Name: La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a aislar hepatocitos primarios de ratón mediante perfusión enzimática para estudiar respuestas inflamatorias hepáticas. Este método permite cuantificar citocinas como CRP e IL6 mediante ELISA y PCR en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01HL128714 a CF) y (F31DK10236101 a KS) y la American Heart Association (CF y AG).

Todos los animales protocolos y procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Miami Miller School of Medicine. 1. Preparación <ol><li> medios de perfusión hepática de precalentamiento y el hígado digerir los medios de comunicación en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Configurar una bomba de perfusión (30 ml / min). Cuidadosamente llenar previamente el sistema de tubos de la bomba con los medios de la perfusión del hígado. Evitar las burbujas de aire en el sistema y preparar el microscopio estereotáctica. </li><li> Escudo placas de cultivo celular utilizando el colágeno de tipo I de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li></ol> 2. Recuperación de hígado <ol><li> Anestesiar al ratón donante utilizando oxígeno / inhalación de isoflurano (isoflurano al 4% / 2 L / min de oxígeno). <ol><li> Mantener la anestesia mediante la reducción de isoflurano al 2-2,5% o mediante la inyección de ketamina (100 mg / kg de peso corporal por vía intraperitoneal) y xilazina (10 mg / kg de peso corporal intraperitoneally). Se prefiere la anestesia con isoflurano continua desde la ketamina disminuye la presión arterial y puede causar hepatotoxicidad. </li></ol></li><li> Coloque el ratón anestesiado sobre una almohadilla absorbente. Fijar las extremidades del ratón con cinta adhesiva. </li><li> Afeitarse y desinfectar el abdomen del ratón y realizar una laparotomía ventral desde el pubis hasta el borde craneal del hígado utilizando tijeras quirúrgicas con puntas afiladas / romos. Incisión en la pared abdominal para ambos lados, caudal del diafragma. </li><li> Exponer a la vena cava inferior (IVC) moviendo con cuidado el intestino hacia el lado derecho. diseccionar cuidadosamente el tejido graso alrededor de la vena cava inferior utilizando hisopos de algodón estériles con punta y pinzas de punta en ángulo. </li><li> Incisión en el diafragma suprahepática y abrir la cavidad torácica por dos incisiones laterales utilizando tijeras quirúrgicas finas con puntas cortantes / punzantes. Se liga el IVC torácica usando la seda quirúrgica (5/0). </li><li> Canular la vena cava inferior infrarrenal mediante un catéter iv blindado, retire con cuidado la aguja,conectar la bomba de perfusión y empezar la perfusión del hígado. Si se realiza correctamente, el hígado debe comenzar inmediatamente a palidecer y oleaje. </li><li> Seccionar la vena portal que permite el drenaje adecuado de los medios de perfusión de sangre y el uso de tijeras quirúrgicas finas. </li><li> Perfundir el hígado con aproximadamente 30 ml de medio de perfusión del hígado, y luego cambiar a digerir el hígado medios (30 ml). Apagar la bomba de perfusión y retirar la cánula de perfusión una vez que se haya completado. </li><li> exponer suavemente la región central del hígado y localizar el tejido que conecta la vinculación de los lóbulos hepáticos. Coge las fibras que conectan centrales y cuidadosamente diseccionar todos los tejidos que sostienen el hígado en su lugar y retire con cuidado el hígado. </li><li> transferir inmediatamente el hígado en un tubo cónico de 50 ml de polipropileno que contiene 15 ml de hígado digerir medios de comunicación. NOTA: No hay línea de tiempo específico para este paso. Después de la perfusión, el hígado se mantiene en los medios de digerir para el transporte a una campana de cultivo celular estéril. todo spasos ubsequent deben llevarse a cabo en un ambiente estéril. </li></ol> 3. Aislamiento y tratamiento de las células <ol><li> Dentro de una campana de cultivo celular, transferir el hígado a partir de la que contiene el medio de digestión 50 ml tubo cónico de polipropileno en una placa de cultivo tisular estéril. </li><li> El uso de pinzas estériles, arrancar suavemente los cuatro lóbulos del hígado. Si se realiza correctamente, medio digestión debería ser turbia debido a aislar los hepatocitos del hígado. </li><li> Utilizando una punta de pipeta estéril 25 ml, se filtra el medio de digestión turbia a través de un filtro de células de nylon 70 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml de polipropileno para eliminar las partículas de tejido sin digerir y los restos celulares. </li><li> Repita los pasos 3,2 y 3,3 con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Esto ayuda con la eliminación de cualquier hepatocitos residuales desde el hígado. </li><li> Centrifugar a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante que contiene los restos celulares exceso y suavemente las células en 25 ml 1x frío resuspenderWilliams Medio E. </li><li> Con una punta de pipeta estéril de 25 ml, se filtra la resuspensión a través de un nuevo 70 micras filtro de células de nylon en un tubo de 50 ml cónico de polipropileno para lograr una suspensión más limpio. </li><li> Repetir los pasos 3.5 y 3.6 por tres lavados adicionales utilizando frío Williams &#39;E Medium 1x para obtener una suspensión de células más clara. </li><li> Después de la etapa de lavado final, se aspira el sobrenadante para eliminar los restos celulares en exceso. Vuelva a suspender las células y el filtro en 25 ml cálida Williams Medios E 1x que contiene la descongelación de los hepatocitos primarios y suplementos chapado a través de un nuevo 70 micras filtro de células de nylon en un tubo de 50 ml cónico de polipropileno. </li><li> Recuento de células dentro de la suspensión de células 25 ml usando un hemocitómetro. En promedio esperar 15 - 20 millones de células por hígado adulto. Determinar la viabilidad celular mediante la tinción de azul de tripano. </li><li> células de la placa en 2 ml de Williams &#39;Medios E 1x que contiene la descongelación de los hepatocitos primarios y suplementos que platean en un ce recubierto de 6 pocillos colágenoclúster cultura ll (9 x 10 5 células por pocillo). </li><li> Después de 4 h, cambiar el medio de Williams E 1x medios de comunicación que contiene suplementos de mantenimiento de hepatocitos primarios. </li><li> Después de 24 h, el suero de hambre células con medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) medios 1x para 6 h. </li><li> Tratar las células con PBS como vehículo, FGF23 (25 ng / ml), LPS (100 mg / ml) o IL-6 (50 ng / ml) en medio libre de suero y se incuba durante 24 h. </li></ol> 4. Aislamiento de ARN <ol><li> Preparar ARN utilizando un kit de columna de centrifugación comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 5. Generación de ADNc a partir de ARN aislado mediante transcripción inversa <ol><li> Añadir 200 ng de ARN aislado de la muestra a un tubo de PCR. </li><li> Añadir 14 l de endonucleasa libre de H2O para PCR tubo desde el paso 5.1. </li><li> Añadir 4 l de transcriptasa inversa para tubo de PCR de la etapa 5.1. </li><li> Vuelva a suspender contenidos suavemente para hacer la mezcla homogénea; centrifugar suavemente. </li&gt; <li> Coloque el tubo de PCR que contiene la mezcla en un termociclador. termociclador de gestión para la transcripción inversa: 1 ciclo de 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) y luego mantenga a 4 ° C. El producto final será el ADNc deseado. </li></ol> 6. Análisis de las células por cuantitativos PCR en tiempo real (qPCR) <ol><li> Preparar la placa de 96 pocillos. <ol><li> Colocar todos los componentes de reacción en hielo qPCR: 1 l de ADNc, 0,25 M de cebador directo, 0,25 M de cebador inverso, 5 l SYBR Green, 3,5 l de agua de grado PCR en un volumen total de 10 mL. Utilizando SYBR Green, preparar la mezcla maestra para ejecutar todas las muestras por triplicado. </li><li> Una vez que la mezcla principal se completa, vórtice para hacer homogénea. Alícuota de 9 l de qPCR mezcla maestra en cada pocillo de una placa de 96 WLL. Después, añadir cuidadosamente 1 l de ADNc en cada pocillo. volumen total de reacción se convertirá en 10 mL. </li><li> Después de la carga es completa, sellar la placa de 96 pocillos con ópticopelícula adhesiva y brevemente centrífuga placa de 96 pocillos (50 xg durante 1 min). </li></ol></li><li> Las muestras se ejecutan en un instrumento de PCR en tiempo real. Coloque sellada placa de 96 pocillos en el Real-Time PCR instrumento y las muestras se ejecutan como las recomendaciones del fabricante del instrumento. Ejemplos de ciclos estándar y rápidos se incluyen a continuación. <ol><li> Para parámetros de los ciclos estándar, utilice la siguiente: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 120 s, y luego 40 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 60ºC durante 60 s, y luego mantenga opcionalmente a 4 ° C. </li><li> Para los parámetros de ciclo rápido: utilizar el siguiente: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 30 s, luego 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 58 ° C durante 15 s, y luego 72 ° C durante 10 s. </li></ol></li><li> Consulte el manual del instrumento para orientación sobre cómo analizar los datos. </li></ol> 7. Análisis de los sobrenadantes celulares por ELISA NOTA: Todos los pasos se llevan a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante. </p&gt; <ol><li> Preparación de la muestra <ol><li> Dispensar 398 l de diluyente en tubos separados. Pipetear 2 l de la muestra de sobrenadante de células en el tubo de diluyente 398 l. Esto proporcionará un pliegue dilución de 200. </li><li> Repita el paso 7.1.1 para cada muestra a analizar. </li></ol></li><li> Procedimiento <ol><li> Pipetear 100 l de 200 veces muestra diluida y un estándar en los pocillos de una placa de 96 pocillos. </li><li> Incubar la placa de 96 pocillos a 25 ° C durante 45 min en un agitador de microplacas a 150 rpm. </li><li> Lavar los pocillos 5 veces con solución tampón de lavado 1x. Una vez que se ha completado el último lavado, eliminar la solución de lavado residual con papel absorbente. </li><li> Añadir 500 l de reactivo de conjugado de HRP en cada pocillo. </li><li> Repita los pasos 7.2.2 - 7.2.3. </li><li> Pipetear 100 l de tetrametilbencidina (TMB) de reactivo en cada pocillo de placa de 96 pocillos. </li><li> Mezclar suavemente placa de 96 pocillos a 25 ° C durante 20 min en una microplacaagitador a 150 rpm. Detener la reacción añadiendo directamente a 100 l de solución de parada a cada pocillo y mezclar suavemente. Una vez que se añade la solución de paro debe girar el color amarillo. Este informa que la solución de paro se ha mezclado correctamente. </li><li> El uso de un lector de placa de microtitulación, determinar la densidad óptica a 450 nm dentro de la primera 5 min. </li></ol></li><li> Cálculo de los resultados <ol><li> Calcular una tabla de valores de absorbancia promedio (A 450) para cada muestra y cada estándar. </li><li> Montar una curva de calibración graficando la media A450 de cada estándar frente a su concentración estándar en ng / ml en un gráfico lineal. Permitir que el eje x para representar la concentración y el eje y para representar un 450 valores. </li><li> Utilizando el referimos a un 450 de cada muestra diluida, determinar la concentración de la proteína deseada en ng / ml de la curva estándar. </li><li> Multiplicar la concentración de la muestra por la dilución de factor. Esto permitirá que para la determinación de la concentración real de la proteína deseada en la muestra de sobrenadante de células. </li><li> Trazar la mesa construida a partir de muestras en un gráfico de líneas. Si OD 450 valores se encuentran fuera de la curva estándar, las muestras deben diluirse apropiadamente y volver a probar. </li><li> Normalizar los resultados a 500.000 células. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Aislamiento de hepatocitos primarios de ratones es una herramienta rápida, de bajo costo y fiable para estudiar las respuestas inflamatorias ex vivo. Si se realiza correctamente, los resultados pueden ser fácilmente generados y reproducen de una manera oportuna y rentable. Los siguientes puntos deben ser cuidadosamente evaluados con el fin de garantizar un éxito en el aislamiento. La incisión quirúrgica y la canulación de la vena cava inferior se deben realizar bajo anestesia genera...

La enfermedad renal crónica (ERC) se puede definir como un estado de inflamación aguda y crónica 1. En los pacientes con enfermedad renal crónica, los niveles séricos del factor de crecimiento de fibroblastos hormona fosfatúrica 23 (FGF23) aumentan progresivamente con el fin de mantener la homeostasis del fosfato sérico 2. Aumento de los niveles de FGF23 en suero se asocian de forma independiente con la morbilidad y la mortalidad cardiovascular en los pacientes que inician el tratamiento de hemodiálisis 3, 4. Además, varios estudios clínicos han demostrado una fuerte correlación entre los niveles de FGF23 elevadas y los niveles séricos de proteína C-reactiva (CRP), la interleucina-6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral α (TNF) 5, 6. Por otra parte, en un estudio experimental, se ha demostrado recientemente que FGF23 puede dirigirse directamente a los hepatocitos y causar una respuesta inflamatoria mediante el aumento de la PCR y la IL-6 producción en el hígado 7. Por lo tanto, FGF23 podría actuar como un factor circulante que contribuye a la inflamación sistémica en la ERC. A principios de los 70, los hepatocitos primarios fueron aislados y estudiados por primera vez 8. Desde entonces las células hepáticas de cultivo primario se han utilizado ampliamente para examinar el procesamiento metabólico, la función hormonal, el metabolismo de fármacos y toxicidad, así como la inmunidad y respuestas inflamatorias 9, 10. Protocolos anteriores han descrito principalmente el aislamiento enzimático de hepatocitos primarios a partir de tejido de hígado humano 11, 12. Mientras que un modelo excelente, esto deja fuera la capacidad de estudiar cómo la manipulación genética afecta a los mecanismos de señalización hepática complejos, así como consecuencias funcionales sobre diferentes tipos de estímulos. En lo que sigue, se describe el aislamiento de hepatocitos primarios murinos. En particular, el efecto de varios mediadores de la respuesta de fase aguda hepática, tales como lipopolisacárido (LPS), IL-6 y FGF23 se puede analizar de una manera fácil, rápida y reproducible 13. En este documento, se presenta un protocolo para el aislamiento enzimático de los hepatocitos de ratones adultos, y demostramos que inductores establecidos de la inflamación, tales como LPS e IL-6, así como los mediadores inflamatorios novedosos como FGF23, pueden estimular directamente la expresión y secreción de citoquinas inflamatorias, tales como la PCR y la IL-6 en hepatocitos cultivados.

<table><tbody><tr><td>Consumibles</Filtro ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>celdas fuerte 70 &mu; m Colador de celdas de nylon</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo cónico de polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>100 Aplicadores con punta de algodón de 6 pulgadas&nbsp;</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>1cc U-100 Jeringa de Insulina 28 G 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>Plato de Cultivo de Tejidos 100 x 20 mm Estilo</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6 pocillos Cluster de Cultivo Celular</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>5/0 Seda Quirúrgica Trenzada Negra (100 yardas)</td><td>LOOK</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td>Minipuls 3 Bomba de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>perfusión</td><td>Gilson</td><td>F155007</td><td></td></tr><tr><td>Kits de hemacitómetro, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-474</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de hemacitómetro, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-470</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas - afiladas/romas</td><td>F.S.T.</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris-ToughCut recta</td><td>F.S.T.</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont SS-45</td><td>F.S.T.</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de Tejido para Estudiantes</td><td>F.S.T.</td><td>991121-12</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución ácido acético, 2.0 N</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; A8976-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP 250 mL</td><td>Piramal Healthcare</td><td>&nbsp; &nbsp; 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)</td><td>VEDCO</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina 100 mg/mL</td><td>AnaSed Inyectable</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Medio de Willams E (1x)</td><td>gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Medio de perfusión hepática (1x)</td><td>gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Medio de digestión hepática (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td></td></tr><tr><td>Suplementos primarios de descongelación y colocación de hepatocitos Life</td><td>Technologies</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Suplementos de mantenimiento de hepatocitos primarios Life</td><td>Technologies</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina (PBS) pH 7.4</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>solución de azul de tripano</td><td>VWR</td><td>45000-717</td><td></td></tr></tbody></table>

la inducción de una respuesta inflamatoria en la primaria hepatocitos culturas de ratones

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

El hígado juega un papel decisivo en la regulación de la inflamación sistémica. En la enfermedad renal crónica, en particular, el hígado reacciona en respuesta al medio urémico, estrés oxidativo, endotoxemia y la disminución del aclaramiento de circulación de citocinas proinflamatorias mediante la producción de un gran número de reactivos de fase aguda. herramientas experimentales para el estudio de la inflamación y el papel fundamental de los hepatocitos son cruciales para comprender la regulación y la contribución de citocinas hepáticas a una respuesta de fase aguda sistémica y un escenario pro-inflamatoria prolongada, especialmente en un entorno complejo como la enfermedad renal crónica. Desde el estudio de complejos mecanismos de la inflamación in vivo sigue siendo un reto, uso intensivo de recursos y por lo general requiere el uso de animales transgénicos, hepatocitos aislados primarios proporcionan una herramienta robusta para obtener información mecanicista en la respuesta de fase aguda hepática. Dado que esta técnica in vitro cuenta con costes moderados, alta reproducibilidad y el conocimiento técnico común, hepatocitos aislados primarios también se pueden utilizar fácilmente como un criterio de selección. A continuación, describimos un método basado en enzimática para aislar hepatocitos murinos primarios, y se describe la evaluación de una respuesta inflamatoria en estas células utilizando ELISA y cuantitativa en tiempo real PCR.

Histología Imágenes de microscopía de luz representativos de células aisladas y cultivadas primarias se representan en la Figura 1A. El análisis inmunocitoquímico demuestra que los hepatocitos aislados altamente expresan albúmina (rojo), así como el factor de crecimiento de fibroblastos receptor 4 (FGFR4) (verde). Los núcleos se tiñeron con 4 &#39;, 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (azul). (Figura 1B).</stro...

Aquí, se muestra un enfoque enzimático para aislar hepatocitos primarios de ratones adultos, y se describe la cuantificación de una respuesta inflamatoria mediante ELISA y PCR en tiempo real.

La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar con éxito hepatocitos murinos funcionales para estudiar la expresión y secreción de citoquinas inflamatorias, como CRP e IL6, en respuesta a mediadores de la respuesta hepática de fase aguda. Este método podría ayudar a responder preguntas clave sobre la función hepatocelular y la contribución de las citoquinas hepáticas a un entorno inflamatorio prolongado, como el presente en la enfermedad renal crónica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una herramienta robusta para un análisis sencillo, rápido y reproducible de la metabolómica hepática y la inflamación, así como de la respuesta a fármacos.Para comenzar, precaliente el medio de perfusión hepática y el medio de digestión hepática en un baño de agua a 37 grados Celsius. Configure una bomba de perfusión como se muestra aquí. Luego, use el medio de perfusión hepática para llenar cuidadosamente de antemano el sistema de tubos de la bomba.Intente evitar cualquier burbuja de aire en el sistema. Prepare el microscopio estereotáxico para el procedimiento de perfusión. Luego, después de anestesiar un ratón donante según el protocolo descrito, coloque el animal anestesiado sobre una almohadilla absorbente.Utilice cinta adhesiva para fijar las extremidades del ratón. A continuación, afeite y desinfecte el abdomen del ratón. Luego, use tijeras quirúrgicas con puntas afiladas pero romas para realizar una laparotomía ventral desde el pubis hasta el borde craneal del hígado.Haga incisiones en la pared abdominal a ambos lados en una posición caudal al diafragma. Exponga la vena cava inferior o VCI moviendo cuidadosamente el intestino hacia el lado derecho utilizando hisopos estériles de algodón. Con tijeras quirúrgicas finas y puntas afiladas, realice incisiones laterales a través del diafragma suprahepático y abra la cavidad torácica.Luego, utilice seda quirúrgica 5-0 para ligar la vena cava inferior torácica. Con un catéter intravenoso protegido, canule la vena cava inferior infrarrenal. Conecte la bomba de perfusión e inicie la perfusión del hígado.Si se realiza correctamente, el hígado debe comenzar inmediatamente a palidecer e hincharse. A continuación, con tijeras quirúrgicas finas, seccione la vena porta, permitiendo un drenaje adecuado de la sangre y del medio de perfusión. Después de perfundir el hígado con aproximadamente 30 mililitros de medio de perfusión hepática, detenga la bomba de perfusión.Cambie al medio de digestión hepática y reanude la bomba. Una vez completada la perfusión, retire la cánula. Exponga suavemente la región central del hígado y localice el tejido conectivo que une los lóbulos hepáticos.Agarre las fibras conectores centrales y disecar cuidadosamente todos los tejidos que sujetan el hígado en su lugar. Luego, retire suavemente el hígado. Transfiera inmediatamente el órgano a un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros que contenga 15 mililitros de medio de digestión hepática.Mientras trabaje bajo una campana de cultivo celular, transfiera el hígado desde el tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros a una placa de cultivo tisular estéril. Con pinzas estériles, desgarre suavemente los cuatro lóbulos del hígado. Si se realiza correctamente, el medio de digestión debería volverse turbio debido al aislamiento de hepatocitos a partir del hígado.Utilizando una punta estéril de pipeta de 25 mililitros, filtre el medio de digestión turbio a través de un filtro celular de nailon de 70 micrómetros hacia un nuevo tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros para eliminar partículas de tejido no digeridas y restos celulares. Centrifugue el filtrado combinado a 50 veces g a cuatro grados Celsius durante dos minutos, luego aspire el sobrenadante que contiene exceso de restos celulares y use 25 mililitros de Medio E de William 1X frío para resuspender suavemente las células. Después de repetir la filtración y el lavado de los hepatocitos tres veces, aspire el sobrenadante para eliminar el exceso de restos celulares.Re-suspender las células en 25 mililitros de medio E de William tibio 1X que contenga suplementos para descongelación y siembra de hepatocitos primarios, y filtrar la suspensión a través de un nuevo filtro de nylon de 70 micrómetros hacia un tubo cónico de 50 mililitros. Una vez contadas las células, sembrarlas en dos mililitros de medio E de William que contenga suplementos para descongelación y siembra de hepatocitos primarios sobre un cultivo celular de seis pocillos recubierto con colágeno. Tras dos cambios del medio para privar progresivamente a las células de sustratos, tratar las células con PBS como vehículo, 25 nanogramos por mililitro de FGF23, 100 microgramos por mililitro de LPS o 50 nanogramos por mililitro de IL6 en medio sin suero.Incube los cultivos durante 24 horas. Después de preparar el ARN utilizando un kit de columna de centrifugación según las instrucciones del fabricante, agregue 200 nanogramos del ARN aislado a un tubo de PCR. Luego agregue 14 microlitros de agua libre de endonucleasas y cuatro microlitros de transcriptasa inversa al tubo.Coloque el tubo de PCR en el termociclador y ejecute el siguiente programa de transcripción inversa para generar ADNc. Para realizar PCR cuantitativa, combine los siguientes componentes de la mezcla maestra de QPCR en un tubo sobre hielo. Vortexee la mezcla maestra.Luego, alícuota nueve microlitros de la solución en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Añada cuidadosamente un microlitro de ADNc a cada pocillo, preparando tres pocillos para cada muestra. Finalmente, ejecute las muestras en un equipo de PCR en tiempo real y analice los datos según el protocolo descrito en el texto.Se muestra aquí una imagen representativa de microscopía óptica de células aisladas y cultivadas primarias. El análisis inmunocitoquímico demuestra que los hepatocitos aislados expresan altamente albúmina, así como el receptor 4 del factor de crecimiento de fibroblastos. En este experimento, los hepatocitos aislados primarios fueron tratados con FGF23, LPS o IL6 durante 24 horas y los niveles de ARNm de CRP e IL6 se analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real.El LPS, IL6 y FGF23 aumentaron significativamente la expresión de PCR y IL6. Como se muestra aquí, los sobrenadantes de cultivo celular de hepatocitos primarios aislados se analizaron mediante ELISA para determinar los niveles de PCR. Tal como se demostró con el análisis de QPCR, los tratamientos con LPS, IL6 y FGF23 aumentaron significativamente los niveles de PCR en los sobrenadantes celulares en comparación con las células tratadas con PBS.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en solo unas pocas horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es fundamental recordar mantener un ambiente estéril. Debido al trabajo con cultivos primarios, minimizar el riesgo de contaminación posible es lo más importante para obtener resultados óptimos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar con éxito hepatocitos de ratón para estudiar diversas funciones hepatocelulares, como la expresión y la secreción de citocinas hepáticas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La infección de ratones con un adenovirus que expresan el autoantígeno humano importante del citocromo P450 2D6 (hCYP2D6) reconocidos por los sueros de los pacientes con tipo 2, los resultados de hepatitis autoinmune en una forma persistente de la enfermedad hepática autoinmune mediada por la hepatitis se caracteriza por una amplia fibrosis, y la generación de un CYP2D6 la respuesta inmune específica.

El CYP2D6 Animal Modelo: cómo inducir a la hepatitis autoinmune en ratones

La interrupción del flujo biliar da lugar a una lesión hepática colestásica inflamatoria grave con una secuencia característica de alteraciones morfológicas dependientes del tiempo. En este trabajo presentamos un protocolo para la ligadura quirúrgica de la colédoca en ratones que permite inducir una fuerte respuesta fibrótica a los 21 a 28 días.

Ligadura del conducto biliar en los ratones: Inducción de la injuria hepática inflamatoria y fibrosis por colestasis obstructiva

Aquí describimos un método común para inducir lesión hepática crónica en ratones por la alimentación de una dieta de deficiencia de colina y suplementada con ethionine (CDE). Demostramos la vigilancia de la salud, la perfusión hepática, aislamiento y conservación. Un curso de tiempo de seis semanas puede informar sobre la lesión del higado, pathohistology, fibrosis, inflamación y las respuestas de células progenitoras hepáticas.

El murino colina deficientes, suplementada con Ethionine (CDE) dieta de modelo de la lesión hepática crónica

Describimos un modelo de inmunización in vivo, traslacional de hepatitis en ratones BALB / c que se puede utilizar para estudiar la patogénesis de la hepatitis autoinmune inducida por medicamentos, incluidas las diferencias de sexo observadas en esta enfermedad. Describiremos cómo este modelo demuestra análisis reproducibles utilizando técnicas experimentales in vivo e in vitro.

Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos

Aquí, describimos el desarrollo de un modelo murino clínicamente relevante de cáncer de hígado recapitulando las características inmunitarias típicas del cáncer hepatocelular (HCC).

Un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis

Se describe un modelo animal simple y confiable para la esteatohepatitis no alcohólica inducida por la dieta, que se logra a través de la carcasa no SPF de los animales y la administración de una dieta alta en grasas específica. Describimos la identificación de los subconjuntos de células inmunes hepáticas y adiposas para recapitular las condiciones inmunológicas humanas exponiendo ratones a gérmenes ambientales.

Un modelo murino avanzado para esteatohepatitis no alcohólica en asociación con diabetes tipo 2

En este estudio, describimos un protocolo detallado para inducir esteatosis vesicular hepática en células HepaRG diferenciadas con el oleato de sodio de sal de ácido graso y empleamos métodos para la detección y cuantificación de la acumulación de lípidos, incluyendo anti-Stokes coherentes Microscopía de dispersión Raman (CARS), análisis citofluorimétrico, tinción O de color rojo aceite y qPCR.

Inducir y caracterizar la esteatosis vesicular en células hepa-repartidas diferenciadas

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento de hepatocitos de ratón de hígados de ratón adultos utilizando una técnica de perfusión de colagenasa modificada. También se describe el cultivo a largo plazo de hepatocitos en un ajuste de sándwich de colágeno 3D, así como la inmunoetiquetado de los componentes citoesqueléticos para estudiar la formación canalicular biliar y su respuesta al tratamiento.

Aislamiento y cultivo de sándwich de colágeno 3D de hepatocitos primarios de ratón para estudiar el papel del citoesqueleto en la formación canalicular de bilis en Vitro

Los hepatocitos primarios son una herramienta valiosa para estudiar la respuesta hepática y el metabolismo in vitro. Utilizando reactivos disponibles comercialmente, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón.

Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

Este video muestra la forma de inducir hipofisitis autoinmune en ratones SJL y la forma de evaluar su gravedad por la histopatología.

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

Aprende a aislar hepatocitos primarios de ratón mediante perfusión enzimática para estudiar respuestas inflamatorias hepáticas. Este método permite cuantificar citocinas como CRP e IL6 mediante ELISA y PCR en tiempo real.

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