La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones

El objetivo general de este procedimiento es aislar con éxito hepatocitos murinos funcionales para estudiar la expresión y secreción de citoquinas inflamatorias, como CRP e IL6, en respuesta a mediadores de la respuesta hepática de fase aguda. Este método podría ayudar a responder preguntas clave sobre la función hepatocelular y la contribución de las citoquinas hepáticas a un entorno inflamatorio prolongado, como el presente en la enfermedad renal crónica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una herramienta robusta para un análisis sencillo, rápido y reproducible de la metabolómica hepática y la inflamación, así como de la respuesta a fármacos.

Para comenzar, precaliente el medio de perfusión hepática y el medio de digestión hepática en un baño de agua a 37 grados Celsius. Configure una bomba de perfusión como se muestra aquí. Luego, use el medio de perfusión hepática para llenar cuidadosamente de antemano el sistema de tubos de la bomba.

Intente evitar cualquier burbuja de aire en el sistema. Prepare el microscopio estereotáxico para el procedimiento de perfusión. Luego, después de anestesiar un ratón donante según el protocolo descrito, coloque el animal anestesiado sobre una almohadilla absorbente.

Utilice cinta adhesiva para fijar las extremidades del ratón. A continuación, afeite y desinfecte el abdomen del ratón. Luego, use tijeras quirúrgicas con puntas afiladas pero romas para realizar una laparotomía ventral desde el pubis hasta el borde craneal del hígado.

Haga incisiones en la pared abdominal a ambos lados en una posición caudal al diafragma. Exponga la vena cava inferior o VCI moviendo cuidadosamente el intestino hacia el lado derecho utilizando hisopos estériles de algodón. Con tijeras quirúrgicas finas y puntas afiladas, realice incisiones laterales a través del diafragma suprahepático y abra la cavidad torácica.

Luego, utilice seda quirúrgica 5-0 para ligar la vena cava inferior torácica. Con un catéter intravenoso protegido, canule la vena cava inferior infrarrenal. Conecte la bomba de perfusión e inicie la perfusión del hígado.

Si se realiza correctamente, el hígado debe comenzar inmediatamente a palidecer e hincharse. A continuación, con tijeras quirúrgicas finas, seccione la vena porta, permitiendo un drenaje adecuado de la sangre y del medio de perfusión. Después de perfundir el hígado con aproximadamente 30 mililitros de medio de perfusión hepática, detenga la bomba de perfusión.

Cambie al medio de digestión hepática y reanude la bomba. Una vez completada la perfusión, retire la cánula. Exponga suavemente la región central del hígado y localice el tejido conectivo que une los lóbulos hepáticos.

Agarre las fibras conectores centrales y disecar cuidadosamente todos los tejidos que sujetan el hígado en su lugar. Luego, retire suavemente el hígado. Transfiera inmediatamente el órgano a un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros que contenga 15 mililitros de medio de digestión hepática.

Mientras trabaje bajo una campana de cultivo celular, transfiera el hígado desde el tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros a una placa de cultivo tisular estéril. Con pinzas estériles, desgarre suavemente los cuatro lóbulos del hígado. Si se realiza correctamente, el medio de digestión debería volverse turbio debido al aislamiento de hepatocitos a partir del hígado.

Utilizando una punta estéril de pipeta de 25 mililitros, filtre el medio de digestión turbio a través de un filtro celular de nailon de 70 micrómetros hacia un nuevo tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros para eliminar partículas de tejido no digeridas y restos celulares. Centrifugue el filtrado combinado a 50 veces g a cuatro grados Celsius durante dos minutos, luego aspire el sobrenadante que contiene exceso de restos celulares y use 25 mililitros de Medio E de William 1X frío para resuspender suavemente las células. Después de repetir la filtración y el lavado de los hepatocitos tres veces, aspire el sobrenadante para eliminar el exceso de restos celulares.

Re-suspender las células en 25 mililitros de medio E de William tibio 1X que contenga suplementos para descongelación y siembra de hepatocitos primarios, y filtrar la suspensión a través de un nuevo filtro de nylon de 70 micrómetros hacia un tubo cónico de 50 mililitros. Una vez contadas las células, sembrarlas en dos mililitros de medio E de William que contenga suplementos para descongelación y siembra de hepatocitos primarios sobre un cultivo celular de seis pocillos recubierto con colágeno. Tras dos cambios del medio para privar progresivamente a las células de sustratos, tratar las células con PBS como vehículo, 25 nanogramos por mililitro de FGF23, 100 microgramos por mililitro de LPS o 50 nanogramos por mililitro de IL6 en medio sin suero.

Incube los cultivos durante 24 horas. Después de preparar el ARN utilizando un kit de columna de centrifugación según las instrucciones del fabricante, agregue 200 nanogramos del ARN aislado a un tubo de PCR. Luego agregue 14 microlitros de agua libre de endonucleasas y cuatro microlitros de transcriptasa inversa al tubo.

Coloque el tubo de PCR en el termociclador y ejecute el siguiente programa de transcripción inversa para generar ADNc. Para realizar PCR cuantitativa, combine los siguientes componentes de la mezcla maestra de QPCR en un tubo sobre hielo. Vortexee la mezcla maestra.

Luego, alícuota nueve microlitros de la solución en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Añada cuidadosamente un microlitro de ADNc a cada pocillo, preparando tres pocillos para cada muestra. Finalmente, ejecute las muestras en un equipo de PCR en tiempo real y analice los datos según el protocolo descrito en el texto.

Se muestra aquí una imagen representativa de microscopía óptica de células aisladas y cultivadas primarias. El análisis inmunocitoquímico demuestra que los hepatocitos aislados expresan altamente albúmina, así como el receptor 4 del factor de crecimiento de fibroblastos. En este experimento, los hepatocitos aislados primarios fueron tratados con FGF23, LPS o IL6 durante 24 horas y los niveles de ARNm de CRP e IL6 se analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

El LPS, IL6 y FGF23 aumentaron significativamente la expresión de PCR y IL6. Como se muestra aquí, los sobrenadantes de cultivo celular de hepatocitos primarios aislados se analizaron mediante ELISA para determinar los niveles de PCR. Tal como se demostró con el análisis de QPCR, los tratamientos con LPS, IL6 y FGF23 aumentaron significativamente los niveles de PCR en los sobrenadantes celulares en comparación con las células tratadas con PBS.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en solo unas pocas horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es fundamental recordar mantener un ambiente estéril. Debido al trabajo con cultivos primarios, minimizar el riesgo de contaminación posible es lo más importante para obtener resultados óptimos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar con éxito hepatocitos de ratón para estudiar diversas funciones hepatocelulares, como la expresión y la secreción de citocinas hepáticas.