solución salina tamponada con fosfato a los lípidos secos. Sone la mezcla en hielo con un sonicador de sonda de 3,8 milíme

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