Un procedimiento adecuado para evaluar la

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el comportamiento in vivo de nanomedicamentos contra el cáncer a niveles sistémico, tisular, celular individual y subcelular en ratones inmunocompetentes con tumores. Este método puede ayudar a responder la pregunta clave en el campo de la nanomedicina contra el cáncer: ¿cómo se acumulan cuantitativamente los nanomedicamentos en diferentes tejidos de animales vivos a lo largo del tiempo?

La principal ventaja de esta técnica es que este enfoque de doble marcado permite la caracterización de nanomedicinas in vivo desde el nivel macroscópico hasta el microscópico. Elegimos liposomas como ejemplo para demostrar nuestro procedimiento porque los liposomas están actualmente en uso clínico y también son una plataforma común para nanomedicinas experimentales. Para comenzar el procedimiento, disuelva 20 miligramos de una mezcla de lípidos, que incluye 0,1 % en mol de un colorante fluorescente catiónico lipofílico y dos mililitros de cloroformo.

Luego, seque los lípidos con un evaporador rotatorio. Añada 20 mililitros de solución salina tamponada con fosfato a los lípidos secos. Sone la mezcla en hielo con un sonicador de sonda de 3,8 milímetros a 30 vatios durante 30 minutos, manteniendo la mezcla entre cuatro y 20 grados Celsius durante todo el proceso.

Centrifugue la suspensión resultante de nanopartículas liposomales a 4.000 G durante 10 minutos. Deseche el sedimento y lave los liposomas con PBS, utilizando una unidad de filtro centrífugo con un límite de exclusión molecular de 100 kilodaltons a 4.000 G. Transfiera los liposomas concentrados desde la cámara superior a un nuevo tubo de centrífuga. Los liposomas pueden almacenarse en PBS en el refrigerador durante hasta una semana.

Realice dispersión dinámica de luz en una mezcla de 50 microlitros de la suspensión de liposomas purificados y 950 microlitros de PBS. Mida los tamaños de las partículas y determine la distribución de tamaños. Para iniciar el procedimiento de radiomarcado, transfiera a un tubo de 1,5 mililitros el volumen necesario de liposomas purificados y PBS, para obtener dos miligramos de lípidos.

Añada a esto un milicurio de oxalato de circonio-89 para un volumen final de 100 microlitros y un pH de 6,9 a 7,1. Agite la mezcla a 37 grados Celsius durante dos horas. Luego, elimine el circonio-89 libre mediante filtración centrífuga con una unidad de filtro de 100 kilodaltones a 4.000 G. Lave el retenido con PBS estéril tres veces a 4.000 G. A continuación, diluya el retenido a aproximadamente tres microcurios por microlitro para la inyección.

Utilice HPLC de exclusión por tamaño acoplado a un detector de radiación para determinar la pureza radioquímica de los liposomas radiomarcados. Si la pureza radioquímica es inferior al 95 %, reformule la dosis. Utilice dispersión dinámica de luz para confirmar que los valores de tamaño y distribución de partículas sean similares a los de los liposomas no radiomarcados.

Para comenzar el procedimiento de imagen, inyecte aproximadamente 300 microcurios de liposomas radiomarcados en la vena de la cola de un ratón con melanoma restringido. Dos minutos después de la inyección, utilice una jeringa de insulina de calibre 28 para recoger entre 10 y 20 microlitros de sangre de la vena de la cola del ratón. Transfiera la muestra de sangre a un tubo de conteo previamente pesado.

Pese la muestra de sangre y mida la actividad con un contador gamma. Calcule la concentración de radiactividad como porcentaje de la dosis inyectada por gramo. Quince minutos después de la inyección, recoja y mida otra muestra de sangre de la misma manera.

Luego, anestesie al ratón mediante la administración de isoflurano al 2 % y oxígeno a través de una cánula nasal. Recolecte y mida una tercera muestra de sangre una hora después de la inyección. A continuación, permita que el ratón se recupere en una jaula de recuperación hasta que recupere la movilidad normal.

Recolecte muestras adicionales a las cuatro, ocho, 24 y 48 horas después de la inyección. Permita que el ratón se recupere completamente entre inyecciones. Mantenga al ratón en una habitación designada para animales a los que se les han administrado materiales radiactivos.

A las 24 o 48 horas después de la inyección de liposomas, anestesie al ratón con 2% de isoflurano y oxígeno. Coloque al ratón boca abajo sobre la camilla de un escáner microPET-CT para animales pequeños. Continúe administrando 2% de isoflurano y oxígeno mediante un cono nasal.

Aplique una pomada veterinaria en los ojos del ratón para evitar que se sequen. Luego, mueva la camilla del escáner hacia el interior del instrumento. Realice una adquisición estática de PET de cuerpo completo de 15 minutos con al menos 50 millones de eventos coincidentes, con una energía de 250 a 700 kiloelectrón voltios y una ventana de temporización de coincidencia de seis nanosegundos.

A continuación, realice una tomografía computarizada de cinco minutos con 120 pasos rotacionales distribuidos en 220 grados, con aproximadamente 145 milisegundos por cuadro. Tras finalizar la exploración, sacrifique inmediatamente al ratón mediante asfixia con dióxido de carbono. Confirme la muerte pellizcando la pata del animal y luego realice una dislocación cervical.

Perfusione los tejidos con PBS para eliminar la sangre y obtenga las muestras de tejido pertinentes. Pese los tejidos recolectados y mida su actividad. Calcule la acumulación de liposomas radiomarcados en el tejido como porcentaje de la dosis inyectada por gramo.

Almacene el tejido tumoral en PBS frío. Realice citometría de flujo *ex vivo* e imágenes de inmunofluorescencia en el tejido tumoral recolectado para medir la acumulación con respecto a las poblaciones celulares. Las imágenes de PET/CT en ratones con tumores inyectados con nanopartículas marcadas con circonio-89 mostraron una acumulación significativa de nanopartículas en el tejido tumoral 24 horas después de la inyección.

Se determinó que la semivida de las nanopartículas en sangre era de aproximadamente 10 horas. Las mediciones ex vivo de biodistribución a las 24 horas posteriores a la inyección fueron consistentes con las mediciones in vivo mediante PET/CT. Luego, se investigó la acumulación de nanopartículas a nivel de célula individual mediante técnicas de inmunotinción.

La citometría de flujo indicó que las nanopartículas se acumularon preferentemente en macrófagos asistidos por el tumor. La imagen de inmunofluorescencia de muestras tumorales también indicó un direccionamiento específico de las nanopartículas hacia células endoteliales. Esta técnica puede ayudar a los investigadores a identificar nanomedicinas prometedoras para su traslación clínica.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres días si se lleva a cabo correctamente. Al radiomarcar nanomedicinas, es importante aplicar altos estándares de control de calidad. Tras seguir este procedimiento, otras nanomedicinas, como nanoemulsiones, nanopartículas poliméricas, micelas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, pueden marcarse para medir su desempeño in vivo en ratones con tumores.