Determinación de la potencia relativa de un Anti-TNF Anticuerpo Monoclonal (mAb) por neutralizante utilizando un método de bioanalítica In Vitro TNF

El objetivo general de este procedimiento es medir la potencia relativa de las moléculas de anti-TNF-alfa. En este ejemplo, comparamos dos anticuerpos monoclonales anti-TNF-alfa para determinar la eficiencia de neutralización de un mAb de referencia frente a un mAb de muestra bajo investigación. Este tutorial muestra pasos detallados para la determinación de la potencia de neutralización del TNF-alfa, que no están incluidos en la literatura.

Las células pueden verse estresadas por diferentes factores ambientales, por ejemplo, la inanición. Cada célula tiene diferentes proteínas en su superficie llamadas receptores. Algunos de ellos son específicos para la citoquina TNF-alfa.

Cuando esta molécula interactúa con su receptor y se desarrolla una señal específica, esta señalización combinada con un factor de estrés ambiental sufre una muerte celular programada llamada apoptosis. Sin embargo, en presencia de una molécula anti-TNF-alfa que puede ser un anticuerpo monoclonal, la citocina puede ser valorada por el mAb, sometiéndose a un proceso de neutralización que ayuda a las células a sobrevivir. Por lo tanto, bajo una metodología estandarizada, se puede medir la fuerza de neutralización de una molécula.

Este protocolo se realiza actualmente durante cinco días. El primer día se deben preparar soluciones para el cultivo celular. Además, las células WEHI 164 se descongelarán y subcultivarán.

En el segundo y tercer día, se debe verificar la confluencia de las células. Después de este paso, las células deben separarse, contarse, ajustarse la densidad celular y, finalmente, las células deben cultivarse nuevamente. Todos estos pasos deben realizarse todos los días.

Al cuarto día, la concentración de mAb debe determinarse por absorción de UV y se deben realizar diluciones de anticuerpos. Se prepararán soluciones de inducción de la apoptosis. Y, por último, la densidad celular de las células WEHI 164 debe ajustarse a medio millón de células por ml.

Al quinto día, se preparará la solución de sustrato para la detección de células apoptóticas y se realizará el análisis espectrofotométrico. Finalmente, se discutirá el análisis in silico de los resultados. Todas las soluciones empleadas en este protocolo se muestran en esta diapositiva.

El primer día, esta solución debe prepararse previamente a la ejecución del protocolo, a excepción de las soluciones de inducción de apoptosis y sustrato, que deben usarse inmediatamente después de la reconstitución. Al comienzo de este protocolo, las células congeladas deben retirarse del contenedor de nitrógeno líquido. Este vial con células WEHI congeladas debe mantenerse en hielo hasta su uso.

Mantenga su lugar de trabajo limpio e higienizado previamente para ejecutar cualquier actividad con el fin de evitar la contaminación cruzada. Transfiera la gradilla de isoterma a la campana de flujo laminar y dispense nueve ml de medio de cultivo precalentado en un tubo estéril de 15 mililitros. Con un ml de medio de cultivo precalentado, lave las células WEHI 164 para un pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo hasta que las células congeladas se desprendan del microtubo.

Mezclar por inversión cinco veces hasta que las células congeladas se descongelen por completo. A continuación, centrifugar las células a 125 g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y disgrege la pastilla de celda.

Agregue cinco mL del medio de cultivo precalentado al tubo y mezcle la suspensión hasta que las células se resuspendan por completo. Recuperación de células en un matraz de cultivo T. E incubar durante la noche a 37 grados centígrados y el dióxido de carbono al 5%Cada día antes de separar, contar las células de cultivo, es obligatorio verificar la salud del cultivo bajo el microscopio.

El investigador debe verificar la salud celular, la viabilidad y la densidad celular para el subcultivo. Esta verificación debe realizarse también para el ensayo biológico. En primer lugar, se debe verificar, la ausencia de contaminación biológica, por ejemplo, bacterias.

En segundo lugar, la salud celular se puede verificar por confluencia. Una confluencia superior al 90% es suficiente para lograr buenos resultados. Sin embargo, si las células no han alcanzado la densidad celular deseada, el matraz debe devolverse a la incubadora y esperar hasta que las células hayan alcanzado la densidad celular y la confluencia deseadas.

El medio de cultivo envejecido debe retirarse del matraz T. Lave las celdas adheridas en las paredes del matraz T con cinco ml de la solución de lavado de celdas. Tenga cuidado de no quitar las células adheridas.

Mezclar manualmente para eliminar los residuos del medio de cultivo y los restos de células. Este paso debe ejecutarse dos veces. Retire las soluciones de lavado residuales con vacío y agregue tres ml de la solución de desprendimiento de celdas.

Agitar e incubar durante tres minutos. Una vez finalizada la incubación, se añade un medio de cultivo precalentado al matraz T para inactivar la enzima. Y recuperar células.

Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifuga. Identifique la célula y deseche el sobrenadante. La eliminación del medio de cultivo envejecido es fundamental para el cultivo de células sanas.

Desagregar el pellet celular y reconstituir las células con cinco mL del medio de cultivo precalentado. Transfiera 50 microlitros de la suspensión celular a un microtubo. Cuente las células mediante el método de exclusión de azul tripano.

Contar las células y determinar la viabilidad de las células. Una vez que tenga el número de células viables, ajuste 15 mL del medio de cultivo a una densidad celular de medio millón de células por mL utilizando la siguiente fórmula. Transfiera 15 mL de la suspensión celular ajustada en un matraz de cultivo T e incube durante la noche.

Este proceso general de cultivo debe repetirse al menos una vez más durante un total de tres pasajes celulares antes de comenzar el ensayo de neutralización. Al cuarto día, mida la densidad óptica de la sustancia de referencia, la muestra analítica y la muestra de control por absorción UV a 280 nanómetros. Realizar una dilución inicial a dos miligramos por mL con medio de cultivo de ensayo para cada muestra por triplicados independientes.

Ejecute una segunda dilución hasta dos microgramos por ml para cada muestra de mAb. Dispense 75 microlitros del medio de cultivo del ensayo a los 60 pocillos presentes en el centro de una microplaca de poliestireno. Añadir 230 microlitros de sustancia de referencia en los pocillos 2B y 2C.

Muestras analíticas en los pozos, 2D y 2E. Y por último, la muestra de control en los pozos, 2F y 2G. Una muestra de control es una molécula que tiene una potencia relativa conocida.

A continuación, realice diluciones en serie en la microplaca. En las siguientes diapositivas se muestra un ejemplo. Recuerde mezclar las soluciones previamente para dispensar en los pocillos.

Esta operación es fundamental para el éxito de este protocolo. Ajustar previamente a medio millón de células por mL a un dosificador. Agregue 50 microlitros de suspensión celular a los 60 pocillos internos de la placa de ensayo, comenzando desde la columna dos hasta la undécima.

Mezcle previamente la suspensión celular para agregar líquido a la microplaca. Transfiera inmediatamente 50 microlitros de las diluciones de mAb a la placa de ensayo. En el caso de los carriles emparejados, dispense las diluciones girando la micropipeta.

Las diluciones de mAb se pueden dispensar en los pocillos en el siguiente orden, los controles se pueden dispensar en los pocillos circundantes. Diluir TNF-alfa con 500 microlitros de agua ultrapura. Mezclar por mezclador de vórtice a 2200 rpm.

Transfiera a un tubo de 15 mL y finalmente, diluya a 40 nanogramos por mL con medio de cultivo de ensayo. Dispensar 50 microlitros de la solución de inducción de apoptosis en los 60 pocillos de ensayo internos. Dispensar 50 microlitros de la solución de inducción de apoptosis en los 60 pocillos de ensayo internos.

Por último, incubar durante 16 horas. Al quinto día, reconstituya el sustrato con esta solución tampón como se indica en las instrucciones del fabricante. Mezclar invirtiendo cinco veces.

Dispense la solución de sustrato. Y agregue 50 microlitros de la solución de sustrato a cada pocillo de muestra en la placa de ensayo. Agregue también sustrato a los controles.

Agite la placa de ensayo en un mezclador de vórtice a 400 rpm durante tres minutos. Saque la placa de ensayo del mezclador e incube a temperatura ambiente. Encienda un lector de placas-espectrofotómetro.

Abra el software SoftMax Pro o cualquier programa equivalente. Cargue la microplaca en el espectrofotómetro y ajuste los siguientes parámetros. Active la función de luminiscencia y la función Leer tipo en punto final.

Ajuste el área de lectura, excluyendo las columnas uno y 12. Seleccione el Tipo de placa en Microplaca de fondo transparente estándar de 96 pocillos. Modifique el tiempo de integración hasta 1250 milisegundos.

Ajuste el tiempo de agitación de la microplaca a 10 segundos. Seleccione el pocillo en el que se colocará la sustancia de referencia, la sustancia analítica y la muestra de control. Empieza a leer.

Los resultados de este ensayo son las curvas de respuesta expresadas en luminiscencia en comparación con las escalas logarítmicas de la concentración de mAb. Los puntos de inflexión de estas curvas son las concentraciones efectivas, EC50 para cada mAb. C o EC50 se expresa en nanogramos por mL.

Sin embargo, este valor no tiene significado por sí mismo, si no se compara con la muestra de referencia. Por lo tanto, la potencia de una muestra analítica se expresa en porcentaje y se denomina potencia relativa. La potencia relativa es el promedio de los resultados de tres microplacas independientes que proviene del valor EC50 de cada placa.

La comparación entre las muestras de control y las muestras de referencia ayuda a determinar cualquier desviación o sesgo en el ensayo actual. La comparación de la muestra de referencia con una muestra analítica ayuda a determinar la potencia relativa. Esta tabla muestra la potencia relativa de los mAbs y su intervalo de confianza al 95%Además, muestra la desviación estándar relativa de cada muestra relacionada con la potencia de la sustancia de referencia.

La desviación estándar relativa superior al 15% se considera inaceptable. Esta caracterización ayuda a determinar, a priori, el comportamiento biótico de una molécula que está en desarrollo antes de realizar ensayos clínicos costosos y lentos. También es útil para la liberación de lote a lote de un producto aprobado.

Determinamos que estos ensayos son útiles para determinar si una molécula tiene un efecto biológico adecuado en cuanto a su mecanismo de acción. Como parte de los métodos biofísicos, esta metodología es capaz de determinar por medios biológicos la potencia y la eficacia de la calidad y los atributos de un medicamento, mostrando así una significación completa y plena de sus funciones efectoras.