La cuantificación absoluta de Aß _1-42 En el LCR utilizando un procedimiento de medición de referencia de espectrometría de masas

El objetivo general de este procedimiento de medición de referencia es armonizar las mediciones de una beta en el líquido cefalorraquídeo humano. Este método puede ayudar a estandarizar los ensayos para la medición del LCR, un beta 42, que es un biomarcador de la patología amiloide central y un sello neuropatológico distintivo de la enfermedad de Alzheimer. La principal ventaja de esta técnica es que está completamente validada y no utiliza anticuerpos para la cuantificación de AVR 142.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer porque se utilizaría para armonizar los ensayos y facilitar la introducción de niveles de corte generales en los ensayos clínicos. Si bien este método puede proporcionar información sobre la patología amiloide en los seres humanos, también se puede aplicar a otros organismos mortales, como ratones transgénicos y primates no humanos, para venerar nuevos medicamentos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el AVR 142 es muy hidrofóbico y puede adherirse fácilmente a superficies como puntas de pipetas y tubos.

En primer lugar, añadir 40 microlitros de N15, un péptido beta, a 0,46 mililitros de acetonitrilo al 20% y amoníaco concentrado al 4% en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Mezcle la solución de péptidos en un mezclador de vórtice durante un minuto. Añadir 50 microlitros de la solución peptídica a 1,95 mililitros de acetonitrilo al 20% y amoníaco concentrado al 4% en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.

Mezcle la solución de péptidos en un mezclador de vórtice durante un minuto. A continuación, prepare seis soluciones de calibrador mezclando los volúmenes adecuados de cada solución en tubos de microcentrífuga. Después de mezclar las soluciones del calibrador, prepare los calibradores finales por duplicado mezclando los volúmenes apropiados de las soluciones del calibrador correspondientes y el líquido cefalorraquídeo humano en tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitros.

Mezcle cada solución en un mezclador de vórtice durante un minuto. Para preparar el patrón interno, primero agregue 32 microlitros de péptido beta 13C a 1.968 mililitros de acetonitrilo al 20% y amoníaco concentrado al 4% en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Mezcle la solución de péptidos en un mezclador de vórtice durante un minuto.

A continuación, agregue 0,1 mililitros de la solución peptídica a 4,9 mililitros de acetonitrilo al 20% y amoníaco concentrado al 4% en un tubo de microcentrífuga de cinco mililitros. Mezcle la solución de péptidos en un mezclador de vórtice durante un minuto. Para preparar la muestra del factor de respuesta, agregue 40 microlitros de péptido beta nativo a a 0,46 mililitros de acetonitrilo al 20% y amoníaco concentrado al 4% en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros.

Después de mezclar, agregue 20 microlitros de la solución peptídica y 20 microlitros de cuatro microgramos por mililitro, 15N un péptido beta a 1,96 mililitros de 20% de acetonitrilo y 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Mezcle la solución de péptidos en un mezclador de vórtice durante un minuto. A continuación, añada 20 microlitros de la solución peptídica a 0,38 mililitros de líquido cefalorraquídeo artificial en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros.

Después de preparar los duplicados, mezcle cada solución en un mezclador de vórtice durante un minuto. Después de descongelar las muestras en un rodillo, agregue 0,18 mililitros de cada calibrador, factor de respuesta y muestra desconocida a una placa de pocillo de proteína 96 profunda de un mililitro, asegurándose de agregar las muestras en o cerca del fondo de los pocillos. Ahora, agregue 20 microlitros de patrón interno a cada pocillo liberando una gota del patrón en el lado del pocillo cerca de la superficie de la muestra sin sumergir la punta de la pipeta.

Luego, agregue 0.2 mililitros de clorhidrato de guanadina de cinco molares a cada pocillo. Coloque la placa de muestra en un agitador de microplacas y mezcle las muestras durante 45 minutos a 1100 rpm. Después de mezclar, agregue 0,2 mililitros de ácido fosfórico al 4% a cada pocillo.

A continuación, coloque la placa de muestra en el agitador de microplacas y mezcle brevemente a 1000 rpm. Coloque una bandeja de depósito para residuos bajo una placa de extracción en fase sólida de 96 pozos de intercambio catiónico de modo mixto, o SPE en la cámara del colector de la placa de extracción. A continuación, acondiciona el sorbente SPE añadiendo 0,2 mililitros de metanol a cada pocillo.

A continuación, equilibre el sorbente añadiendo 0,2 mililitros de ácido fosfórico al 4% a cada pocillo. Con una pipeta de ocho canales, transfiera todas las muestras de la placa de pocillo profundo a la placa SPE. A continuación, lave el sorbente dos veces después de que las muestras hayan pasado añadiendo 0,2 mililitros de ácido fosfórico al 4% a cada pocillo.

Después de que el solvente de lavado haya eluido del sorbente, reemplace la bandeja del depósito con tubos. Ahora, eluya la muestra del sorbente agregando dos álsperos de 50 microlitros de 75% de acetonitrilo y 10% de amoníaco concentrado, teniendo en cuenta que esta solución requiere un vacío muy bajo para pasar a través del sorbedor. Secar los eluidos mediante centrifugación al vacío sin aplicar calor.

Finalmente, selle los tubos y congélelos a 80 grados centígrados hasta el análisis. Los calibradores están cerca de la línea de regresión con desviaciones estándar bajas. Si la calibración no es lineal, la corrida debe descartarse y lo más probable es que la desviación se deba a técnicas de pipeteo incorrectas y/o errores en la dilución de los calibradores.

El coeficiente de variación de las réplicas debe estar preferiblemente por debajo del 10%Los nativos 15N y 13C un beta eluyen de la columna LC simultáneamente con picos casi simétricos y sin relaves significativos. Se deben realizar al menos 10 mediciones para cada pico y se pueden ajustar con un tiempo máximo de inyección en el método. Los péptidos pueden medirse simultáneamente durante el análisis de MS, a menos que la sensibilidad del método sea subóptima, en la que solo se deben medir los péptidos de interés para cada inyección.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que siempre hay que saturar las puntas de las pipetas antes de transferir la solución peptídica. También es importante utilizar tubos con el menor volumen de vacío posible.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la enfermedad de Alzheimer exploraran la concordancia con otros métodos, como la PET de amiloide. También se ha utilizado para asignar concentraciones de beta 142 a materiales de referencia basados en LCR. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar calibradores en LCR humano y usar la extracción en fase sólida antes del análisis de LCMS para medir la concentración absoluta de un beta 142 en muestras.

No olvide que trabajar con líquido cefalorraquídeo humano puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como guantes, gafas protectoras y otras medidas de seguridad al realizar este procedimiento.