Name: La cuantificación absoluta de Aß 1-42 En el LCR utilizando un procedimiento de medición de referencia de espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a cuantificar Aβ 1-42 en LCR humano mediante extracción en fase sólida y cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Este método validado estandariza ensayos para el biomarcador de la enfermedad de Alzheimer.

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Este trabajo se realizó en nombre del Grupo de Trabajo sobre Proteínas del LCR de la Federación Internacional de Química Clínica, que tiene la siguiente composición: Kaj Blennow (Presidente) y Henrik Zetterberg, Universidad de Gotemburgo, Suecia; Les Shaw y Magdalena Korecka, Universidad de Filadelfia, Pensilvania, Estados Unidos; Ingrid Zegers, Instituto de Materiales de Referencia y Mediciones, Geel, Bélgica; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Alemania; y Rand Jenkins, Laboratorio Bioanalítico PPD, Richmond, Virginia, EE.UU.; Randall Bateman, Universidad de Washington, Missouri, Estados Unidos; y H Vanderstichele, Innogenetics NV, Gante, Bélgica. Este trabajo también formó parte del Grupo de Trabajo de Métodos de Referencia de LCR del Consorcio Global para la Estandarización de Biomarcadores, dirigido por María C. Carrillo, Ph.D., Directora Senior de Relaciones Médicas y Científicas de la Asociación de Alzheimer. El estudio fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación (subvenciones #14002, #521-2011-4709 y #2013-2546); la Fundación Knut y Alice Wallenberg; Demensförbundet; y las fundaciones de Emil y Wera Cornell, Aina Wallström y Mary-Ann Sjöblom, Gun y Bertil Stohne, Magnus Bergvall y Gamla Tjänarinnor.

NOTA: Este protocolo requiere alícuotas de al menos 50 l, con una concentración de 50 mg / ml para cada péptido Aß, como material de partida. Los péptidos Aß se deben disolver en 20% de acetonitrilo (ACN) y solución concentrada de amoníaco 4% en agua desionizada (v / v) y se almacenaron a 80 ° C. Precaución: Véase la Tabla 1 para información de seguridad. 1. Preparación de las soluciones <ol><li> Preparar 100 ml de 20% de ACN y 4% de solución de amoníaco concentrado en agua desionizada (v / v) diluyendo 20 ml de ACN y 4 ml de amoniaco concentrado (~ 25%) en agua desionizada. Ajustar el volumen final a 100 ml con agua desionizada. Hacer todos los días frescos. </li><li> Preparar 50 ml de 5 M de guanidina-clorhidrato mediante la disolución de 26,08 g de hidrocloruro de guanidina en agua desionizada hasta un volumen final de 50 mL. Almacenar a 20 ° C y hacer mensual fresco. </li><li> Preparar 200 ml de ácido fosfórico al 4% en agua desionizada (v /v) diluyendo 9,4 ml de ácido concentrado fosfórico (~ 85%) en agua desionizada. Ajustar el volumen final a 200 ml con agua desionizada. Almacenar en el refrigerador y hacer semanal fresca. </li><li> Preparar 50 ml de 75% de ACN y solución concentrada de amoniaco al 10% (v / v) en agua desionizada mediante la dilución de 37,5 ml de ACN y 5 ml de amoniaco concentrado (~ 25%) en agua desionizada. Ajustar el volumen final a 50 ml con agua desionizada. Hacer todos los días frescos. </li><li> Descongelar al menos 2,5 ml de CSF humano para los calibradores, obtenidos a partir de muestras sobrantes sin identificación de análisis clínicos de rutina. </li><li> Preparar CSF artificial que contiene Na 150 mM, K 3.0, Ca 1,4 mM, Mg 0,8 mM, 1,0 mM P, y Cl 155 mM en agua desionizada y añadir albúmina de suero bovino a una concentración final de 4 mg / mL. Sólo se necesita 1 ml por cada análisis, pero preparar un gran volumen, que alícuota, y almacenar para uso futuro. </li></ol> 2. Preparación de los calibradores <ol><li> Preparar 0,5 ml de 4 mg / ml 15 NAβ 1-42 mediante la adición de 40 l de 50 mg / ml 15 NAβ 142 a la 0,46 ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min. </li><li> Preparar 2 ml de 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 mediante la adición de 50 l de la 4 mg / ml 15 NAβ 142 a 1,95 ml de 20% de ACN y 4% de amoniaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min. </li><li> Preparar seis soluciones de calibrador (AF) mediante la mezcla de los volúmenes de cada solución se indica en la Tabla 2. Use 0.5, 1.5 y 2 tubos de microcentrífuga ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min. </li><li> Preparar los calibradores finales (por duplicado) en 0,5 ml tubos de microcentrífuga mediante la adición de las soluciones de calibración correspondientes y CSF humano de acuerdo con la Tabla 3. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min. </li></ol> 3. Preparación de la Norma Interna <ol><li> Preparar 2 ml de 0,8 mg / ml 1-42 13 CAβ mediante la adición de 32 l de 50 mg / ml 13 CAβ 142 a 1,968 ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min. </li><li> Preparar 5 ml de 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 mediante la adición de 0,1 ml de 0,8 mg / ml a 4,9 ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 5 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min. </li></ol> 4. Preparación de la muestra Factor de respuesta NOTA: El factor de respuesta de determinación (RF) se realiza para determinar la concentración del péptido marcado utilizado para la calibración (15 NAβ 1-42). Esto requiere que la concentración del péptido nativo 1-42 se ha determinado utilizando el análisis de aminoácidos (AAA). Por lo tanto, el volumen y la concentración de alícuotas nativas de péptidos Aß 1-42necesita para cumplir los requisitos de la AAA. <ol><li> Preparar 0,5 ml de 4 mg / ml nativa (sin etiqueta) 1-42 mediante la adición de 40 l de 50 mg / ml de Aß 1-42 nativa a 0,46 ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min. </li><li> Preparar a 2 ml de 40 ng / ml de mezcla de nativos y 15 NAβ 1-42 mediante la adición de 20 l de 4 mg / ml de Aß 1-42 nativa y 20 l de 4μg / ml 15 NAβ 1-42 a 1,96 ml de 20% ACN y 4% amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min. </li><li> Añadir 20 l de la mezcla de 40 ng / ml a 0,38 ml de CSF artificial en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Preparar duplicados y mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min. </li></ol> Preparación 5. Muestra NOTA: Descongelar las muestras a medir a temperatura ambiente sobre un rodillo. <ol><li>Añadir 0,18 ml de cada calibrador, factor de respuesta, y la muestra desconocida (incluyendo el control de calidad [CC] muestras, si se usa) a un 1 ml de proteína placa de 96 pozos profundos, de acuerdo con la Figura 1 (suponiendo un plato lleno se utiliza). Asegúrese de añadir las muestras en, o cerca de, la parte inferior de los pozos. </li><li> Añadir 20 l de patrón interno a cada pocillo (es decir, los calibradores, los factores de respuesta, los círculos de calidad, y las incógnitas); es crucial para liberar la gota en el lado del pozo cerca de la superficie de la muestra sin sumergir la punta de pipeta. </li><li> Añadir 0,2 ml de 5 M de guanidina-clorhidrato a cada pocillo. </li><li> Colocar la placa de muestra en un agitador de microplacas y mezclar las muestras durante 45 minutos a 1100 rpm. La frecuencia óptima puede variar dependiendo de la instrumentación. Ajuste la frecuencia y la amplitud de la mezcladora de manera que las soluciones se mezclan a fondo y no hay gotas de estándar interno o CSF ​​se dejan sin mezclar en el lado de los pocillos. </li><li> Añadir 0,2 ml de ácido fosfórico al 4%a cada pocillo. Vortex mezclar brevemente. </li></ol> 6. Extracción en Fase Sólida NOTA: En todos los de lavado, carga y etapas de elución, aplicar el vacío más bajo posible después de la adición de la solución y aumentar gradualmente a medida que sea necesario para cargar o eluir la solución. Desactivar el vacío entre cada carga y etapa de elución. <ol><li> Ponga una bandeja de depósito para los residuos bajo un modo mixto, la placa de intercambio catiónico, extracción en fase sólida de 96 pocillos (SPE) en la cámara de colector de placa de extracción. </li><li> Acondicionar el sorbente SPE mediante la adición de 0,2 ml de metanol a cada pocillo. </li><li> Equilibrar el sorbente mediante la adición de 0,2 ml de ácido fosfórico al 4% a cada pocillo. </li><li> Transferencia de todas las muestras (aproximadamente 0,62 ml en cada pocillo) de la placa de pozo profundo a la placa de SPE. Usar una pipeta de ocho canales cuando se transfieren las muestras de la placa de pozo profundo a la placa de SPE; que no es crucial para transferir los volúmenes enteros o iguales de todas las muestras, ya que las muestras contienen un pasanteal estándar que compensar las variaciones. </li><li> Lavar el sorbente después de que las muestras han pasado a través mediante la adición de 0,2 ml de ácido fosfórico al 4% a cada pocillo. </li><li> Después de que el disolvente de lavado se eluyó de la absorbente, vuelva a colocar la bandeja de depósito con una placa de recogida o tubos. </li><li> Eluir la muestra del sorbente mediante la adición de dos veces 50 l de 75% ACN / 10% de amoniaco concentrado, y se tenga en cuenta que esta solución requiere un vacío muy bajo para pasar a través del sorbente. Recuerde que debe desactivar el vacío entre cada adición. <ol><li> OPCIONAL: Sellar la placa de recogida o tubos y congelar a -80 ° C. Retire el sello de la placa de recogida o tubos antes de proceder con el paso 6.8.2. </li><li> Seque los eluatos mediante el uso de centrifugación al vacío (sin aplicación de calor); esto puede tomar de una a varias horas, dependiendo de la centrífuga de vacío. </li><li> Sellar los recipientes y congelar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 7. Líquido chromatografía <ol><li> Preparar la fase móvil A (5% de ACN y 0,3% de amoníaco concentrado en agua desionizada [v / v]), B (4% de agua desionizada y 0,1% de amoníaco concentrado en ACN [v / v]), y el lavado de la aguja (50% de ACN y 4% de amoniaco concentrado en agua desionizada [v / v]). <ol><li> Por 500 ml de fase móvil A, se añaden 25 ml de ACN y 1,5 ml de amoníaco concentrado al agua desionizada. Ajustar el volumen final a 500 ml con agua desionizada. </li><li> Por 500 ml de fase móvil B, añadir 500 l de amoníaco concentrado y 25 ml de agua desionizada a ACN. Ajustar el volumen final de 500 ml con ACN. </li><li> Preparar 250 ml de lavado de la aguja mediante la adición de 120 ml de ACN y 10 ml de amoníaco concentrado a agua desionizada. Ajustar el volumen final a 250 ml con agua desionizada. </li><li> Ponga la fases A y B y móvil de lavado aguja botellas abiertas en un baño de ultrasonidos durante 20 min antes de su uso con el sistema LC </li></ol></li><li> Disolver cada muestra con 25 l de 20% de ACN y 4% concentraciónTed solución de amoniaco y colocarlos en un agitador durante 20 min. Centrifugar las muestras abajo y colocarlos en el inyector automático (mantenga a 7 ° C). </li><li> Inyectar 20 l de muestra en una columna monolítica 1 x 250 mm 2 poliestireno-divinilbenceno (de fase inversa) mantenida a 50 ° C. <ol><li> Utilice el gradiente LC se muestra en la Tabla 4 con una velocidad de flujo de 0,3 mL / min. Desviar los dos primeros y los últimos cinco minutos a los residuos (post-columna) mediante una válvula de desvío para reducir la contaminación del espectrómetro de masas. </li></ol></li></ol> 8. Análisis de espectrometría de masas NOTA: Estos parámetros se utilizan para un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-Orbitrap equipado con fuente de ionización por electrospray Aheated. <ol><li> Establecer los parámetros de la fuente de iones de acuerdo con la Tabla 5. </li><li> Coloque el instrumento MS para aislar las 4+ estados de carga de Aß 1-42 nativa (1,129.48 masaratio [m / z] a carga), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 m / z), y 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) en el analizador de masas cuadrupolar con una anchura de aislamiento de 2,5 m / z. </li><li> Fragmentar los péptidos aislados en la celda de colisión con una energía de colisión normalizada (NCE) de 17,0. Esto podría ser necesario ajustar para cada instrumento, incluso del mismo tipo (y especialmente si se utiliza otro tipo de instrumentos, como un triple cuadrupolo MS). </li><li> Registrar los espectros fragmento con una resolución de 17.500, con un objetivo de control automático de ganancia de 2 x 10 5 cargos y un tiempo de inyección máxima de 250 ms. </li></ol> 9. Proceso de Datos <ol><li> Utilizar la suma de los iones de productos (con una tolerancia de masa de ± 250 unidades de masa mili [MMU]) en la Tabla 6 para calcular las áreas cromatográficos para cada péptido. Tenga en cuenta que los tipos de iones y los números se muestran sólo para Aß nativa <sub&gt; iones 1-42 de productos, ya que son los mismos para ambos 15 y 13 NAβ 1-42 CAβ 1-42. </li><li> Determinar el factor de respuesta promedio de las dos muestras de factor de respuesta dividiendo el área bajo la curva (pico cromatográfico) de 15 NAβ 1-42 con el área bajo la curva de nativo 1-42. </li><li> Ajustar la concentración de la 15 NAβ 1-42 utilizada para la calibración mediante la multiplicación con el factor de respuesta calculado en el paso 9.2. </li><li> Construir una curva de calibrado poniendo las relaciones de área del 15 al 13 de NAβ 1-42 1-42 CAβ de los dos juegos de calibradores frente a la concentración. </li><li> Calcular la pendiente y la intersección de la curva de calibración mediante regresión lineal. </li><li> Calcular la proporción de área de Aß nativo 1-42 al estándar interno (13 CAβ 1-42) para ONUmuestras conocidas. </li><li> Extrapolar la concentración de muestras desconocidas a partir de la curva de calibración utilizando la pendiente y la intersección obtenido en el paso 9.5. </li></ol>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20107219">Alzheimer's disease.</a> N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neuropathology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease.</a> Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).</li>
<li>Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16876668">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).</li>
<li>Dubois, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+research+diagnostic+criteria+for+Alzheimer%27s+disease%3A+the+IWG-2+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria.</a> Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).</li>
<li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li>
<li>Buchhave, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22213792">Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia.</a> Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).</li>
<li>Olsson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+and+blood+biomarkers+for+the+diagnosis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).</li>
<li>Bjerke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+influencing+amyloid+Beta+concentration+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2010).</li>
<li>Dumurgier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersite+variability+of+CSF+Alzheimer%27s+disease+biomarkers+in+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting.</a> Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+biomarker+variability+in+the+Alzheimer%27s+Association+quality+control+program%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program.</a> Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).</li>
<li>Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23519967">Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers.</a> Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedures+for+Alzheimer%27s+disease+cerebrospinal+fluid+biomarkers%3A+definitions+and+approaches+with+focus+on+amyloid+beta42%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42.</a> Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).</li>
<li>Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+endogenous+androgenic+steroids+in+cattle%27s+meat+by+gas+chromatography+mass+spectrometry+using+a+surrogate+analyte+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach.</a> Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).</li>
<li>Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry+methods+for+quantitation+of+mevalonic+acid+in+human+plasma+and+urine%3A+method+validation%2C+demonstration+of+using+a+surrogate+analyte%2C+and+demonstration+of+unacceptable+matrix+effect+in+spite+of+use+of+a+stable+isotope+analog+internal+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).</li>
<li>Leinenbach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+candidate+reference+measurement+procedure+for+quantification+of+amyloid-beta+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid.</a> Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).</li>
<li>Li, W., Cohen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+endogenous+analytes+in+biofluid+without+a+true+blank+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix.</a> Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).</li>
<li>Perret-Liaudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+collection+tubes%3A+a+critical+issue+for+Alzheimer+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis.</a> Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).</li>
<li>Lewczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).</li>
<li>Pannee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedure+for+CSF+amyloid+beta+%28A%CE%B2%291-42+and+the+CSF+A%CE%B21-42+%2FA%CE%B21-40+ratio+-+a+cross-validation+study+against+amyloid+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (Aβ)1-42 and the CSF Aβ1-42 /Aβ1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET.</a> J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).</li>
<li>Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+to+a+common+standard+for+protein+measurements+by+immunoassay+for+in-vitro+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes.</a> Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).</li>
<li>Vesper, H. W., Thienpont, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+in+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Traceability in laboratory medicine.</a> Clin Chem. 55 (6), 1067-1075 (2009).</li>
</ol>

JP y EP no informan divulgaciones. HZ ha formado parte de los consejos asesores de Roche Diagnostics, Eli Lilly y Pharmasum Therapeutics. KB se ha desempeñado como consultor o en los consejos asesores de Fujirebio Europe, IBL International y Roche Diagnostics. HZ y KB son cofundadores de Brain Biomarker Solutions en Gotemburgo AB, una empresa de plataforma basada en GU Venture en la Universidad de Gotemburgo.

Para el método descrito, en vez de usar una matriz sustituta, se utilizó el enfoque sustituto analito 13, 14, 15, 16, que permite la calibración en CSF humano. El enfoque analito sustituto implica dos estándares marcados isotópicamente diferentes. Un (15 NAβ 142) se utiliza para generar la curva de calibración en CSF humano, mientras que otro (13 CAβ 142)<...

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más común de demencia y afecta a unos 35 millones de personas en todo el mundo 1. Los signos neuropatológicos característicos de la enfermedad se cree ampliamente que se encuentran en el núcleo de patogénesis de la EA son los ovillos neurofibrilares intracelulares de proteína Tau hiperfosforilada y 2 placas extracelulares que consisten en agregados de beta-amiloide (Aß) péptidos 3. En línea con esto, la evaluación de la patología de la placa in vivo mediante biomarcadores recientemente se ha incluido en los criterios diagnósticos de investigación para 4 dC. Para las mediciones de LCR de 1-42, varios inmunoensayos están disponibles y se utilizan en muchos laboratorios clínicos 5. La concentración de 1-42 en CSF es de aproximadamente 50% menor en los pacientes de AD que en los ancianos cognitivamente normales, lo que refleja la deposición del péptido en las placas en el brain 6, 7. Estos biomarcadores se analizan utilizando principalmente inmunoensayos (por ejemplo, técnicas basadas en anticuerpos), pero estos ensayos pueden estar influenciadas por los efectos de matriz 8. El uso de inmunoensayos en diferentes plataformas tecnológicas y la falta de estandarización de ensayo 9, 10 hace que la introducción de las concentraciones globales de corte difíciles 11, 12. Un PGR analítico validado permitiría la calibración uniforme de diferentes plataformas de ensayo, lo ideal sería que resulta en una mejor comparabilidad entre las plataformas de análisis y un mejor control de los factores que contribuyen a la variabilidad general de medición. La cuantificación absoluta de 1-42 usando el método LC-MS / MS desarrollado supera muchos de los problemas asociados con la tecn basada en anticuerposiques. El método, que aparece como un PGR por el Comité Conjunto para la Trazabilidad en Medicina de Laboratorio (JCTLM base de datos de identificación del número C11RMP9), se utiliza para determinar la concentración absoluta de 1-42 en un material de referencia certificado (CRM) para armonizar CSF Aß 1 mediciones de -42 a través de técnicas y plataformas analíticas. El flujo de trabajo descrito debe ser de relevancia para el desarrollo de métodos de referencia candidato para péptidos y proteínas dentro de otras áreas de la medicina.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga Eppendorf Protein LoBind, 0,5 mL</td> Tubos de <td></td> microcentrífuga <td>Eppendorf</td> 022431081 <td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind, 1,5 mL</td> Tubos de <td></td> microcentrífuga <td>Eppendorf</td> 022431081 <td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind, 2 mL</td> Tubos de <td></td> microcentrífuga <td>Eppendorf</td> 022431102 <td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>Placas Eppendorf Protein LoBind Deepwell 96 Eppendorf</td><td></td><td>951032905</td><td></td></tr><tr><td>Micronic tubos de polipropileno de 0,75 mL,</td> tubos de <td>MPW32071BC3</td><td>Micrónicos</td> con fondo en V <td>utilizados para recoger el eluido de SPE, pero se pueden utilizar otros dispositivos de recolección, como placas de 96 pocillos.</td></tr><tr><td>Micronic Split TPE Capcluster para tubos de 96 pulgadas Micronic</td><td></td><td>MP53026</td><td>Caps para tubos Micronic.</td></tr><tr><td>Micronic Loborack-96 blanco con barra de cubierta alta codificada</td><td>Micronic</td><td>MPW51015BC3</td><td>Soporte para tubos Micronic.</td></tr><tr><td>Puntas Biohit Optifit 1,2 mL</td><td>Sartorius</td><td>791210</td><td>Se utiliza para llegar hasta el fondo de las placas de pocillos profundos LoBind (96 pocillos). Otras puntas estrechas también podrían funcionar.</td></tr><tr><td>Aguas Oasis MCX 96-pozo y micro; Aguas de placa de elución</td><td></td><td>186001830BA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aguas Colector de placas bandeja de depósito</td><td>Aguas</td><td>WAT058942</td><td></td></tr><tr><td>Aguas Colector de placas de extracción para Oasis Placas de 96 pocillos</td><td>Aguas</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>solución de hidróxido de amonio, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo, grado de gradiente de HPLC UV lejano, 2,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17X</td><td></td></tr><tr><td>ácido ortofosfórico 85%, ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td><td>Merck Millipore</td><td>1005731000</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de guanidina, 500 g</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Espectrómetro de masas</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Con Dionex Ultimate 3000 LC incluido y muestreador automático.</td></tr><tr><td>Dionex ProSwift RP-4H Columna monolítica (1,0 x 250 mm)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina, polvo liofilizado, adecuado para (para biología molecular),</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>beta-amiloide no acetilado (1-42), ultra puro, TFA</td><td>rPéptido</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N beta-amiloide (1-42),</td><td>rPéptido</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr> <tr><td>marcado uniformemente13C Beta-Amiloide (1-42), Agitadores</td> de microplacas <td>rPeptide</td><td>A-1106-2</td><td></td>marcados</tr><tr><td>uniformemente, TiMix 2</td><td>Edmund B&uuml; HLER</td><td>6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

la cuantificación absoluta de aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; en el lcr utilizando un procedimiento de medición de referencia de espectrometría de masas

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la enfermedad neurodegenerativa más común entre los ancianos y representa el 60-80% de todos los casos de demencia. En la actualidad, el diagnóstico de la EA se basa en pruebas cognitivas y exámenes del estado mental, pero el péptido beta-amiloide (Aβ) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) se utiliza cada vez más en ensayos clínicos y entornos. Al igual que para la mayoría de los biomarcadores de proteínas y péptidos, la cuantificación se realiza mediante técnicas basadas en anticuerpos, como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Sin embargo, la variabilidad intra e interlaboratorio de estos ensayos dificulta su uso como marcador diagnóstico en la rutina clínica.
Se desarrolló un Procedimiento de Medición de Referencia (RMP) independiente de anticuerpos basado en la extracción en fase sólida (SPE) y la cromatografía líquida (LC)-espectrometría de masas en tándem (MS/MS), donde se utilizaron péptidos Aβ estables marcados con isótopos como patrones internos, lo que permitió la cuantificación absoluta. Para las mediciones se utilizó un instrumento híbrido cuadrupolo-orbitrap de alta resolución. El método permite cuantificar el líquido cefalorraquídeo Aβ1-42 entre 150-4.000 pg/mL.

La configuración de la placa en la Figura 1 se utiliza para un plato lleno de muestras. Si se van a analizar un menor número de muestras desconocidas, el segundo calibrador, conjuntos de RF, y de control de calidad debe ser colocado después de la primera mitad de las muestras desconocidas. Como se ve en la Figura 2, los calibradores se encuentran cerca de la línea de regresión, con bajas desvi...

Se describe un procedimiento de medición de referencia para la cuantificación absoluta de Aβ1-42 en LCR humano basado en la extracción en fase sólida y la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida.

La cuantificación absoluta de Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; En el LCR utilizando un procedimiento de medición de referencia de espectrometría de masas

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

El objetivo general de este procedimiento de medición de referencia es armonizar las mediciones de a beta en el LCR humano. Este método puede ayudar a estandarizar ensayos para la medición del a beta 42 en LCR, que es un biomarcador de la patología amiloide central y un rasgo neuropatológico característico de la enfermedad de Alzheimer. La principal ventaja de esta técnica es que está completamente validada y no utiliza anticuerpos para la cuantificación de AVR 142.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la enfermedad de Alzheimer, ya que podría utilizarse para armonizar ensayos y facilitar la introducción de niveles generales de corte en ensayos clínicos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la patología amiloide en humanos, también puede aplicarse a otros organismos mortales, como ratones transgénicos y primates no humanos, para acelerar el desarrollo de nuevos fármacos. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque AVR 142 es muy hidrofóbico y puede adherirse fácilmente a superficies como puntas de pipeta y tubos.Primero, agregue 40 µL de un péptido beta N15 a 0,46 mL de acetonitrilo al 20% y amoníaco concentrado al 4% en un tubo microcentrífugo de 0,5 mL. Mezcle la solución de péptido en un mezclador de vórtice durante un minuto. Agregue 50 µL de la solución de péptido a 1,95 mL de acetonitrilo al 20% y amoníaco concentrado al 4% en un tubo microcentrífugo de dos mL.Mezcle la solución de péptidos en un mezclador de vórtice durante un minuto. A continuación, prepare seis soluciones calibradoras mezclando los volúmenes adecuados de cada solución en tubos de microcentrifugado. Después de mezclar las soluciones calibradoras, prepare los calibradores finales por duplicado mezclando los volúmenes adecuados de las soluciones calibradoras correspondientes y LCR humano en tubos de microcentrifugado de 0,5 mililitros.Mezcle cada solución en un vórtex durante un minuto. Para preparar el estándar interno, agregue primero 32 microlitros de un péptido beta 13C a 1,968 mililitros de acetonitrilo al 20% y amoníaco concentrado al 4% en un tubo microcentrífugo de dos mililitros. Mezcle la solución de péptido en un vórtex durante un minuto.A continuación, agregue 0,1 mililitros de la solución de péptido a 4,9 mililitros de acetonitrilo al 20% y amoníaco concentrado al 4% en un tubo microcentrífugo de cinco mililitros. Mezcle la solución de péptido en un mezclador de vórtice durante un minuto. Para preparar la muestra del factor de respuesta, agregue 40 microlitros de péptido beta nativo a 0,46 mililitros de acetonitrilo al 20% y amoníaco concentrado al 4% en un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros.Después de mezclar, agregue 20 microlitros de la solución de péptido y 20 microlitros de cuatro microgramos por mililitro de péptido beta 15N a 1,96 mililitros de acetonitrilo al 20% y amoníaco concentrado al 4% en un tubo microcentrífugo de dos mililitros. Mezcle la solución de péptido en un vórtex durante un minuto. A continuación, agregue 20 microlitros de la solución de péptido a 0,38 mililitros de LCR artificial en un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros.Después de preparar duplicados, mezcle cada solución en un mezclador de vórtice durante un minuto. Después de descongelar las muestras en un agitador rotatorio, agregue 0,18 mililitros de cada calibrador, factor de respuesta y muestra desconocida a una placa de proteínas de 96 pocillos profundos de un mililitro, asegurándose de agregar las muestras en el fondo de los pocillos o cerca de él. A continuación, agregue 20 microlitros de estándar interno a cada pocillo liberando una gota del estándar en el costado del pocillo cerca de la superficie de la muestra, sin sumergir la punta de la pipeta.Luego, agregue 0,2 mililitros de clorhidrato de guanidina cinco molar a cada pocillo. Coloque la placa de muestras en un agitador para microplacas y mezcle las muestras durante 45 minutos a 1100 rpm. Después de la mezcla, agregue 0,2 mililitros de ácido fosfórico al 4 % a cada pocillo.Luego, coloque la placa de muestras en el agitador de microplacas y mezcle brevemente a 1000 rpm. Coloque una bandeja recolectora de residuos debajo de una placa de extracción en fase sólida (SPE) de 96 pocillos con intercambio catiónico de modo mixto, en la cámara del manifold para placas de extracción. A continuación, condicione el sorbente de SPE añadiendo 0,2 mililitros de metanol a cada pocillo.A continuación, equilibre el sorbente añadiendo 0,2 mililitros de ácido fosfórico al 4 % a cada pocillo. Utilizando una pipeta de ocho canales, transfiera todas las muestras desde la placa de pocillos profundos a la placa de extracción en fase sólida (SPE). A continuación, lave el sorbente dos veces después de que las muestras hayan pasado, añadiendo 0,2 mililitros de ácido fosfórico al 4 % a cada pocillo.Después de que el disolvente de lavado haya eluido del sorbente, sustituya la bandeja de depósito por tubos. A continuación, eluya la muestra del sorbente añadiendo dos alícuotas de 50 microlitros de acetonitrilo al 75% y amoníaco concentrado al 10%, teniendo en cuenta que esta solución requiere un vacío muy bajo para atravesar el sorbente. Seque los eluidos mediante centrifugación al vacío sin aplicar calor.Finalmente, selle los tubos y congélelos a 80 grados celsius hasta el análisis. Los calibradores están cercanos a la línea de regresión con bajas desviaciones estándar. Si la calibración es no lineal, el ensayo debe descartarse y la desviación es probablemente debida a técnicas incorrectas de pipeteo y/o errores en la dilución de los calibradores.El coeficiente de variación de los réplicas debería ser preferiblemente inferior al 10 %. Los isótopos nativos 15N y 13C de la beta eluyen simultáneamente de la columna de LC con picos casi simétricos y sin arrastre significativo. Se deben realizar al menos 10 mediciones para cada pico y pueden ajustarse con un tiempo máximo de inyección en el método. Los péptidos pueden medirse simultáneamente durante el análisis de MS, a menos que la sensibilidad del método sea subóptima, en cuyo caso solo deben medirse los péptidos de interés en cada inyección.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar saturar siempre las puntas de las pipetas antes de transferir la solución de péptidos. También es fundamental utilizar tubos con el menor volumen muerto posible.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la enfermedad de Alzheimer exploraran la concordancia con otros métodos, como la imagenología por PET con amiloide. También se ha utilizado para asignar concentraciones de beta amiloide 142 a materiales de referencia basados en LCR. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar calibradores en LCR humano y utilizar la extracción en fase sólida antes del análisis por LCMS para medir la concentración absoluta de beta amiloide 142 en muestras.No olvide que trabajar con LCR humano puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes, gafas de protección y otras medidas de seguridad durante la realización de este procedimiento.

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La cuantificación absoluta de Aß 1-42 En el LCR utilizando un procedimiento de medición de referencia de espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal

La cuantificación absoluta de Aß

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