La reconstitución de los nucleosomas con histonas hermanas marcadas con isótopos diferencialmente

El objetivo general de este protocolo bioquímico es generar nucleosomas con histonas hermanas marcadas isotópicamente de manera diferencial para su uso en la localización de modificaciones postraduccionales simultáneamente en ambas histonas hermanas. El objetivo general de este protocolo bioquímico es generar nucleosomas con histonas hermanas marcadas isotópicamente de manera diferencial para su uso en la localización de modificaciones postraduccionales simultáneamente en ambas histonas hermanas.

Este método, en combinación con técnicas de alta resolución para mapear modificaciones postraduccionales, como en la espectrometría de masas, aborda preguntas clave en biología de la cromatina, como ¿qué mecanismos contribuyen a la formación de nucleosomas simétricamente modificados? La principal ventaja de esta técnica es que puede establecerse fácilmente en un laboratorio bioquímico, ya que combina protocolos estándar de reconstitución de nucleosomas con metodologías comunes de purificación de proteínas. Se utilizarán dos grupos de histonas H3 para la reconstitución del octámero.

Histona H3 marcada con nitrógeno-15 que contiene una etiqueta polihistidina en el extremo amino y histona H3 marcada con carbono-13 que contiene una etiqueta de afinidad por estreptavidina en el extremo amino. Inicie este procedimiento disolviendo los alícuotas de histonas liofilizadas, incluidos los dos tipos de histona H3, en tampón desnaturalizante. A cada tubo que contenga aproximadamente cinco miligramos de histonas, añada un mililitro de tampón desnaturalizante y mezcle por pipeteo, pero no use vórtex.

Mantenga los tubos en hielo durante 30 minutos para permitir la desnaturalización completa. A continuación, mida la absorbancia a 280 nanómetros para determinar la concentración exacta de cada histona. Mezcle las histonas centrales en proporciones molares iguales, teniendo en cuenta incluir 50 % de cada uno de los dos grupos de histonas H3.

Utilice tampón de desnaturalización para ajustar la concentración final de proteína a aproximadamente un miligramo por mililitro. Transfiera la mezcla a una membrana de diálisis con un límite de corte de seis kilodaltons. Y realice diálisis frente a uno o dos litros de tampón de replegamiento enfriado a cuatro grados Celsius.

Al día siguiente, recolecte el material dializado y elimine cualquier precipitado mediante centrifugación en un microcentrífugo durante cinco minutos a cuatro grados Celsius a velocidad máxima. Después de determinar la concentración del octámero, utilice una unidad de filtro centrífugo con un límite de corte de 10 kilodalton para concentrar el octámero hasta un volumen final de aproximadamente dos mililitros. Se debe obtener una concentración del octámero entre 50 y 100 micromolar.

Prepárese para la filtración en gel conectando la columna de filtración en gel a un sistema FPLC. Equilibre con dos volúmenes de columna, o CV, de tampón de replegamiento filtrado a 0,22 micrómetros y desgasificado. Inyecte el material concentrado a un flujo de un mililitro por minuto y recoja fracciones de uno a 1,5 mililitros.

Para comenzar este procedimiento, reúna las fracciones relevantes que contengan octámeros puros y determine la concentración como se describió previamente. Conecte una columna de ácido nitrilotriacético con níquel o columna NTA con níquel de un mililitro al sistema FPLC y equilibre con 10 CV de tampón de plegamiento, filtrado con 0,22 micrómetros y desgasificado, a un flujo de un mililitro por minuto.

Pase el octámero purificado a través de la columna de níquel NTA utilizando un flujo de un mililitro por minuto. Recolecte el flujo que atraviesa. Eluya con 10 CV de tampón de plegamiento que contenga 250 milimolares de imidazol, utilizando un flujo de un mililitro por minuto.

Recoger la elución de níquel NTA. La purificación basada en estreptavidina debería realizarse idealmente en una cámara fría. Equilibrar una columna de afinidad de un mililitro de estreptavidina comercial con 10 volúmenes de columna de tampón de plegamiento que contenga 250 milimolares de imidazol, utilizando un sistema por gravedad por lotes.

Pase la elución de NTA de níquel a través de la columna de afinidad por estreptavidina. Recolecte el flujo que atraviesa. Eluya con 10 CV de tampón de plegamiento que contenga 2,5 milimolares de destiobiotina.

Recolecte el eluato. Después de medir la concentración de octámero en el eluato, agregue una cantidad diez veces menor de proteasa TEV y deje que la reacción continúe durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, transfiera la mezcla a una membrana de diálisis con un límite de corte de 50 kilodalton y realice la diálisis frente al tampón de plegamiento durante la noche a cuatro grados Celsius.

Concentre el octámero asimétrico purificado utilizando una unidad de filtro centrífugo con corte de 10 kilodalton hasta un volumen de uno a dos mililitros. Se espera que la concentración del octámero sea de 20 a 50 micromolar. La reconstitución del nucleosoma requiere ADN que contenga una secuencia de posicionamiento de nucleosomas.

Ajuste la concentración de sal del ADN a dos molar de cloruro de sodio utilizando una solución stock de cloruro de sodio cinco molar. Mezcle el ADN con el octámero y el tampón de plegamiento utilizando la relación óptima de octámero respecto al ADN determinada en una prueba a pequeña escala. Añada el octámero al final para evitar cualquier posibilidad de mezclar el octámero y el ADN a una concentración de sal inferior a dos molar.

Transfiera la mezcla a una membrana de diálisis con un punto de corte de seis kilodaltons y realice la diálisis frente a un litro de tampón de plegamiento durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, reduzca la concentración de sal del tampón de diálisis de manera escalonada. Mantenga la muestra en cada tampón de cloruro de sodio durante al menos tres horas.

A continuación, transfiera la membrana de diálisis a un vaso de precipitados con un litro de tampón de ensayo y continúe la diálisis durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, recoja la muestra dializada. Elimine cualquier precipitado formado mediante centrifugación en un microcentrífugo durante cinco minutos a cuatro grados Celsius a velocidad máxima.

Concentre la muestra utilizando una unidad de filtro centrífugo con corte de 30 kilodalton hasta un volumen final de aproximadamente 300 microlitros. Mida la concentración de ADN a 260 nanómetros. La concentración final debe estar en el rango de 10 a 20 micromolar.

Almacene la muestra a cuatro grados Celsius durante varias semanas como máximo. Un perfil de elución por filtración en gel de la mezcla de histonas plegadas muestra que los octámeros de histonas eluyen a aproximadamente 70 mililitros. Un gel de electroforesis SDS-PAGE muestra la estequiometría correcta de las histonas.

El grupo octamérico reconstituido que contiene los tres tipos de octámeros se somete a un esquema de purificación por afinidad en tándem. El aislamiento de las especies asimétricas se verifica mediante la presencia de la etiqueta de afinidad. Posteriormente, las etiquetas de afinidad se eliminan con la proteasa TEV.

Una reconstitución de nucleosomas a pequeña escala utilizando diferentes relaciones molares de ADN respecto al octámero mostró que una proporción de uno a uno era óptima. Se realizó una reconstitución de nucleosomas a gran escala utilizando la relación molar optimizada de ADN respecto al octámero, y se observó la estequiometría correcta de las cuatro histonas centrales. La espectroscopía de RMN de nucleosomas marcados isotópicamente de forma diferencial confirmó la presencia de histonas H3 hermanas marcadas con nitrógeno-15 y carbono-13.

En este ejemplo de aplicación, se hicieron reaccionar nucleosomas que fueron marcados isotópicamente de forma diferencial y fosforilados asimétricamente en el anillo C 10 de la histona H3 con la acetiltransferasa GCN5. Y se siguió en tiempo real mediante espectroscopía de RMN la acetilación del lisina 14 de la histona H3 en ambas copias de H3. El análisis reveló que la fosforilación del anillo C 10 de la histona H3 estimula la acetilación del lisina 14 de la histona H3 por GCN5 en cis en comparación con en trans.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco días si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo reconstituir nucleosomas que contengan histonas hermanas con características diferentes.