El análisis de la superficie celular Adhesión Remodeling en respuesta a la tensión mecánica usando perlas magnéticas

El objetivo general de este experimento es explorar las vías bioquímicas que se activan en respuesta a la tensión utilizando microperlas magnéticas recubiertas de ligando y la aplicación forzada a los receptores de adhesión. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de las transacciones mecánicas, como cómo la tensión mecánica de la helometría exprés las dirige de la diferenciación o cómo la distensibilidad de los tejidos impulsa su transformación. La principal ventaja de esta técnica es que muchas células pueden ser estimuladas para el análisis químico mediante el uso de perlas para aplicar tensión en un subconjunto específico de receptores de adhesión.

Para comenzar, vuelva a suspender completamente las perlas tosilactivadas súper paramagnéticas en el vial original mediante vórtice durante al menos 30 segundos. Alícuota de 40 microlitros de las perlas superparamagnéticas resuspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene un mililitro de fosfato sódico 0,1 molar pH 7,4. A continuación, coloque el tubo en un soporte de separación magnética para separar las perlas magnéticas de la solución.

Deseche el sobrenadante y retire el tubo del soporte de separación magnética. Vuelva a suspender las perlas en un mililitro de fosfato de sodio 0,1 molar pH 7,4. Después de lavar las cuentas dos veces, vuelva a suspender las cuentas en un mililitro del mismo tampón.

A continuación, combine 100 microgramos de fibronectina bovina o cualquier otro ligando del receptor de adhesión celular a las perlas y al vórtice. Repita este paso reemplazando el ligando con BSA, poli-D-lisina o apotransferrina para controles negativos. Incubar las perlas con la solución que contiene ligando durante 12 a 24 horas a 37 grados centígrados en un rotor.

Si aparecen agregados de cordones después de que se haya producido la reacción, sonique durante no más de 10 a 20 segundos. A continuación, aísle las perlas con un soporte de separación magnética y aspire la solución restante. A continuación, añadir un mililitro de una solución de PBS suplementada con albúmina sérica bovina al 0,2%.

Incubar durante una hora en un rotor a 37 grados centígrados. Con un imán, lave las perlas con un mililitro de solución de PBS suplementada con albúmina sérica bovina al 0,2% dos veces. Antes de volver a suspenderlos en un mililitro del mismo tampón.

Sonicar las cuentas si los agregados no aparecen durante más de 20 a 30 segundos. Proceda a los ensayos de células o almacene las perlas a cuatro grados centígrados durante un máximo de un mes. Cultive las células adherentes en una placa de cultivo de tejidos de 60 mililitros en un medio de crecimiento adecuado hasta alcanzar el 80% de confluencia.

Después de peletizar las perlas recubiertas de ligando, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de solución de PBS suplementada con albúmina sérica bovina al 0,2%. Agregue 100 microlitros de la solución de perlas recubierta de ligando a cinco mililitros de medio de cultivo caliente y vórtice. A continuación, aspire el medio en una placa de cultivo de 60 mililitros y agregue cinco mililitros de medio de crecimiento tibio complementado con perlas.

Incubar la suspensión durante 20 minutos en condiciones de cultivo celular para permitir que las perlas se sedimenten y se adhieran a las células. Es crucial no exceder los 20 minutos, ya que las perlas pueden ser internalizadas por fagocitosis. A continuación, observe las cuentas bajo un microscopio óptico utilizando un objetivo de 10X o 20X.

Verifique la adherencia de las cuentas agitando ligeramente el plato para discriminar entre las cuentas adheridas y las flotantes. Coloque un imán redondo de neodimio de 38 milímetros en la cara superior de la tapa de una placa de cultivo normal de 60 milímetros y manténgalo en su lugar con dos imanes de neodimio más pequeños de 13 milímetros colocados en la cara inferior de la tapa. Incubar las células sometidas a tensión durante los puntos de tiempo y las condiciones de cultivo celular deseados.

Cambie la tapa del plato normal por una tapa con el imán. Dado que los imanes son muy poderosos, manipularlos con cuidado. Después del tratamiento, coloque el plato en hielo y aspire con cuidado todo el medio del plato.

Añadir 300 microlitros de tampón de lisis celular e incubar durante 10 minutos en hielo. A continuación, recoja el lisado con un raspador de células y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preenfriado. Granule las perlas magnéticas utilizando el soporte de separación magnética y transfiera el lisado total de la celda a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preenfriado.

Retire una alícuota de 15 microlitros del lisado celular total obtenido después de la separación de perlas para el análisis de Western blot. Lave las perlas tres veces con un mililitro de tampón de lisis helado. Luego, agregue 50 microlitros de tampón de muestra al pellet de perla.

Después de mezclar la suspensión por vórtice, hiérvala a 95 grados centígrados durante cinco minutos con un calentador de bloque seco. Esta fracción contiene los complejos de adhesión aislados. Proceda al análisis bioquímico o almacene la fracción a menos 20 grados centígrados.

Esta figura se muestra para demostrar la purificación de los complejos de adhesión. El inmunoblotting GAPDH se utiliza como control de carga para el lisado de células totales y para comprobar la pureza de los complejos de adhesión. Se utilizó una exposición prolongada para validar la ausencia de señal citoplasmática en la fracción del complejo de adhesión purificado.

Se utilizaron perlas recubiertas de fibronectina para investigar los procesos de mecanotransducción que ocurren con el tiempo en los complejos de adhesión en respuesta a la tensión. Después de la separación magnética de la fracción del complejo de adhesión, el lisado y la fracción del complejo de adhesión se analizaron mediante Western blot. El control de carga y los candidatos que se sabe que son reclutados o fosforilados en los complejos de adhesión en respuesta a la tensión mecánica fueron inmunotransferenciados.

Si bien la tensión no afectó el reclutamiento de paxilina a los complejos de adhesión, su fosforilación en tirosina 31 aumentó en respuesta a la tensión mecánica tanto en el lisado celular total como en la fracción del complejo de adhesión. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar fuerzas de tensión a las proteínas de la superficie de adhesión usando perlas magnéticas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tener cuidado con los potentes imanes. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar estudios bioquímicos como Western blots, ensayo de polimerización de actina o ensayo enzimático para responder preguntas adicionales como si la actividad de la quinasa está regulada por la tensión. Esta técnica puede ayudar a los investigadores en el campo de la biología celular a explorar las vías de señalización magnéticas sensibles en las células.