Name: Determinación de la potencia relativa de un Anti-TNF Anticuerpo Monoclonal (mAb) por neutralizante utilizando un método de bioanalítica In Vitro TNF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 7 s
Description: Aprende a determinar la potencia relativa de anticuerpos monoclonales anti-TNF alfa mediante un ensayo de neutralización in vitro con células WEHI 164. Este método cuantifica la eficacia de neutralización comparando un anticuerpo de referencia con muestras analíticas.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de ciencia y tecnología (CONACYT), México otorgar PEI CONACYT 2015 220333, sin participación en el diseño del estudio.

1. preparación de las soluciones y los medios de comunicación <ol><li>preparar el medio de cultivo: RPMI-1640 con 10% FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Preparar medio de cultivo de ensayo: RPMI-1640 sin rojo de fenol con 1% FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Preparar la solución de lavado celular: solución de DPBS libre de Ca y Mg con EDTA 0.02%, pH 7,4.</li>
	<li>Preparar la solución de separación celular: tripsina 0,125% con EDTA 1 mM.
	<ol><li>Descongelar 100 mL de una solución al 0,25% de tripsina-EDTA y transferir a un matraz de 500 mL estéril.</li>
		<li>Mezcla con 100 mL de célula solución de lavado y dispensa alícuotas de 15 mL en tubos estériles de 15 mL. Almacenar a -70 a-80 ° C hasta su uso.</li>
		<li>Filtro de estas soluciones a través de una membrana de 0.22 μm y caliente a 37 ° C durante al menos 30 minutos antes de usar.</li>
	</ol></li> <li>Prepare apoptosis-inducción solución solución TNFα a 3,3 μg/mL.
	<ol><li>Disolver 20 μg de TNFα con 500 μl de agua filtro esterilizados en su envase primario y mezcle hasta disolución completa.</li>
		<li>Transferir a un tubo de 15 mL estéril y agregar 5,5 mL de DPBS libre de Ca y Mg solución a este tubo. Mezclar suavemente con un mezclador de tipo vórtex.</li>
		<li>Alícuota de la solución en 70 porciones μl. Dispense cada alícuota en microtubos de 0.5 mL y conservar a -80 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Preparar solución de inducción a apoptosis: solución TNFα en 40 ng/mL.
	<ol><li>Descongele una alícuota de la solución madre inducción de apoptosis, incubar en un baño de agua a 25 ° c durante 10 minutos</li>
		<li>Diluir la solución madre de inducción de apoptosis a 40 ng/mL mediante la adición de 61 μl de 3.3 μg/mL de solución de TNFα a 4,939 mL de medio de cultivo de ensayo en un tubo estéril de 15 mL.</li>
		<li>Mix de vórtex durante 10 s; esta solución debe ser preparada recientemente antes de su uso.</li>
		<li>Calentar la solución a 37 ° C durante al menos 30 minutos antes de utilizar en análisis de eneutralization th.</li>
	</ol></li> <li>Preparación de la solución sustrato: caspasas 3/7 Glo solución 7 , 8.
	<ol><li>Descongelar el caspasa tampón (tampón de Glo de caspasas 3/7) 12 h antes de su uso.</li>
		<li>Dejó el tampón de caspasas y el sustrato (sustrato de Glo de caspasas 3/7) sentarse por separado a 25 ± 5 ° C por 30 min antes de la mezcla de.</li>
		<li>Transferir 10 mL de la solución tampón de caspasa al substrato vial y mezclar por inversión.</li>
		<li>Mantener a 25 ± 5 ° C, protegido de luz hasta uso. 
		Nota: La solución es estable por 6 horas a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li></ol> 2. Cultivo y recuento de células <ol><li>celular descongelar y el primer subcultivo.
	<ol><li>Retire un vial de células WEHI 164 9 de un congelador a-80 ° c y transferirlos a un baño de hielo.</li>
		<li>Pipeta hacia arriba y hacia abajo con 1 mL de medio de cultivo previamente calentado hasta que las células congeladas descongelación completamente.</li>
		<li>Distribuir 9 mL de medio de cultivo previamente calentado en un tubo estéril de 15 mL.</li>
		<li>Transferir la suspensión de células en el tubo de 15 mL estéril y mezclar suavemente cinco veces por inversión.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión celular en 125 x g durante 3 min descartar el sobrenadante y separar el sedimento celular.</li>
		<li>Añadir 5 mL de medio de cultivo en el tubo. Mezclar hasta que las células son suspendidas completamente.</li>
		<li>Para el recuento celular, transferir 50 μl de la suspensión de células a un 500 μl microtubo y mezclar con 50 μl de azul de tripán de 0,4%. Contar las células y ajuste a 0,5 x 10 6 células/mL. Consulte el paso 2.2, por debajo de.</li>
		<li>Añadir 13 mL de medio de cultivo precalentada a un matraz de cultivo celular de 75 mL.</li>
		<li>Distribuir suficiente volumen de suspensión celular de paso 2.1.6 para alcanzar 0,5 x 10 6 células/mL en el frasco de cultivo celular e incubar a 37 ° C y 5% CO 2 durante la noche.</li>
	</ol></li> <li>Conteo celular. 
	Nota: Ver referencia 10.
	<ol><li>Usando la solución del paso 2.1.6, transfiera 0.05 mL a un hemocitómetro y determinar la densidad de células en un microscopio mediante exclusión del azul tripán.</li>
		<li>Cuantificar el número total de células viables y.</li>
		<li>Ajustar las suspensiones celulares a 0,5 x 10 6 células/mL. 
		Ecuación 1 
		V medio de cultivo (mL) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55376/55376eq1.jpg" /> V medio de cultivo (mL) = (5 mL - V suspensión de la célula) V medio de cultivo (mL) = volumen ajustado de WEHI 164 suspensión de la célula NVC = número de células viables/mL: WEHI 164 V medio de cultivo (mL) = volumen de medio de cultivo de ensayo añadido a la suspensión de células para alcanzar 0,5 x 10 6 células/mL 0.5 x 10 6 = densidad celular de destino</li>
	</ol></li> <li>Celular la separación y el segundo y tercer subcultivo. 
	Nota: Un sistema de vacío puede utilizarse para eliminar las soluciones de los frascos. Pueden utilizarse pipetas estériles desechables o de vidrio. Si la pipeta tiene una obstrucción de algodón en la parte superior, debe ser retirado antes de su uso.
	<ol><li>Retire el medio de cultivo de cultivo celular frasco de T utilizando una pipeta estéril 1 mL y un vacío de.</li>
		Solución <li>dispensar 5 mL de lavado de células en la cultura T-frasco, mezclar suavemente y deseche la solución. Repita este paso dos veces. 
		Nota: El retiro completo del medio de cultivo es fundamental para la separación eficiente celular.</li>
		<li>Añadir 15 mL de solución de la separación de células T-matraz y dejar reposar 3 minutos en una incubadora a 37 ° C y 5% CO 2.</li>
		<li>Verificar la ausencia de células adjuntas en la pared interna del frasco bajo el microscopio. Eliminar las células de la cultura T-matraz con una pipeta estéril de 20 mL y dispensar en un tubo estéril de 50 mL.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión celular en 125 x g durante 3 min descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado con otros 5 mL de medio de cultivo.</li>
		<li>Contar las células y añadir suficiente medio de cultivo para alcanzar la concentración deseada de la célula según la ecuación 1.</li>
		<li>Añadir esta suspensión a 72 cm 2 frasco de T e incubar durante la noche a 37 ° C y 5% CO 2.</li>
		<li>Subcultivo de las células por lo menos dos veces antes de usarlos en la neutralización ensayo. Repita los pasos 2.3.1-2.3.8 para los próximos dos días.</li>
	</ol></li> <li>Ensayo de suspensión celular.
	<ol><li>Seleccionar un WEHI 164 subcultura que tiene por lo menos tres pasadas. Consulte el paso 2.1.</li>
		<li>Separar y contar las células siguiendo pasos 2.2 y 2.3 del presente Protocolo.</li>
		<li>Diluir la suspensión de células según la ecuación 1 a 0,5 x 10 6 células/mL.</li>
		<li>Utilice esta suspensión celular para el ensayo de neutralización. Mezclar todo suspensiones celulares por antes del Mezclador vortex uso.</li>
	</ol></li></ol> 3. Anticuerpo y diluciones <ol><li>cuantificación de los mAbs.
	<ol><li>Determine la concentración de sustancia de referencia, muestras control y analítica muestra a través de la absorción UV a 280 nm usando su extinción masiva coeficiente (1.39) 11. 
		Nota: Original concentraciones podrían tomarse de las etiquetas del producto de droga. Sin embargo, esto debe ser verificado por absorción UV.</li>
	</ol></li> <li>mAb diluciones.
	<ol><li>Diluir todas las muestras independientemente por triplicado, con solución de DPBS libre de Mg y Ca en microtubos de 2 mL, hasta 2 mg/mL. Para confirmar esta concentración absorción de UV por triplicado, utilizando solución DPBS libre de Ca y Mg como el blanco.</li>
		<li>Mezclar las soluciones de proteínas comunes para 5 s usando un mezclador de tipo vórtex.</li>
		<li>Diluir 100 μl de cada solución de 2 mg/mL mAb con 0,9 mL de medio de cultivo análisis.</li>
		<li>Mezcla para 5 s por mezclador de tipo vórtex. 
		Nota: Estas soluciones tienen una concentración de 200 μg/mL. Las diluciones deben hacerse para cada triplicado.</li>
		<li>Diluir 10 & #181; L de cada solución de mAb de 200 μg/mL con 0,99 mL de medio de cultivo de ensayo. Mezcla de 5 s, utilizando un mezclador de tipo vórtex. Estas soluciones tienen una concentración de 2 μg/mL. Realizar diluciones seriadas de cada triplicado antes de utilizar en el ensayo de neutralización.</li>
		<li>Hacer anti-TNFα mAb diluciones en tres microplacas independiente. Hacer un duplicado de cada triplicado independiente y les dispensan en una microplaca, tal como se indica en la tabla 1. Sustancia de referencia < tabla fo:keep-together.within-página = «1» fo:keep-con-next.within-página = "siempre" fo:text-align = "center" &gt; <tbody><tr><td colspan="2"> plato 1</td> <td colspan="2"> plato 2</td>
					<td colspan="2"> placa de 3</td></tr>
				<tr>De <td>pozos</td> de <td>pozos</td> <td>muestra</td> <td>pozos</td> <td>muestra</td> <td>muestra</td></tr>
				<tr><td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> sustancia de referencia</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> Control muestra</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> muestra analítica</td></tr>
				<tr><td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td></tr>
				<tr><td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> muestra analítica</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> sustancia de referencia</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> ejemplo de Control de</td></tr>
				<tr><td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td></tr>
				<tr><td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> Control muestra</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> muestra analítica</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> sustancia de referencia</td></tr>
				<tr><td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td></tr></tbody>
		</table> Tabla 1: matrices de muestras microplacas. Un ensayo de neutralización completa debe realizarse en tres microplacas dentro de coordenadas B2 G11. Al azar de referencia, análisis y muestras de control permiten a los investigadores a verificar cualquier sesgo en el análisis.</li>
		<li>Realizar diluciones de mAb de cada referencia, la muestra o control, como se muestra en la tabla 2. 
		Nota: Las concentraciones de mAb anti-TNFα que se describe en esta tabla no son las concentraciones finales en el ensayo de neutralización.
		<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>Columna de placa de</td> <td>medio de cultivo de volumen del ensayo (μL)</td> <td>volumen de la sustancia de referencia, análisis de la muestra o Control Muestra (uL)</td> <td>la concentración en la placa de ensayo (ng/mL)</td></tr> <tr><td>2</td> <td>0</td> <td>230</td> <td>2000</td></tr> <tr><td>3</td> <td>150</td> <td>150 de línea 2</td> <td>1000</td></tr>
				<tr><td>4</td> <td>75</td> <td>75 de la línea 3</td> <td>500</td></tr> <tr><td>5</td> <td>100</td> <td>50 de la línea 3</td> <td>333</td></tr> <tr><td>6</td> <td>75</td> <td>75 de la línea 4</td> < td &gt; 250</td></tr> <tr><td>7</td> <td>75</td> <td>75 de la línea 5</td> <td>166</td></tr> <tr><td>8</td> <td>75</td> <td>75 de la línea 6</td> <td>125</td></tr> <tr><td>9</td> <td>75</td> <td>75 para línea m 7</td> <td>83</td></tr> <tr><td>10</td> <td>75</td> <td>75 de la línea 9</td> <td>41</td></tr> <tr><td>11</td> <td>150</td> <td>75 de línea 10</td> <td>13</td></tr></tbody></table> T 2 capaz: diluciones de mAb Anti-TNFα. Diluciones seriadas de mAbs anti-TNFα se han demostrado en esta tabla. Concentraciones finales descritas en esta tabla no son las concentraciones en el ensayo, donde mAbs anti-TNFα se diluyeron por un factor de 3 (dilución mAb + medio de cultivo + suspensión de células). Las líneas en negrita representan las diluciones de las líneas 3, 5, 7, 9 y 10; no en negrita las líneas representan la dilución de las líneas 3, 4 y 6. Estas diluciones seriadas se realizan justo antes de realizar el ensayo de neutralización. Debe tener cuidado al mezclar mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo tres veces antes de preparar las diluciones.</li>
		<li>No las placas a 25 ± 5 ° C hasta su uso.</li>
	</ol></li></ol> 4. Ensayo de neutralización con las células WEHI 164 <ol><li>mezclar con un vórtex todos celular suspensiones (0,5 x 10 6 células/mL) antes de la dispensación en cualquier paso de este protocolo de. 
	Nota: En esta sección, caliente cada solución a 37 ° C por 30 min antes del uso.</li>
	<li>Transferir 50 μl de la suspensión celular en cada uno de los 60 pocillos de microplacas, pasar de la columna 2 a la 11 y la línea B a G.</li>
	<li>Transferir 50 μl de control, muestra y referencia de mAb diluciones en microplacas. Sigue el patrón representado en la figura 1.</li>
	<li>Añadir 50 μl de la solución de la inducción de apoptosis a cada pocillo.</li>
	Células <li>controles celulares de 50 μl de WEHI 164, dispensadas en tres pozos. Traer cada bien a un volumen final de 150 μL con medio de cultivo de ensayo.</li>
	<li>Utilizar un control de la citotoxicidad de una mezcla de 50 μl de células WEHI 164 más 50 μl de solución de la inducción de apoptosis. Traer cada bien a un volumen final de 150 μL con medio de cultivo de ensayo.</li>
	<li>Control para el TNFα, usar 50 μl de la solución de la inducción de apoptosis y llevarlo a 150 μL con el medio de cultivo análisis.</li>
	<li>Para el espacio en blanco, utilice 150 μL de medio de cultivo de ensayo solo.</li>
	<li>Llenar los pozos restantes con 150 μL de medio de cultivo para evitar efectos de evaporación placa.</li>
	4.1.1-4.1.9 <li>Repita los pasos dos veces en dos otras microplacas. 
	Nota: Las concentraciones finales de mAb en las microplacas son: 0.666, 0.333 0.167, 0.111, 0.083, 0,056, 0.042, 0.028, 0.014 y 0.004 μg/mL.</li>
	<li>Cargar las muestras en microplacas, tal como se indica en la figura 1. 
	<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig1.jpg" /> figura 1: disposición de muestras en las placas de ensayo. B1 a la G11 son coordenadas bien en las microplacas y describir las posiciones donde se colocan las diluciones de la muestra. Coordenadas que faltan son los pozos llenados de controles y análisis de medio de cultivo (A1-A12 y H1 H12). Esta distribución al azar de muestras (diluciones de avance y retroceso en las microplacas) ayuda a eliminar el sesgo en los resultados debido a la evaporación del medio o de otras variables. Es mejor que cada microplaca es hecho por un analista en un momento. R:, S: contramuestra, CS: ejemplo de control, Dil: dilución. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig1large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a></li>
	<li>Incubar las tres placas a 37 ° C y 5% CO 2 para 16 ± 2 h.</li>
	<li>Déjelo el reactivo de Glo de caspasas 3/7 a 25 ± 5 ° C por 30 min antes de su uso.</li>
	<li>Agregar 100 μl de este reactivo en todos los pocillos, incluyendo los controles y las muestras de.</li>
	<li>Agitar las placas usando un mezclador de tipo vórtex de microplacas durante 3 min a 25 ± 5 ° C inmediatamente después de dispensar en los pocillos.</li>
	<li>Incubar las placas de 2.5 ± 0.5 h a 25 ± 5 ° C, protegido de la luz.</li>
	<li>Colocar el micrófonoroplates en el luminómetro y completar la sección siguiente.</li>
</ol> 5. Análisis de resultados <ol><li>usando un software para detección de luminiscencia, seleccionar la función de modo y punto final de la luminescencia.</li>
	<li>Seleccionar un fondo claro de 96 pocillos de la placa y sus 80 pozos internas, excluyendo las columnas 1 y 12.</li>
	<li>Seleccionar un tiempo de integración de 1.250 ms y 10 s para mezclar la microplaca antes de leer.</li>
	<li>Seleccionar los pozos donde sustancia de referencia, sustancia analítica muestra de control se colocará y se identifican con sus correspondientes concentraciones de.</li>
	<li>Leer las muestras en microplacas con el luminómetro.</li>
	<li>Utilizar una cuarta ecuación del parámetro para el análisis de resultados. Gráfico de una curva dosis-respuesta, como se muestra en la figura 2. 
	<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig2.jpg" /> figura 2: curva dosis-respuesta. Se representa la concentración de mAb anti-TNFα versus luminiscencia (viabilidad celular). Una cuarta ecuación de parámetro que describe la protección anti-TNFα de mAbs se utilizó como modelo. EC50 es la concentración de mAb que puede neutralizar la cantidad de TNFα que causan la muerte celular 50% en cada análisis, ejemplificado en la gráfica como el cambio en la pendiente. Barras de describen la desviación estándar de luminiscencia para cada concentración de mAb. x representa la concentración de Ab anti-TNFα y es representado como una función logarítmica en ng/mL, mientras que y representa la respuesta de luminiscencia en unidades arbitrarias de la luminescencia. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig2large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
	Nota: En la cuarta ecuación de parámetro, C es la concentración efectiva 50 (CE50). Este valor se utilizará para comparar la sustancia de referencia analítica muestra y ejemplo de control mediante la función effector.</li>
	<li>Para el cálculo de las potencias relativas, arreglar la sustancia de referencia a 100% y calcular las potencias de la muestra y control por consiguiente. 
	Nota: Estos valores son representados en la figura 3. 
	<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig3.jpg" /> figura 3: ecuación matemática utilizada para el cálculo de la EC50s y sus valores. Valores de EC50 o los parámetros C, tienen su incertidumbre como error estándar. También se muestra una comparación de EC50s entre los resultados de la muestra y la referencia de potencia relativa. Se calcula el intervalo de confianza con un α = 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig3large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a></li>
</ol>

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<li>Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+sensitization+to+TNF-induced+apoptosis+by+acute+glutathione+depletion+in+murine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes.</a> Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).</li>
<li>Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+TNF+cytokine+neutralization+with+a+vNAR+from+Heterodontus+francisci+shark%3A+a+potential+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use.</a> mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Esta caracterización ayuda a determinar a priori el comportamiento biológico de una molécula en desarrollo antes de que se llevan a cabo ensayos clínicos costosos y desperdiciadores de tiempo. También es útil para la liberación de lote a lote de un producto de droga aprobado. Cabe destacar que estos análisis son útiles para determinar si una molécula tiene un efecto biológico adecuado en cuanto a su mecanismo de acción. El método bio-analítico presentado en este tutorial es muy importante que la comparación de m...

Potencia biológica es la medida cuantitativa de la actividad biológica basada en los atributos del producto ensayado que están vinculados a las propiedades biológicas pertinentes, considerando que la cantidad (expresada en masa) es una medida fisicoquímica del contenido de proteínas. Pruebas de potencia, junto con otras metodologías analíticas, se realizan como parte de estudios de comparabilidad, la estabilidad y la conformidad del producto. En este sentido, las mediciones de potencia se utilizan para demostrar que los lotes de producto cumplen los atributos de calidad críticos (CQAs) o criterios de aceptación durante todas las fases de ensayos clínicos y después de la aprobación del mercado.
La apoptosis es muerte celular programada, que naturalmente ocurre cuando las células se infectan con un virus o cuando las células son tensionadas por un medio ambiente factor compromisos celular viabilidad y función1,2. Entre otros, inhibición de la apoptosis, o neutralización biológica, es uno de los mecanismos terapéuticos principalmente conocidos de mAbs, particularmente en el tratamiento de enfermedades crónicas, como trastornos inflamatorias inmune-mediada. Moléculas anti-TNFα ejercen sus propiedades terapéuticas mediante el bloqueo de la interacción del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) con el p55 y el p75 celular receptores de la superficie3, evitando vías de señales que finalmente conducen a la apoptosis celular.
TNFα puede producir inflamación en las enfermedades crónicas4. TNFα es secretada cifra en el medio extracelular por los macrófagos, que son los centinelas del sistema inmune innato y los principales actores en este tipo de enfermedad5. Como un camino común, desregulación del TNFα se asocia con la patogenia de estas enfermedades. Sin control y bajo inducción constante y estrés celular, TNFα induce la degeneración de tejido y muerte celular, en última instancia conducen a la artritis reumatoide, enfermedad de Crohn y otros perfiles patológicos6.
Antagonistas del TNF que bloqueen la interacción entre TNF y sus receptores se han utilizado cada vez más como una terapia eficaz para reducir la sintomatología y dificultar la progresión de estas enfermedades. En la actualidad, medicamentos anti-TNFα son ampliamente utilizados para el control de la concentración sistémica de esta citoquina, además evitando la degeneración de los tejidos involucrados. En este sentido, es imprescindible proporcionar una prueba reproducible y robusto para describir la capacidad específica de un fármaco para lograr su efecto biológico.
En este protocolo, crítico pasos identificados durante el desarrollo de un ensayo de neutralización-para la medida acertada de la potencia biológica destacan, con particular énfasis en las habilidades necesarias para ejecutar el método bio-analíticos. Este método bio-analítica proporciona información útil comparabilidad entre diferentes lotes o anti-TNFα medicamentos en comparación con una sustancia de referencia clínicamente probado.

<table><tbody><tr><td>WEHI 164</td><td>ATCC</td><td>CRL-1751</td><td>Células de fibrosarcoma de Mus musculus</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medio</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td>Almacene el medio a 2 & grados; C a 8 &deg; C</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio, sin rojo fenol</td><td>GIBCO</td><td>11835-030</td><td>Almacene el medio a 2 & grados; C a 8 &deg; C</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0.25%),rojo fenol</td><td>GIBCO</td><td>25200-056</td><td>Almacene el medio a -10 & grados; C a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>GIBCO</td><td>14190-136</td><td>Almacene el medio a 2 & grados; C a 8 &deg; C</td></tr><tr><td>Proteína TNF-alfa humana recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-020</td><td>Tienda a -20 &deg; C a -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (EE. UU.), IgG súper baja</td><td>HyClone</td><td>SH3089803</td><td>almacenar a -10 & grados; C a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (EE. UU.), caracterizado</td><td>HyClone</td><td>SH3007103</td><td>almacene a -10 &deg; C a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Caspasa-Glo 3/7 Kit de ensayo</td><td>Promega</td><td>G8093</td><td>Almacene el sustrato Caspasa-Glo. 3/7 y el tampón Caspasa-Glo. 3/7 en &ndash; 20 &ordm; C protegido deEDTA ligero</td></tr><tr><td>, sal disódica, dihidrato, cristal, reactivo A.C.S.</td><td>J.T.Baker</td><td>8993-01</td><td>--</td></tr><tr><td>Muestra mAb Adalimumab</td><td>Probiomed</td><td>NA</td><td>Las concentraciones finales en la microplaca son:&nbsp; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 y 0.004 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Referencia y control mAb Adalimumab</td><td>Abbvie</td><td>NA</td> Las <td>concentraciones finales en la microplaca son:&nbsp; 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 y 0,004 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td>89429-536</td><td>SpectraMax M3 Lector de</td></tr><tr><td>microplacas multimodo Software&nbsp;</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>:</td> incubadora <td>SoftMax Pro 6.3 GxP</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Revco&nbsp;</td><td>30482</td> Revco RNW3000TABB Campana de flujo laminar <td>de CO2 para aire forzado</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>La Compañía Baker &nbsp; &nbsp;</td><td>200256</td><td>Panadero SG603A-HE | Alta eficiencia, Clase II Tipo A2&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

determinación de la potencia relativa de un anti-tnf anticuerpo monoclonal (mab) por neutralizante utilizando un método de bioanalítica in vitro tnf

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

Este protocolo indica la medida de la neutralización de actividad apoptótica de TNFα en un modelo de celular de la fibroblastos de ratón (WEHI 164) con un mAb anti-TNFα. Además, este protocolo puede utilizarse para evaluar otras moléculas anti-TNFα, tales como proteínas de fusión. El modelo de celular utilizado aquí es sensible a la apoptosis mediada por el TNFα cuando es inducida por un factor de estrés adicional en las condiciones de cultivo celular (p. ej., privación de suero). Este procedimiento es un ejemplo de cómo ejecutar este ensayo analítico, destacando las operaciones claves relativas a la preparación de la muestra, dilución celular, inducción de apoptosis y medidas espectrofotométricas que son críticas para garantizar resultados exitosos. Este protocolo revela las condiciones de mejor rendimiento relacionados con la inducción de apoptosis y eficiente de señal de grabación, llevando a valores bajo incertidumbre.

Gráfico de la respuesta a la dosis (con controles) 
La figura 1 representa la respuesta de luminiscencia frente a concentración de mAb. Esta función sigmoidal es un ejemplo de liberación de la caspasa 3 y 7 en el medio de cultivo de ensayo debido a la lisis celular. Muerte celular es realzada por inanición de suero además de TNFα inducción de señalización. Por lo tanto, la molécula anti-TNFα (mAb) interactúa con la citocina, inhibición (po...

Aquí se presenta un protocolo para la determinación de la actividad anti-apoptótica relativa de un mAb anti-TNFα mediante un mecanismo de neutralización con células WEHI 164. Este protocolo es útil para comparar la fuerza de la neutralización de diferentes moléculas con la misma funcionalidad biológica.

Determinación de la potencia relativa de un Anti-TNF Anticuerpo Monoclonal (mAb) por neutralizante utilizando un método de bioanalítica In Vitro TNF

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la potencia relativa de moléculas anti-TNF-alfa. En este ejemplo, comparamos dos anticuerpos monoclonales anti-TNF-alfa para determinar la eficiencia de neutralización de un mAb de referencia frente a un mAb de muestra bajo investigación. Este tutorial muestra pasos detallados para la determinación de la potencia de neutralización del TNF-alfa, los cuales no se incluyen en la literatura.Las células pueden verse sometidas a estrés por diversos factores ambientales, por ejemplo, la inanición. Cada célula tiene diferentes proteínas en su superficie llamadas receptores. Algunas de ellas son específicas para la citocina TNF-alfa.Cuando esta molécula interactúa con su receptor y se genera una señal específica, esta señalización combinada con un factor de estrés ambiental provoca una muerte celular programada denominada apoptosis. Sin embargo, en presencia de una molécula anti-TNF-alfa, que puede ser un anticuerpo monoclonal, la citocina puede ser titulada por el AcM, sometiéndose a un proceso de neutralización que ayuda a las células a sobrevivir. Por lo tanto, mediante una metodología estandarizada, puede medirse la potencia de neutralización de una molécula.Este protocolo se realiza actualmente durante cinco días. En el primer día, deben prepararse las soluciones para el cultivo celular. Además, las células WEHI 164 se descongelarán y se subcultivarán.El segundo y tercer día, se debe verificar la confluencia de las células. Después de este paso, las células deben ser desprendidas, contadas, ajustada la densidad celular y, finalmente, cultivadas nuevamente. Todos estos pasos deben realizarse cada día.En el cuarto día, la concentración del mAb debe determinarse mediante absorción UV y se deben realizar diluciones del anticuerpo. Se prepararán soluciones para la inducción de apoptosis. Y finalmente, la densidad celular de las células WEHI 164 debe ajustarse a medio millón de células por mL.En el quinto día, se preparará la solución de sustrato para la detección de células apoptóticas y se realizará el análisis espectrofotométrico. Finalmente, se discutirá el análisis in silico de los resultados. Todas las soluciones utilizadas en este protocolo se muestran en esta diapositiva.En el primer día, esta solución debe prepararse previamente a la ejecución del protocolo, con la excepción de las soluciones de inducción de apoptosis y sustrato, que deben usarse inmediatamente después de la reconstitución. Al inicio de este protocolo, las células congeladas deben retirarse del recipiente de nitrógeno líquido. Este vial con células WEHI congeladas debe mantenerse sobre hielo hasta su uso.Mantenga su lugar de trabajo limpio y desinfectado previamente para realizar cualquier actividad, con el fin de evitar la contaminación cruzada. Transfiera el bloque térmico a la cabina de flujo laminar y agregue nueve mL de medio de cultivo precalentado a un tubo estéril de 15 mililitros. Con un mL de medio de cultivo precalentado, lave las células WEHI 164 mediante pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo hasta que las células congeladas se desprendan del microtubo.Mezcle mediante inversión cinco veces hasta que las células congeladas se descongelen completamente. Luego, centrifugue las células a 125 g durante tres minutos. Descarte el sobrenadante y desagregue el sedimento celular.Añada cinco mL del medio de cultivo precalentado al tubo y mezcle la suspensión hasta que las células queden completamente resuspendidas. Recupere las células en un frasco de cultivo tipo T. Incube durante la noche a 37 grados Celsius y dióxido de carbono al 5 %. Cada día, antes de separar y contar las células en cultivo, es obligatorio verificar la salud del cultivo bajo el microscopio.El investigador debe verificar la salud celular, la viabilidad y la densidad celular para el subcultivo. Esta verificación también debe realizarse para el ensayo biológico. Primero, debe comprobarse la ausencia de contaminación biológica, por ejemplo, bacterias.En segundo lugar, la salud celular puede verificarse mediante la confluencia. Una confluencia superior al 90 % es suficiente para obtener buenos resultados. Sin embargo, si las células no han alcanzado la densidad celular deseada, el frasco debe regresarse al incubador y esperar hasta que las células alcancen la densidad celular y confluencia deseadas.Debe eliminarse el medio de cultivo envejecido del matraz T. Lave las células adheridas en las paredes del matraz T con cinco mL de la solución de lavado celular. Tenga cuidado de no desprender las células adheridas.Mezcle manualmente para eliminar los residuos del medio de cultivo y los restos celulares. Este paso debe realizarse dos veces. Retire las soluciones de lavado residuales utilizando vacío y agregue tres mL de la solución de disociación celular.Agite e incube durante tres minutos. Una vez finalizada la incubación, agregue medio de cultivo precalentado al frasco T para inactivar la enzima y recuperar las células.Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mL y centrifugue. Identifique el botón celular y deseche el sobrenadante. La eliminación del medio de cultivo envejecido es fundamental para el cultivo de células sanas.Disgregue el sedimento celular y reconstituya las células con cinco mL del medio de cultivo precalentado. Transfiera 50 microlitros de la suspensión celular a un microtubo. Cuente las células utilizando el método de exclusión con azul de tripano.Cuente las células y determine la viabilidad celular. Una vez obtenido el número de células viables, ajuste 15 mL del medio de cultivo a una densidad celular de medio millón de células por mL utilizando la siguiente fórmula. Transfiera 15 mL de la suspensión celular ajustada a un frasco de cultivo tipo T y incube durante la noche.Este proceso general de cultivo debe repetirse al menos una vez más, para un total de tres pases celulares, antes de comenzar el ensayo de neutralización. En el cuarto día, mida la densidad óptica de la sustancia de referencia, de la muestra analítica y de la muestra control mediante absorción UV a 280 nanómetros. Realice una dilución inicial a dos miligramos por mL con medio de cultivo del ensayo para cada muestra, en réplicas triples independientes.Realice una segunda dilución hasta dos microgramos por mL para cada muestra de AcM. Dispense 75 microlitros del medio de cultivo del ensayo en los 60 pozos ubicados en el centro de una microplaca de poliestireno. Añada 230 microlitros de sustancia de referencia en los pozos 2B y 2C.Muestras analíticas en los pocillos 2D y 2E. Y finalmente, la muestra de control en los pocillos 2F y 2G. Una muestra de control es una molécula que tiene una potencia relativa conocida.Luego realice diluciones seriadas en la microplaca. Un ejemplo se muestra en las diapositivas siguientes. Recuerde mezclar previamente las soluciones antes de dispensarlas en los pocillos.Esta operación es fundamental para el éxito de este protocolo. Ajuste previamente a medio millón de células por mL en un dispensador. Añada 50 microlitros de la suspensión celular a los 60 pozos internos de la placa de ensayo, comenzando desde la columna dos hasta la onceava.Mezcle la suspensión celular previamente antes de agregar el líquido a la microplaca. Transfiera inmediatamente 50 microlitros de las diluciones de AcM a la placa de ensayo. Para los pozos emparejados, distribuya las diluciones girando la micropipeta.Las diluciones del mAb se pueden dispensar en los pocillos en el siguiente orden, con los controles dispensados en los pocillos periféricos. Diluya la TNF-alfa con 500 microlitros de agua ultrapura. Mezcle mediante un vórtex a 2200 rpm.Transferir a un tubo de 15 mL y, finalmente, diluir hasta 40 nanogramos por mL con medio de cultivo del ensayo. Dispensar 50 microlitros de la solución de inducción de apoptosis en los 60 pozos internos del ensayo. Dispensar 50 microlitros de la solución de inducción de apoptosis en los 60 pozos internos del ensayo.Finalmente, incubar durante 16 horas. El quinto día, reconstituir el sustrato con esta solución tampón según lo indicado en las instrucciones del fabricante. Mezclar invirtiendo cinco veces.Dispensar la solución de sustrato. Añadir 50 microlitros de la solución de sustrato a cada pocillo de muestra en la placa de ensayo. También añadir sustrato a los controles.Agite la placa de ensayo en un mezclador de vórtice a 400 rpm durante tres minutos. Saque la placa de ensayo del mezclador e incube a temperatura ambiente. Encienda un lector de placas-espectrofotómetro.Abra el software SoftMax Pro o cualquier programa equivalente. Coloque la microplaca en el espectrofotómetro y ajuste los siguientes parámetros. Active la función de luminiscencia y el tipo de lectura en la función de punto final.Ajuste el área de lectura, excluyendo las columnas uno y 12. Seleccione el tipo de placa como placa microtituladora estándar de 96 pocillos con fondo transparente. Modifique el tiempo de integración hasta 1250 milisegundos.Ajuste el tiempo de agitación de la microplaca a 10 segundos. Seleccione el pocillo en el que se colocarán la Sustancia de Referencia, la Sustancia Analítica y la Muestra de Control. Comience la lectura.Los resultados en este ensayo son las curvas de respuesta expresadas en luminiscencia en comparación con las escalas logarítmicas de la concentración del mAb. Los puntos de inflexión de estas curvas corresponden a las concentraciones efectivas, EC50 para cada mAb. C o EC50 se expresa en nanogramos por mL.Sin embargo, este valor no tiene significado por sí solo si no se compara con la muestra de referencia. Por lo tanto, la potencia de una muestra analítica se expresa en porcentaje y se denomina potencia relativa. La potencia relativa es el promedio de tres resultados independientes de microplacas, que se obtiene a partir del valor de CE50 de cada placa.La comparación entre muestras de control y muestras de referencia ayuda a determinar cualquier desviación o sesgo en el ensayo actual. La comparación de la muestra de referencia con una muestra analítica ayuda a determinar la potencia relativa. Esta tabla muestra la potencia relativa de los AcM y su intervalo de confianza al 95 %. También muestra la desviación estándar relativa de cada muestra respecto a la potencia de la sustancia de referencia.Se considera inaceptable una desviación estándar relativa superior al 15 %. Esta caracterización ayuda a determinar a priori el comportamiento biótico de una molécula que se encuentra en desarrollo antes de realizar ensayos clínicos costosos y que requieren mucho tiempo. Asimismo, es útil para la liberación lote a lote de un producto aprobado.Es nuestra determinación que estos ensayos son útiles para determinar si una molécula tiene un efecto biológico adecuado en relación con su mecanismo de acción. Como parte de los métodos biofísicos, esta metodología puede determinar por medios biológicos la potencia y la eficacia de la calidad y atributos de un fármaco, mostrando así una significancia completa y total de sus funciones efectoras.

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Determinación de la potencia relativa de un Anti-TNF Anticuerpo Monoclonal (mAb) por neutralizante utilizando un método de bioanalítica In Vitro TNF (Video) | JoVE Journal

Determinación de la potencia relativa de un Anti-TNF Anticuerpo Monoclonal (mAb) por neutralizante utilizando un método de bioanalítica In Vitro TNF

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