Un procedimiento adecuado para evaluar la En Vivo Rendimiento de cáncer Nanomedicinas

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el comportamiento in vivo de los nanomedicamentos contra el cáncer a nivel sistémico, tisular, unicelular y subcelular en ratones inmunocompetentes portadores de tumores. Este método puede ayudar a responder a la pregunta clave en el campo de la nanomedicina del cáncer. ¿Cómo se acumulan cuantitativamente los nanomedicamentos en diferentes tejidos de animales vivos a lo largo del tiempo?

La principal ventaja de esta técnica es que este enfoque de doble marcaje permite la caracterización in vivo de la nanomedicina desde el nivel macroscópico hasta el microscópico. Elegimos los liposomas como ejemplo para demostrar nuestro procedimiento porque los liposomas están actualmente en uso clínico y también son una plataforma común para nanomedicinas experimentales. Para comenzar el procedimiento, disuelva 20 miligramos de una mezcla de lípidos, que incluye 0,1% por mol de un tinte fluorescente catiónico lipofílico y dos mililitros de cloroformo.

A continuación, seque los lípidos con un evaporador rotativo. Agregue 20 mililitros de solución salina tamponada con fosfato a los lípidos secos. Sonicar la mezcla en hielo con un sonicador de sonda de 3,8 milímetros a 30 vatios durante 30 minutos, manteniendo la mezcla entre cuatro y 20 grados centígrados en todo momento.

Centrifugar la suspensión de nanopartículas liposomales resultante a 4.000 G durante 10 minutos. Deseche el pellet y lave los liposomas con PBS, utilizando una unidad de filtro centrífugo MWCO de 100 kilodalton a 4000 G.Transfiera los liposomas concentrados de la cámara superior a un nuevo tubo de centrífuga. Los liposomas pueden almacenarse en PBS en un refrigerador hasta por una semana.

Realice una dispersión dinámica de la luz en una mezcla de 50 microlitros de la suspensión de liposomas purificada y 950 microlitros de PBS. Mida los tamaños de partícula y determine la distribución de tamaños. Para comenzar el procedimiento de radiomarcaje, transfiera a un tubo de 1,5 mililitros, el volumen necesario de liposomas purificados y PBS, para obtener dos miligramos de lípidos.

Agregue a esto un milicurio de oxalato de zurconio-89 para un volumen final de 100 microlitros y un pH de 6,9 a 7,1. Remueve la mezcla a 37 grados centígrados durante dos horas. A continuación, eliminar el circonio-89 libre por filtración centrífuga con una unidad de filtro de 100 kilodalton a 4.000 G.Lavar el retenido con PBS estéril tres veces a 4.000 G.A continuación, diluir el retenido a unos tres microcurios por microlitro para la inyección.

Utilice HPLC de exclusión de tamaño junto con un detector de radiación para determinar la pureza radioquímica de los liposomas radiomarcados. Si la pureza radioquímica es inferior al 95%, reformule la dosis. Utilice la dispersión dinámica de la luz para confirmar que el tamaño de partícula y los valores de distribución son similares a los de los liposomas no radiomarcados.

Para comenzar el procedimiento de diagnóstico por imágenes, inyecte alrededor de 300 microcurie de liposomas radiomarcados en la vena de la cola de un ratón con melanoma restringido. Dos minutos después de la inyección, use una jeringa de insulina de calibre 28 para recolectar de 10 a 20 microlitros de sangre de la vena de la cola del ratón. Transfiera la muestra de sangre a un tubo de recuento previamente pesado.

Pese la muestra de sangre y mida la actividad con un contador de rayos gamma. Calcular la concentración de radiactividad como porcentaje de la dosis inyectada por gramo. Quince minutos después de la inyección, recoja y mida otra muestra de sangre de la misma manera.

A continuación, anestesiar al ratón mediante la administración de isoflurano al 2% y oxígeno a través de un cono nasal. Recoja y mida una tercera muestra de sangre una hora después de la inyección. Luego, permita que el ratón se recupere en una jaula de recuperación hasta que se haya recuperado la movilidad normal.

Recoja muestras adicionales cuatro, ocho, 24 y 48 horas después de la inyección. Permita que el mouse se recupere completamente entre inyecciones. Aloje al ratón en una habitación designada para animales a los que se les hayan administrado materiales radiactivos.

A las 24 o 48 horas después de la inyección de liposomas, anestesiar al ratón con isoflurano al 2% y oxígeno. Coloque el ratón boca abajo sobre una cama de escáner microPET-CT para animales pequeños. Continúe suministrando 2% de isoflurano y oxígeno a través de un cono nasal.

Aplica ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar que se sequen. A continuación, mueva la cama del escáner al instrumento. Realice una exploración estática PET de cuerpo entero de 15 minutos con al menos 50 millones de eventos coincidentes, con una energía de 250 a 700 kiloelectronvoltios y una ventana de coincidencia-temporización de seis nanosegundos.

A continuación, realice una tomografía computarizada de cinco minutos con 120 pasos de rotación de más de 220 grados, con aproximadamente 145 milisegundos por fotograma. Después de completar el escaneo, sacrifique inmediatamente al ratón por asfixia con dióxido de carbono. Confirmar la muerte pellizcando la pata del animal, y luego realizar la luxación cervical.

Perfundir los tejidos con PBS para eliminar la sangre y recolectar las muestras de tejido relevantes. Pesar los tejidos recolectados y medir su actividad. Calcule la acumulación de liposomas radiomarcados en el tejido como porcentaje de la dosis inyectada por gramo.

Almacene el tejido tumoral en PBS frío. Realice citometría de flujo ex vivo e imágenes de inmunoflurescencia en el tejido tumoral recolectado para medir la acumulación con respecto a las poblaciones celulares. Las imágenes PET/CT de ratones portadores de tumores inyectados con nanopartículas marcadas con zirconio-89 mostraron una acumulación significativa de nanopartículas en el tejido tumoral 24 horas después de la inyección.

Se determinó que la vida media de las nanopartículas en sangre era de aproximadamente 10 horas. Las mediciones de biodistribución ex vivo a las 24 horas después de la inyección fueron consistentes con las mediciones de PET/CT in vivo. A continuación, se investigó la acumulación de nanopartículas a nivel de una sola célula con técnicas de inmunotinción.

La citometría de flujo indicó que las nanopartículas se acumulaban preferentemente en los macrófagos asistidos por tumores. Las imágenes de inmunoflurescencia de muestras tumorales también indicaron un objetivo específico de las células endoteliales por parte de las nanopartículas. Esta técnica puede ayudar a los investigadores a identificar nanomedicinas prometedoras para la traslación clínica.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días si se realiza correctamente. Al radiomarcar nanomedicamentos, es importante aplicar altos estándares de control de calidad. Siguiendo este procedimiento, se pueden etiquetar otros nanomedicamentos, como nanoemulsiones, nanopartículas poliméricas, micelas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, para medir su rendimiento in vivo en ratones portadores de tumores.