Name: Expresión de citoquina exógena en los xenoinjertos derivados del paciente mediante inyección con una línea de células estromales transducidas por citoquinas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Aprende a producir citoquinas humanas en xenoinjertos derivados del paciente mediante inyección intraperitoneal de células estromales transducidas. Este método permite estudiar hematopoyesis y probar terapias anticancerígenas.

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Este trabajo fue apoyado por NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, una beca Hope Scholar de Hyundai Hope on Wheels, el Departamento de Patología y Anatomía Humana, el Departamento de Ciencias Básicas y el Centro de Disparidades de Salud y Medicina Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Loma Linda y por una Subvención para Promover la Investigación Colaborativa y Traslacional de la Universidad de Loma Linda (KJP). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los NIH.

<ol><li>Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+patient-derived+xenograft+models+for+precision+medicine+approaches+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Med%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia.</a> J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).</li>
<li>Parrish, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+Dependence+in+human+B+lymphopoiesis+increases+during+progression+of+ontogeny+from+cord+blood+to+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow.</a> J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).</li>
<li>Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+and+human+IL-7+activate+STAT5+and+induce+proliferation+of+normal+human+pro-B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells.</a> J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).</li>
<li>Milford, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/304249946_TSLP_or_IL-7_provide_an_IL-7R_signal_that_is_critical_for_human_B_lymphopoiesis?ev=prf_high">TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis.</a> Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).</li>
<li>Reche, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+thymic+stromal+lymphopoietin+preferentially+stimulates+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells.</a> J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).</li>
<li>Francis, O. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+xenograft+model+to+study+the+role+of+TSLP-induced+CRLF2+signals+in+normal+and+malignant+human+B+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis.</a> Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).</li>
<li>Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+human+hemato-lymphoid-system+mice+by+cytokine+knock-in+gene+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement.</a> Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).</li>
<li>Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+the+functionally+distinct+human+bone+marrow+stromal+cell+lines+HS-5+and+HS-27a%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a.</a> Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).</li>
<li>Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+by+lentiviral+vectors+is+limited+by+nuclear+translocation+and+rescued+by+HIV-1+pol+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences.</a> Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Cockrell, A. S., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+by+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery by lentivirus vectors.</a> Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freezing%2C+thawing%2C+and+packaging+cells+for+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Freezing, thawing, and packaging cells for transport.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5061">http://www.jove.com/science-education/5061</a> (2016).</li>
<li>Tasian, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+STAT5+and+PI3K%2FmTOR+pathway+signaling+occurs+in+human+CRLF2-rearranged+B-precursor+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 120 (4), 833-842 (2012).</li>
<li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5048">http://www.jove.com/science-education/5048</a> (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5161">http://www.jove.com/science-education/5161</a> (2016).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Kovacsics, D., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+proteins+by+hydrodynamic+gene+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3023233/">Chapter 15, Creation of &#34;humanized&#34; mice to study human immunity.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Scheeren, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+stromal+lymphopoietin+induces+early+human+B-cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation.</a> Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).</li>
<li>Lee, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+serum+thymic+stromal+lymphopoietin+in+children+with+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis.</a> Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este manuscrito describe un método simple, rápido y relativamente rentable para la ingeniería de PDX para expresar la citoquina humana exógena. La estrategia descrita aquí se basa en inyecciones intraperitoneales semanales de una línea celular de estroma transducida para expresar la citocina humana, TSLP. Antes de realizar los métodos descritos aquí, se generó estroma manipulado para expresar altos niveles de la citoquina de interés (TSLP) y estroma control controlado de forma similar. En los protocolos presentados aquí...

Los xenoinjertos derivados de los pacientes (PDX) son un poderoso modelo in vivo para estudiar la producción de células hematopoyéticas normales y malignas en un medio mamífero &quot;nativo&quot;. La mayoría de las veces, PDX se producen inyectando o trasplantando células humanas en ratones inmunodeficientes. La producción de PDX usando células madre hematopoyéticas humanas normales permite estudios in vivo de la sangre humana normal y el desarrollo de células inmunes. El PDX producido a partir de leucemia u otras células cancerosas hace posible estudiar mecanismos oncogénicos e identificar terapias eficaces en el contexto de la gama de paisajes genéticos y mutaciones presentes en la población humana. 1 Por lo tanto, PDX son el patrón oro actual para la investigación biomédica traslacional para identificar terapias eficaces y una herramienta importante para comprender los mecanismos de progresión del cáncer. Los modelos PDX son una herramienta esencial para ayudar a la investigación de enfermedades de disparidades de salud<html> Lesiones genéticas o cualquier enfermedad en la que las variaciones del paisaje genético de un paciente puedan contribuir sustancialmente a la oncogénesis y los resultados del tratamiento. Ratón-humano PDX modelos son posibles porque muchas citoquinas de ratón adecuadamente imitar sus análogos humanos en la activación de los receptores de citoquinas de las células humanas mientras están dentro del ratón. Por ejemplo, la interleucina-7 (IL-7) proporciona una señal crítica para el desarrollo de células B humanas. 2 En este caso, IL-7 de ratón tiene homología suficiente con IL-7 humana que la citoquina de ratón estimula vías de señalización en precursores de células B humanas. Sin embargo, este no es el caso de la linfopoyetina estromal tímica (TSLP) 5 , 6 que entre otras citoquinas (IL-3, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de células madre (SCF) ,Ref &quot;&gt; 7 es importante para la producción de células hematopoyéticas humanas normales y malignas Cuando las citoquinas humanas y de ratón muestran una baja homología, las citoquinas de ratón no activan sus respectivos receptores en células humanas Para superar este obstáculo se han utilizado varias estrategias Para diseñar la expresión de citoquinas humanas en ratones PDX.Estos incluyen la inyección de citoquinas humanas recombinantes, la inyección hidrodinámica de ADN, la expresión lentiviral, la expresión transgénica y la sustitución del gen knockin.7 Este informe describe un método para la ingeniería de PDX para producir citoquinas humanas a través de la medicación estromal Cytokine entrega ( Figura 1 ]. En el método demostrado aquí, los ratones PDX son modificados genéticamente para expresar la citoquina humana, TSLP, o para servir como controles de citoquinas negativas. Los PDX que expresan TSLP se consiguen mediante inyecciones intraperitoneales semanales de células estromales que se han transducido para expresar niveles elevados de TSLP humana.Los ratones &quot;control&quot; de PDX negativos para citoquinas están diseñados de forma similar; Aunque el estroma de control se transduce con un vector de control. Este método logra niveles fisiológicos normales de TSLP humano en ratones PDX inyectados con el estroma TSLP +. No se observa TSLP detectable en ratones PDX que reciben el estroma negativo de citoquina. Hemos seleccionado la línea de células estromales humanas HS-27A para nuestros estudios, ya que crece fuertemente en el cultivo y muestra muy bajo nivel de producción de citoquinas que no apoya la proliferación de células progenitoras aisladas en cocultures. 8 Para la expresión de TSLP humano, el estroma se transdujo con un vector lentiviral autoinactivante de generación avanzada derivado de un esqueleto previamente descrito 9 , e incluye el elemento cPPT / cts y el elemento regulador post-transcripcional de hepatitis de la marmota (WPRE) para aumentar la expresión del transgén. El gen TSLP humano se construyó en este vector bajo el control del factor de elongación-1(EF-1) para conseguir una expresión robusta, constitutiva y de largo plazo. La ingeniería de este modelo PDX humano-citocina mejorada consta de 4 pasos principales. Primero, el estroma transducido se expande in vitro y se evalúa mediante el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para una producción de citoquinas estable y de alto nivel. En segundo lugar, se verifica la actividad de la citoquina humana producida por las células estromales transducidas (y la falta de actividad de citoquinas del estroma de control) usando citometría de flujo fosfórico. Las líneas celulares conocidas por ser sensibles a citoquinas de interés (en este caso, TSLP) se incuban con sobrenadante de células estromales y se ensayan para la fosforilación inducida por citoquinas. En tercer lugar, los ratones se inyectan con estroma humano transducido y luego el plasma de ratón se evalúa por ELISA para los niveles de citoquina humana sobre una base semanal. Cuarto, las células hematopoyéticas humanas se transplantan y los efectos funcionales in vivo de la citoquina humana se evalúan sobre un objetivo conocido ( <em&gt; Por ejemplo. Población de células). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> Figura 1: Modelo PDX diseñado para producir citoquina humana exógena en ratones. ( 1B ) Obtención de células humanas (células madre hematopoyéticas, células leucémicas, etc. ) para generar ratones PDX (xenoinjerto derivado del paciente). ( 2A ) Inyectar el estroma de ingeniería y ( 2B ) transplantar células humanas en ratones inmunodeficientes según el programa experimental. ( 3A-B ) Monitorear las concentraciones de citoquinas en el sobrenadante de estroma y el plasma de ratón mediante ELISA. ( 4 ) Cosecha de células humanas y evaluar los efectos funcionales in vivo de la citocina humana presente en el PDX. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí</a>Para ver una versión más grande de esta figura. La administración de citoquinas humanas a través de células estromales ofrece ventajas y desventajas cuando se compara con otros métodos de liberación / producción de citoquinas humanas en ratones PDX. Comparado con la inyección de citoquina humana recombinante, el parto mediado por estroma es generalmente menos costoso (el costo del cultivo de células estromales es menor que el costo de la citocina recombinante) y menos intensivo de mano de obra (una inyección por semana versus múltiples inyecciones por semana). La cuestión de la vida media de citoquinas corto también se mitiga ya que el estroma produce continuamente la citoquina exógena. La administración de citoquina mediante inyección hidrodinámica de ADN puede ser menos costosa que la administración a través del estroma. Sin embargo, es similarmente transitorio y puede requerir más habilidad técnica que la simple inyección intraperitoneal semanal requerida para la administración mediada por estroma. La expresión del gen lentiviral en el ratón puedeNsient método de entrega de citoquinas; Sin embargo, en nuestras manos no se lograron niveles fisiológicos de TSLP. Además, este método es de mano de obra intensiva, que requiere la producción continua de vector lentiviral. Ratones transgénicos o knock-in ofrecen expresión a largo plazo estable de citoquina y pueden ser diseñados para la expresión específica de tejido, lo que puede ser una ventaja. Por otra parte, la expresión transgénica del gen de citoquina humana en el fondo de ratón inmunodeficiente requerido para ratones PDX, requiere una inmensa inversión de recursos antes de que se haya establecido el valor del modelo. Además, los modelos transgénicos generalmente no permiten la opción de variar el tiempo de iniciación de citoquinas o el nivel de producción de citoquinas in vivo . Estos pueden lograrse con la administración mediada por estroma simplemente cambiando el punto de tiempo para la iniciación de la inyección de células estromales o la dosis de células estromales inyectadas. El método de suministro de citocinas mediado por células estromalesOd detallado aquí se utilizó para desarrollar PDX para evaluar el papel de TSLP en el desarrollo de células B humanas normales 4 , 6 y de alto riesgo de células B leucemia linfoblástica aguda. 6 Este método proporciona un método alternativo de administración de citoquinas para su uso en la generación de modelos similares con citocinas humanas distintas de TSLP. Este modelo también puede ser útil para generar datos preliminares que pueden ayudar a determinar si el valor de una citoquina transgénica o citoquina knock-in PDX modelo sería digno de la inversión de tiempo y dinero sustancial.

<table><tbody><tr><td><reactivos de laboratorio húmedos fuertes> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc Cell Culture Tratado EasYFlasks, 7 mL de capacidad, &nbsp; 25cm&sup2; área de cultivo</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Matraz Tratado con Cultivo de Tejidos, 250 mL de capacidad, 75 cm&sup2; área de cultivo y tapón ventilado</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Matraz tratado con cultivo de tejidos T-150 Falcon, capacidad de 600 mL, 150 cm&sup2; Área de Cultura & tapón ventilado</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>pipetas serológicas de 10 mL</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubos cónicos de polipropileno</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubos cónicos de polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>viales criogénicos de 2,0 mL, rosca externa</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>puntas de pipeta de 1 mL</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L puntas de pipeta&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; Puntas de pipeta</td><td>en L Denville Scientific</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro desechables estériles con membrana SFCA, Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp; </td><td>BioLegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calicio ni magnesio, 1&veces;</td><td>Corning cellgro/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Humano TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3% Ácido Acético con Azul de Metileno</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-900-CL</td><td></td></tr> <tr><td>"Tripsina" 1x 0.25% Tripsina 2.21 mM EDTA en HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>" R10" medio de cultivo celular, % del volumen total (rinde 565 mL)</fuerte></td><td>-</td><td><fuerte>-</fuerte></td><td><fuerte>Receta de laboratorio</fuerte></td></tr><tr><td>RPMI, 88.5% (500 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 9.9% (56 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 0.99% (5.6 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina, 0,50% (2,8 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol, 0,10% (560 &micro; L)&nbsp;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>" R20" medio de cultivo celular, % del volumen total (rinde 195 mL)</fuerte></td><td>-</td><td><</td><td>fuerte>Receta de laboratorio</fuerte></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RPMI, 76.84% (150&nbsp; mL)</td><td>ver arriba</td>, <td>ver arriba</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; FBS, 20.49% (40 mL)</td><td>ver arriba</td>, <td>ver arriba</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2 mM de L-glutamina, 1.02% (2 mL)</td><td>ver arriba</td>, <td>ver arriba</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1 mM de piruvato de Na, 1.02% (2 mL )</td><td>ver arriba</td>, <td>ver arriba</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Penicilina-estreptomicina,&nbsp; 0.51% (1 mL)</td><td>ver arriba</td>, <td>ver arriba</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2-Mercaptoetanol, 0,10% (0,1 M),&nbsp; 0,10% (200 y micro; L)</td><td>véase</td><td>más arriba</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>" Medio de congelación", % del volumen total</fuerte></td><td>-</td><td><fuerte>-</fuerte></td><td><fuerte>Receta de laboratorio</fuerte></td></tr><tr><td>" R10" medio, 45%</td><td>ver receta "R10"</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 20%</td><td>ver arriba</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 10%</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-Trehalosa dihidratada, 5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catolog Number </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Biologics&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>"HS-27" HS-27A línea de estroma humano</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr><tr><td>"CALL-4" Línea celular MHH-CALL-4, leucemia precursora de células B humanas</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr><tr><td>" Ratones NSG" CABECEO. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, hombre o mujer, 6 años &ndash; 8 semanas</td><td>JAX Ratones &nbsp;</td><td># 005557</td><td></td></tr><tr><td>línea celular MUTZ-5, leucemia precursora de células B humanas</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr><tr><td>Proteína TSLP humana recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Catolog Number</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Anticuerpos de citomería de flujo (clon)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE (MB15-18C9) (el nombre alternativo es IL-7R&alpha;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC (8G12)</td><td>BD Biosciences</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-Cy7&nbsp; (HI30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr><tr><td>"FVD" Tinte de viabilidad fijable&nbsp; eFluor 780&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig &kappa; cadena ligera FITC&nbsp; (G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td><td></td></tr><tr><td>Ig &lambda; cadena ligera FITC (JDC-12)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE (IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-Cy5 (G20-127)</td><td>BD Biosciences</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE,&nbsp; ratón anti-STAT5 (pY694)</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>Catolog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Otros materiales y equipos& bsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animal Implantable Nano Transpondedor con Cánula</td><td>Trovan&nbsp;</td><td>ID-100B(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>Crema anestésica de lidocaína EMLA (obtenida por prescripción a través del centro de cuidado de animales)</td><td>prescripción</td><td>prescripción</td><td></td></tr><tr><td>BD &12; cc LO-DOSE U-100 Jeringa de insulina 28G&frac12; &nbsp;</td><td>BD</td><td>#329461</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microtainer BD con K2EDTA</td><td>BD&nbsp;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Alegra X-15R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Tubos Capilares (Heparinizados)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Jaula de pastel de ratón</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>Restrainer Iluminador de cola de ratón</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td>Implantador de empuñadura de pistola</td><td>Trovan&nbsp;</td><td>IM-300 (1.25)</td><td></td></tr> <tr><td>y micro; Cuantita&nbsp;</td><td>Bio-Tek Instruments Inc.</td><td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software de análisis de citometría de flujo</td><td>FlowJo, LLC</td><td>Versión 10</td><td></td></tr> <tr><td>* Todos los anticuerpos son antihumanos a menos que se indique lo contrario.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expresión de citoquina exógena en los xenoinjertos derivados del paciente mediante inyección con una línea de células estromales transducidas por citoquinas

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Los ratones de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) se producen trasplantando células humanas en ratones inmunodeficientes. Estos modelos son una herramienta importante para el estudio de los mecanismos de la hematopoyesis normal y maligna y son el estándar de oro para la identificación de quimioterapia eficaz para muchos tumores malignos. PDX modelos son posibles porque muchas de las citoquinas de ratón también actúan sobre las células humanas. Sin embargo, este no es el caso para todas las citocinas, incluyendo muchas que son críticas para el estudio de la hematopoyesis normal y maligna en las células humanas. Técnicas que ingenieros ratones para producir citoquinas humanas (transgénicos y knock-in modelos) requieren un gasto significativo antes de la utilidad del modelo se ha demostrado. Otras técnicas son intensivas en mano de obra (inyección de citocinas recombinantes o lentivirus) y en algunos casos requieren altos niveles de experiencia técnica (inyección hidrodinámica de ADN). Este informe describe un método simple para la generación de ratones PDX que tienen células humanas exógenasTokina (TSLP, linfopoyetina estromal tímica) mediante inyección intraperitoneal semanal de estroma que se han transducido para sobreexpresar esta citocina. El uso de este método proporciona una fuente in vivo de producción continua de citoquinas que alcanza los niveles fisiológicos de citoquina humana circulante en el ratón. Los niveles plasmáticos de citoquina humana se pueden variar basándose en el número de células estromales inyectadas, y la producción de citoquinas puede iniciarse en cualquier punto del experimento. Este método también incluye ratones de control negativos a citoquinas que se producen de manera similar, pero a través de inyección intraperitoneal de estroma transducido con un vector de control. Hemos demostrado previamente que las células de leucemia recolectadas de PDX que expresa TSLP, en comparación con el control de PDX, muestran un patrón de expresión génica más parecido a la muestra original del paciente. Conjuntamente, los ratones PDX productores de citoquinas y negativos a citoquinas producidos por este método proporcionan un sistema modelo que hemos utilizado con éxito para estudiar laPapel de TSLP en hematopoyesis normal y maligna.

En la Figura 1 se muestra una visión general del modelo. Una vez que se han obtenido citocinas productoras (TSLP + estroma) y estroma de control se expanden en cultivo. Antes de la inyección de estroma en ratones, el sobrenadante de células estromales se evalúa por ELISA para verificar la producción de citoquinas ( Figura 2 ) y la citometría de flujo fosfo (Protocolo # 3) se utiliza para verificar la actividad de la citoquina producida por el estroma. El...

Se describe aquí un método para producir citoquina exógena en ratones de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) mediante inyección intraperitoneal semanal de una línea celular de estroma transducida por citoquinas. Este método amplía la utilidad de PDX y proporciona la opción para el suministro transitorio o sostenido de citoquinas exógenas en una multitud de modelos PDX.

Expresión de citoquina exógena en los xenoinjertos derivados del paciente mediante inyección con una línea de células estromales transducidas por citoquinas

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

El objetivo general de este procedimiento es producir ratones con xenoinjertos que presenten citocinas humanas en circulación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del cáncer y la hematopoyesis, como por ejemplo: ¿Cuál es el papel de una citocina específica en el desarrollo normal y maligno de los linfocitos? La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden ajustar las concentraciones circulantes de citocina exógena en sus animales con xenoinjertos según las necesidades de su experimento.Esto elimina la necesidad de generar nuevas líneas de ratones transgénicos costosas. Esta técnica será útil para investigar nuevas terapias contra el cáncer, ya que este modelo preclínico puede utilizarse para probar fármacos anticancerígenos, de forma similar a lo que se utiliza en la clínica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la hematopoyesis normal, también puede emplearse para estudiar enfermedades específicas como la leucemia.Desarrollé por primera vez esta idea cuando necesitábamos un modelo in vivo para evaluar el papel de la citocina TSLP en la producción de linfocitos B humanos normales y malignos. Comience por sembrar estroma transducido con vector vacío de control recién descongelado en células productoras de citocinas en cinco mililitros de medio R-10 en frascos T25 individuales. Para su cultivo, incube a 37 grados Celsius en un 5 por ciento de CO2 durante 24 a 48 horas.Cuando los estromas sean confluentes, desprenda las células con tripsina en EDTA para su resembrado en matraces de cultivo T150 durante tres o cuatro días. Cuando los estromas alcancen confluencia en los matraces T150, recoja los sobrenadantes y congélelos a 80 grados Celsius para su posterior evaluación de la producción de citoquinas mediante ELISA. A continuación, pase cada cultivo de matraz T150 a tres nuevos matraces T150 para su cultivo hasta alcanzar confluencia.Para almacenar las células tras el número adecuado de pasajes, transfiera las suspensiones celulares recolectadas a un tubo cónico para centrifugación y resuspenda los pellet en un medio de congelación. Luego, transfiera alícuotas de 1,5E6 células a tubos para almacenamiento a largo plazo y guárdelos en nitrógeno líquido. Para validar el sobrenadante producido a partir del estroma modificado, descongele las muestras de sobrenadante recolectadas del control en estroma que expresa citoquinas, y siembre tres pocillos de líneas celulares de leucemia por condición en medio Au-20 a una concentración de 2E5 células por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos.Incube las células durante dos horas a 37 grados Celsius para permitir la pérdida de la fosforilación proveniente del cultivo previo. Luego, transfiera las células de cada pocillo a tubos individuales de cuatro mililitros y recupere las células mediante centrifugación. Re suspenda los pellets en 600 microlitros por condición experimental.Plaque 200 microlitros de células por pocillo para cada condición por triplicado. Incube las células durante el período adecuado según el fosfoensayo comercial específico. Al final de la incubación, pelete las células mediante centrifugación.Etiquete las células mediante tinción de citometría de flujo fosfoespecífica según el protocolo del fabricante. Luego analice las células mediante citometría de flujo utilizando protocolos estándar de análisis por citometría de flujo para verificar que la citocina en el sobrenadante del estroma fosforile las células leucémicas. Después de un mínimo de tres pasajes posteriores al descongelamiento, transfiera las suspensiones de células estromales recolectadas a tubos cónicos individuales para su conteo.Centrifugar las células para formar un sedimento y resuspenderlas suavemente en los volúmenes adecuados de PBS estéril para inyección. Mantener las células a cuatro grados Celsius hasta justo antes de la inyección, momento en el cual la suspensión debe calentarse hasta al menos la temperatura ambiente. Cuando las células estén listas, mezclar suavemente la primera muestra mediante inversión y aspirar 200 microlitros de las células en una jeringa tuberculínica.A continuación, inmovilice el primer animal e inyecte las células en la cavidad peritoneal utilizando técnicas estándar de inyección intraperitoneal. Para obtener una muestra de sangre periférica, primero coloque suavemente al ratón en un dispositivo de inmovilización para pequeños animales desinfectado y asegure el tubo para minimizar los movimientos del animal. A continuación, limpie la cola con alcohol isopropílico fresco seguido de la aplicación de una crema anestésica tópica.Con tijeras quirúrgicas muy afiladas, corte aproximadamente de 5 a 1 milímetro desde la punta de la cola y recoja alrededor de 80 microlitros de sangre periférica en tubos capilares heparinizados. Utilice una pipeta de pera para transferir las muestras de sangre a tubos microtainer de EDTA potásico etiquetados e invierta el tubo 20 veces para evitar la coagulación. Después de centrifugar los tubos de recolección de sangre según las instrucciones del fabricante, recoja cuidadosamente la capa de plasma, almacene las alícuotas a 20 grados Celsius y fraccione el plasma para su almacenamiento a 20 grados Celsius.El día del ELISA, descongele las muestras de plasma de ratón congeladas y diluya en serie el estándar de ELISA en volúmenes de 120 microlitros. A continuación, coloque 40 microlitros de cada estándar en triplicado en los pozos adecuados de la placa de ELISA, seguido de la adición de 40 microlitros de cada muestra de plasma de ratón en los pozos correspondientes. Luego, complete el análisis de ELISA según las instrucciones del fabricante.24 horas después de irradiar a los ratones, prepare las células hematopoyéticas humanas para el trasplante xenógeno. Cuando resuspenda las células hematopoyéticas en PBS estéril, es recomendable preparar aproximadamente un 15 a 20 por ciento adicional, por si ocurre un derrame durante el trasplante. Mantenga las células a cuatro grados centígrados hasta el trasplante y transfiera el primer animal receptor a una jaula de calentamiento durante al menos cinco minutos para facilitar la dilatación de la vena de la cola.Ahora caliente las células hasta temperatura ambiente. Mezcle suavemente la suspensión celular y aspire 200 microlitros en una jeringa de tuberculina. Coloque el ratón en el sujetador y desinfecte la cola con alcohol isopropílico.Inyecte las células en una vena lateral de la cola. Luego, supervise al ratón durante al menos cinco minutos para confirmar la ausencia de efectos adversos relacionados con el trasplante. Los animales xenoinjertados derivados de pacientes, o animales PDX, inyectados con estroma de control muestran consistentemente niveles de linfopoietina estromal tímica humana, o TSLP, en plasma de ratón por debajo del umbral de detección de ELISA.Los niveles plasmáticos de TSLP humano en ratones PDX inyectados con estroma transducido con TSLP son proporcionales a la cantidad de células estromales TSLP inyectadas durante las una o dos semanas previas. A pesar de realizarse en simplicado, esta evaluación semanal de los niveles plasmáticos de TSLP mediante ELISA modificado proporciona resultados que, en general, son consistentes a lo largo del tiempo. Se ha demostrado que TSLP aumenta la producción de precursores normales de células B humanas.De hecho, las células de linaje B están significativamente aumentadas en ratones TSLP-plus en comparación con los animales PDX control ya desde la etapa de precursor de células B, lo que sugiere que la TSLP humana producida en los animales PDX TSLP-plus ejerce los efectos funcionales esperados in vivo sobre las poblaciones celulares diana. Una vez optimizados, estos procedimientos pueden generar ratones con xenoinjertos que presenten niveles detectables de citocinas humanas en tres o cuatro semanas. Es importante monitorear la concentración de citocinas en el sobrenadante de las células del estroma a lo largo del tiempo.Esto asegura que la producción de citoquinas se mantenga en el estroma productor de citoquinas y esté ausente en el estroma de control. Los ratones PDX pueden utilizarse en estudios preclínicos para responder preguntas adicionales, como, ¿cómo se altera la eficacia de un fármaco específico de interés al variar los niveles fisiológicos de una citoquina experimental de interés in vivo? Este modelo innovador ofrece una nueva forma para que los investigadores en los campos de la hematología y la oncología estudien el papel de la TSLP en el desarrollo y la progresión de la leucemia, así como su función en la hematopoyesis normal.Siempre que tenga acceso a líneas celulares transducidas con citoquinas, puede utilizar las técnicas demostradas en este video para suministrar cualquier citoquina exógena a modelos de enfermedad de trasplante xenógeno derivados de pacientes, utilizando una amplia variedad de cepas de ratones inmunodeficientes. No olvide que trabajar con células hematopoyéticas humanas puede ser peligroso. Siempre debe tomar precauciones para evitar la transmisión de patógenos transmitidos por la sangre al manipular estos fluidos y células.

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Expresión de citoquina exógena en los xenoinjertos derivados del paciente mediante inyección con una línea de células estromales transducidas por citoquinas (Video) | JoVE Journal

Expresión de citoquina exógena en los xenoinjertos derivados del paciente mediante inyección con una línea de células estromales transducidas por citoquinas

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