Name: Lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende el lavado broncoalveolar en ratones para analizar células inmunitarias pulmonares mediante citometría de flujo. Este método simple y reproducible permite estudiar mecanismos de infección e inflamación respiratoria.

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HVI es un asistente de investigación en el Departamento de Biomédica Biología Molecular de la Universidad de Gante. ERJ es apoyado por UniVacFlu, subvención número 607690. KR es apoyada por la CE-7PM FLUNIVAC proyecto.

Todos los experimentos con animales descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con el (Ley belga 14/08/1986 y 22/12/2003, Real Decreto belga 06/04/2010) nacional y la legislación europea (Directivas de la UE 2010/63 / UE y 86 / 609 / CEE). Todos los experimentos con ratones y todos los protocolos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Gante (los números de permisos y LA1400091 EC2016-027). 1. Preparación <ol><li> el líquido de lavado <ol><li> Preparar una solución de sal equilibrada con 100 mM ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). NOTA: Para medir los niveles de proteína en el líquido de BAL, se recomienda añadir inhibidores de la proteasa para evitar la actividad de la proteasa en el fluido BAL. </li></ol></li><li> Catéter <ol><li> Hacer un catéter mediante la inserción de una aguja de 23 G en polietileno transparente de plástico 21 G tubo (diámetro interno: 0,58 mm, diámetro exterior: 0.965 mm, y la longitud: 0,5 cm). catéteres confeccionados también se pueden utilizar. </li></ol></li><li> Anesthetics <ol><li> Preparar un anestésico terminal, preferiblemente uno que causa la parada respiratoria (por ejemplo, un barbitúrico como pentobarbital de sodio (&gt; 100 mg / kg) de solución en solución salina tamponada con fosfato (PBS)). NOTA: Se recomienda el uso de la anestesia inyectada en lugar de anestesia inhalada, como anestesia inhalada puede tener una influencia en el contenido líquido de BAL. CO 2, por ejemplo, tiene una influencia sobre el pH de la sangre y por lo tanto en la redistribución de diferentes compuestos 12. </li></ol></li><li> Amonio-cloruro-potasio (ACK) de tampón de lisis de glóbulos rojos <ol><li> Preparar un tampón de lisis ACK disolviendo 8,29 g de NH 4 Cl y 1 g de KHCO3 en 1 L de H 2 O con 100 mM EDTA; tampón de lisis celular rojo sangre también se pueden comprar de una fuente externa. </li></ol></li></ol> 2. Realización de la lavado broncoalveolar (BAL) <ol><li> Introducir el catéter en la tráquea<ol><li> La eutanasia el ratón por inyección intraperitoneal de una dosis letal de anestesia de barbitúricos de acción corta usando una aguja de 26 G. Para confirmar la anestesia adecuada letal, pellizcar la pata trasera del ratón con una pinza para comprobar el reflejo del pie. </li><li> Colocar el animal en su parte posterior en una placa quirúrgica y fijar el ratón por la fijación abajo las extremidades. </li><li> Pulverizar 70% de etanol en el cuello para desinfectar. Hacer una incisión en la piel del cuello, cerca de la tráquea utilizando un bisturí. </li><li> Abrir la piel para exponer las glándulas salivales. Separar las glándulas salivales mediante el uso de tenazas para exponer el músculo esternohioideo. Incisión en el músculo alrededor de la tráquea utilizando pinzas para exponer la tráquea. </li><li> Colocar un hilo de algodón bajo la tráquea usando pinzas. </li><li> perforar con cuidado el medio de la tráquea expuesta entre dos anillos de cartílago con una aguja 26 G. Tenga cuidado de no dañar la tráquea más allá. </li><li> Insertar el catéter alrededor de 0,5 cm en la tráquea. Asegúrese de que el catheter no se inserta demasiado abajo en la tráquea, ya que esto puede conducir a un daño de la estructura pulmonar. </li><li> Estabilizar el catéter mediante la vinculación de la tráquea alrededor del catéter usando el hilo de algodón se coloca en el paso 2.1.5. Si el catéter no está ligado lo suficiente, la solución de sal equilibrada inyectado puede fluir hacia la parte superior del tracto respiratorio en lugar de hacia abajo en los pulmones. </li></ol></li><li> Recoger el líquido de lavado <ol><li> Cargar una jeringa de 1 ml con 1 ml de solución salina equilibrada estéril con 100 mM EDTA. </li><li> Conectar la jeringa 1 ml al catéter e inyectar suavemente la solución de sal / EDTA en el pulmón. </li><li> Aspirar la solución suavemente mientras que el masaje el tórax del ratón. Si el fluido aspirado no es visible en la jeringa, insertar cuidadosamente el catéter un poco más abajo o hasta la tráquea. </li><li> Retire la jeringa de la aguja y transferir el fluido de lavado recuperado en un tubo de 15 ml se colocó en hielo. Normalmente, el 700 - 900 y# 181; L de BAL se recupera de 1 ml de solución inyectada. </li><li> Repita los pasos 2.2.1 - 2.2.4 dos veces más. NOTA: Si el propósito es analizar el contenido no celular, se recomienda concentrar las muestras reunidas cuando hay problemas con la sensibilidad. </li></ol></li></ol> 3. Recogida de los componentes celulares y no celulares del fluido BAL <ol><li> Centrifugar el líquido de lavado durante 7 minutos a 400 xg y 4 ° C. </li><li> Recoger el sobrenadante e inmediatamente utilizarlo para un análisis adicional (por ejemplo, ELISA) o congelación a -80 ° C. Mantener el sedimento celular a analizar la afluencia celular en los pulmones. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 200 l de tampón de lisis ACK. NOTA: Este paso asegura la lisis de los eritrocitos, manteniendo intactas las células blancas de la sangre. </li><li> Incubar durante 2 min a TA. Nota: Para reducir la variación causada por la lisis de glóbulos rojos, este paso no debe realizarse durante más de 2 min. </li&gt; <li> Añadir 1 ml de PBS frío para diluir el tampón de lisis ACK. </li><li> Centrifugar durante 7 min a 400 xg y 4 ° C. Descartar el sobrenadante y volver a suspender las células en un volumen adecuado de PBS para el análisis de aguas abajo (ver abajo). NOTA: El volumen de la PBS depende del estudio de aguas abajo que se va a realizar. </li></ol> 4. Análisis de los diferentes tipos de células en el líquido BAL mediante citometría de flujo NOTA: Una posibilidad es analizar la composición celular absoluta y relativa del fluido BAL mediante la realización de citometría de flujo. El objetivo de este trabajo es la elaboración de la técnica de BAL. La citometría de flujo es una técnica especializada por su cuenta. Se recomienda leer los papeles especializados en la técnica de citometría de flujo 13, 14, 15, 16, 17. Anticuerpos acoplados a un fluoróforo tReconocen los antígenos de superficie (véase la Tabla 1 ) específicos de un tipo o tipos de células particulares. Usando una estrategia de gating, es posible identificar células T, macrófagos, células dendríticas, células B, eosinófilos y neutrófilos en la fracción celular del BAL. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antígeno </td><td> Tipo de célula </td></tr><tr><td> Clúster de diferenciación 3 (CD3) </td><td> Expresado en células T </td></tr><tr><td> Clúster de diferenciación 11c (CD11c) </td><td> Alta expresión en la mayoría de las células dendríticas, pero también en monocitos, macrófagos, neutrófilos y algunas células B. </td></tr><tr><td> Clúster de diferenciación 11b (CD11b) </td><td> Expresado en la superficie de muchos leucocitos incluyendo monocitos, neutrófilos, células asesinas naturales, granulocitos y macrófagos. </td></tr><tr><td> SiglecF </td><td> UNmacrófagos y eosinófilos lveolar. </td></tr><tr><td> MHCII </td><td> Que normalmente se encuentran sólo en células presentadoras de antígeno tales como células dendríticas, los fagocitos mononucleares y las células B. </td></tr><tr><td> CD19 </td><td> antígeno de linfocitos B </td></tr><tr><td> Ly-6G </td><td> Un marcador de monocitos, granulocitos y neutrófilos </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Selección de Inmunes Los antígenos de superficie celular. Esta tabla proporciona una lista de los epítopos de superficie utilizados para caracterizar los diferentes tipos de células. Se requerirán combinaciones de varios marcadores para definir de manera fiable un tipo de célula específico. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Las muestras </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antígeno-fluoróforo que se añaden a las células </Td&gt; <td> Concentración de stock de anticuerpos (mg / ml) </td><td> Dilución de anticuerpos </td><td> Volumen total (μl) </td></tr><tr><td></td><td> Colorante de viabilidad fijable </td><td> 0,2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11c </td><td> 0,2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> SiglecF </td><td> 0,2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Muestra X </td><td> MHCII </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD3 </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD19 </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11b </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> Ly6G </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Controles de tensión </Fuerte </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antígeno-fluoróforo que se añade a las células </td><td> Concentración de stock de anticuerpos (mg / ml) </td><td> Dilución de anticuerpos </td><td> Volumen total (μl) </td></tr><tr><td> Células no conservadas </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células teñidas individuales </td><td> Colorante de viabilidad fijable </td><td> 0,2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células teñidas individuales </td><td> CD11c </td><td> 0,2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células teñidas individuales </td><td> SiglecF </td><td> 0,2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células teñidas individuales </td><td> MHCII </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células teñidas individuales </td><td> CD3 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células teñidas individuales </td><td> CD19 </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células teñidas individuales </td><td> CD11b </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Células teñidas individuales </td><td> Ly6G </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Controles de compensación </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antígeno-fluoróforo a ser añadido a perlas </td><td> Concentración de stock de anticuerpos (mg / ml) </td><td> Dilución de anticuerpos </td><td> Volumen total (μl) </td></tr><tr><td> Granos no madurados </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Cuentas manchadas individuales </td><td> CD11c </td><td> 0,2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td&gt; </tr><tr><td> perlas teñidas individuales </td><td> SiglecF </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> perlas teñidas individuales </td><td> MHCII </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> perlas teñidas individuales </td><td> CD3 </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> perlas teñidas individuales </td><td> CD19 </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> perlas teñidas individuales </td><td> CD11b </td><td> 0.2 </td><td> 1/400 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> perlas teñidas individuales </td><td> Ly6G </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Lista de los controles que se deben incluir. Esta tabla muestra todos los controles necesarios para la correcta interpretación de los resultados obtenidos. <ol><li> tinción de la superficie celular NOTA: Es impoPara incluir todos los controles críticos para el análisis de citometría de flujo. Se necesitan tres juegos de tubos (ver Tabla 2 ): (1) tubos que contienen las muestras; (2) tubos con células BAL para cada anticuerpo-fluoróforo para hacer manchas únicas; Esto permite la determinación de las tensiones para cada canal en el citómetro de flujo; Y (3) tubos con perlas para cada anticuerpo-fluoróforo para hacer manchas únicas; Esto es para determinar la matriz de compensación. <ol><li> Hacer una mezcla de los anticuerpos y bloque Fc (anti-CD16 / CD32) en PBS a las diluciones apropiadas (ver Tabla 2 ). Es necesario determinar la dilución de trabajo óptima para cada anticuerpo antes del experimento. </li><li> Resuspender las células en 50 μL de la mezcla de anticuerpos para la muestra y añadir 50 μl del anticuerpo diluido apropiadamente a los controles críticos. NOTA: La tinción puede realizarse en una placa de 96 pocillos en forma de &quot;U&quot;. Esto hace posible reducir fácilmente el volumen de mancha aY ejecutar cantidades significativas de muestras. </li><li> Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Centrifugar durante 7 min a 400 xg y 4 ° C. Deseche el sobrenadante. </li><li> Re-suspender las células en PBS a un volumen final de 200 μL. NOTA: Este volumen final depende del volumen mínimo al que puede acceder el citómetro de flujo. Esto puede variar ligeramente entre las máquinas. Además, el volumen de lectura depende del número de células y / o del tiempo que tardará la muestra en ejecutarse en el citómetro de flujo. </li><li> Utilizar las muestras y los controles para el análisis de citometría de flujo. NOTA: Para determinar el número de células absoluto de las diferentes poblaciones de células, se deben agregar cuentas. Añada el mismo número de cuentas (± 25.000 cuentas) a cada muestra justo antes de la medición. Mediante el uso de dispersión directa y lateral, las cuentas de recuento se pueden identificar por citometría de flujo (véase la figura 1 ). Posteriormente, el número absoluto de células en la muestra se puede calcular comparandoE de acontecimientos de la perla a los acontecimientos de la célula. Se puede utilizar la siguiente fórmula: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55398/55398eq1.jpg" /></li></ol></li><li> Análisis de citometría de flujo NOTA: El análisis de citometría de flujo debe realizarse inmediatamente después de completar el protocolo de tinción. Se debe utilizar un citómetro de flujo con láser y filtros adecuados para la detección de señales. La Tabla 3 da una visión general de los láseres y filtros necesarios para el estudio descrito en este manuscrito. Para obtener más información sobre el análisis de citometría de flujo, véase Adan et al. 18 . <ol><li> Establezca las puertas primarias basadas en la dispersión delantera y lateral, excluyendo restos y dobletes (vea la Figura 1 ). </li><li> Ajustar el voltaje y la compensación para la superposición espectral con la ayuda de las células de un solo color y cuentas. NOTA: Estos ajustes son diferentes para cada citómetro de flujo y deben comprobarse antes de cada experimento. Fo análisis de flujo correcta, los voltajes prospectivas y de lado de dispersión son críticos. Una dispersión correcta hacia adelante y lateral puede ayudar en la identificación y la confirmación de la identidad de las células analizadas. Para determinar estas tensiones, una muestra sin teñir se debe ejecutar primero. </li><li> Configurar puertas de fluorescencia para el antígeno de superficie (véase la Figura 1) y analizar las muestras. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tipo de láser </td><td> configuración del filtro </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 505 LP </td><td> 525/50 </td></tr><tr><td> Azul (488 nm) </td><td> 550 LP </td><td> 575/26 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td> 670 LP </td><td> 685/35 </td></tr><tr><td></td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr><tr><td> violeta 405 nm </td><td></td><td> 450/50 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td></td><td></td></tr><tr><td> rojo 633 nm </td><td></td><td> 660/20 </td></tr><tr><td> 70 mW </td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr></tbody></table> Tabla 3: Resumen de los láseres y filtros del citómetro de flujo utilizado en este estudio.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

BAL es una técnica útil para obtener citológico e información bioquímica en respuesta a infecciones o drogas. Inicialmente, BAL se utiliza para gestionar la producción excesiva de moco en pacientes humanos que sufren de toxicidad fosgeno 3. Hoy en día, la técnica se utiliza en los seres humanos para investigar la patogénesis de pulmón, el diagnóstico y manejo terapéutico de enfermedades 3, 24. En animales de laboratorio, BAL se utiliza comúnmente para controlar las respuestas inflamatorias, mecanismos inmunes, y los procesos de enfermedades infecciosas que se producen en las vías respiratorias pulmonares 1, 2. Para estudiar el patrón celular inflamatoria en modelos de enfermedades respiratorias, BAL debe ser seguido por el recuento de células absoluta y diferencial. Además del número de células absoluto, los números de células relativos son también de interés. Por ejemplo, los modelos de reparación y cáncer muestran vPequeño o ningún recuento de células BAL aumenta. En este modelo, la evaluación de la composición celular es útil. Mediante el uso de tinción celular combinado con microscopía óptica, se pueden identificar diferentes tipos de células, tales como eosinófilos, neutrófilos, macrófagos y linfocitos, basándose en la morfología 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Citometría de flujo se puede utilizar para las evaluaciones específicas, tales como identificar diferentes fenotipos de células T [ 7 , 31] . Además de la identificación de las diferentes poblaciones de células infiltrantes, la composición no celular del pulmón puede ser investigada usando BAL. Métodos tales como ELISA, inmunoblot, matriz de perlas de citocinas, inmunohistoquímica, y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa se realizan sobre el fluido BAL para determinar las citoquinas, el crecimientofactores, y otros componentes inflamatorios. Para determinar el daño pulmonar, el total de los niveles de proteína y lactato deshidrogenasa en el fluido BAL se pueden medir también 32, 33. Con el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico, la caracterización genómica y proteómica de los componentes BAL será posible en un futuro próximo. La combinación de expansión de las capacidades computacionales y tecnologías de expresión génica de alto rendimiento hará que sea posible definir los perfiles de expresión de genes específicos para diversos estados de enfermedad. La realización de estas técnicas en fluido BAL puede proporcionar patrones de expresión génica y proteica para identificar las moléculas importantes que intervienen en las diferentes fases de enfermedades pulmonares. La principal limitación de los datos obtenidos a partir de fluido BAL es la falta de comparabilidad entre los diferentes ensayos de investigación 3, 9. Hay un alto grado deVariabilidad en la técnica de lavado y el posterior procesamiento de líquido BAL. Para poder comparar cada ensayo BAL, es necesario estandarizar el tipo de fluido de lavado que se inculca, el sitio de instilación, y la fracción que se va a analizar para la composición celular y no celular. Existen diferencias significativas en el número de fracciones de lavado entre diferentes ensayos, variando de uno a 14 veces 34 , 35 , 36 . Esta diferencia puede tener un impacto en el número total estimado de células en los pulmones. Es importante saber qué fracción de líquido BAL contiene la mayoría de las células. Song et al. Mostró que aproximadamente el 70% del número total de células fueron recuperados en la fracción uno a tres [ 22] . Sin embargo, otros informes sugieren que el segundo lavado contenía más células que la primera 37 , 38 </sup&gt;. Podemos concluir de estos estudios que un lavado con una sola fracción no representa el pulmón completo, lo que conduce a la mala interpretación de los resultados. La composición no celular del líquido BAL contiene información valiosa sobre el estado de salud del pulmón 33 , 39 , 40 . Las variaciones en la dilución del líquido BAL contribuyen a la diferencia en la cuantificación de la fracción soluble y, en consecuencia, a las diferencias en los resultados entre ensayos. Song et al. Compararon los niveles de proteína y lactato deshidrogenasa de cada fracción de lavado y concluyeron que la primera fracción de lavado contenía de dos a tres veces más que la segunda fracción. Para obtener una muestra BAL representativa para su análisis, algunas consideraciones técnicas son cruciales. Uno de ellos es realizar anestesia adecuada. Es muy importante comprobar el pie reflex del ratón para asegurar la sedación terminal. Esto es importante no sólo por razones éticas, sino también porque es difícil de colocar y retener el catéter en la posición correcta si el ratón no está anestesiado adecuadamente. Una segunda consideración técnica importante es la posición del catéter en la tráquea. Cuando se inserta demasiado profundo el catéter, puede dañar la estructura del pulmón. El extremo distal del catéter no debe llegar a los pulmones durante el procedimiento de BAL. El catéter también debe ser estabilizado y se ata con un hilo de algodón. Si el catéter no se estabiliza, la solución salina inyectado puede fluir hacia arriba en la cavidad nasal en lugar de hacia abajo en los pulmones. Durante la inyección y aspiración de la solución salina, es importante mantener el catéter constante. Los datos obtenidos a partir del fluido BAL deben representar todo el pulmón murino. Por lo tanto, es importante para infundir un volumen adecuado de tampón de solución salina (es decir,3 ml, divididos en 3 partes alícuotas de 1 ml de cada uno). No hay una relación lineal entre el rendimiento celular y el rendimiento de fluido BAL. Es importante para recoger la solución suavemente mientras que el masaje el tórax del ratón. Si las fuerzas de cizallamiento son demasiado fuertes, la viabilidad, la función y estructura de las células dentro del fluido BAL vías respiratorias y pueden verse comprometidas. Si el fluido aspirado no es visible en la jeringa, cuidadosamente mover el catéter más profundo o más alto en la tráquea. notificación debe prestar especial atención a aspectos específicos de procesamiento y análisis de BAL. Esto maximizará la información retenida a partir de muestras de BAL. Después de BAL, las células están en un medio salino pobres en nutrientes. Por lo tanto, es muy importante para procesar las muestras dentro de 1 h después del muestreo BAL. Si es necesario un almacenamiento prolongado, se requiere el uso de un medio nutriente suplementado. Para preservar la viabilidad celular, evitar tubos que promueven la adherencia de las células a la superficie. Evitar ceNtrifugación de suspensiones celulares a velocidades que puedan comprometer la integridad celular o evitar la resuspensión uniforme de las células BAL recuperadas. Las células que contienen fluido BAL deben ser centrifugadas a 400 xg y 4 ° C durante 7 min. Es importante tener en cuenta que las suspensiones de células deben mantenerse a 4 ° C durante el procesamiento.

Las vías respiratorias se encuentran con numerosas insultos, que pueden conducir a la inflamación, invasión de patógenos, o la transformación maligna. Las células epiteliales que recubren el lumen de pulmón forman una de las principales barreras del cuerpo de los mamíferos. Junto con los macrófagos alveolares, impiden que las amenazas ambientales de ganar la entrada al sistema sistémico a través de las vías respiratorias. Ejemplos de tales amenazas incluyen productos químicos orgánicos e inorgánicos, bacterias, y virus. Del mismo modo, las vacunas específicas o intervenciones terapéuticas pueden ser diseñados para apuntar a los pulmones. En todos estos casos, un análisis detallado de la respuesta evocada es importante entender, intervenir, o prevenir los procesos biológicos que tienen lugar dentro del sistema respiratorio. El lavado broncoalveolar (BAL) es un método muy valiosa para analizar tales respuestas, como las muestras resultantes contienen información importante acerca de las respuestas inflamatorias, mecanismos inmunes, y progresión de la enfermedad infecciosaque pueden ocurrir en las vías respiratorias pulmonares 1, 2. Mediante el uso de BAL, es posible estudiar las células infiltrantes. Esto contrasta con los pulmones digeridos, que dan una población de células &quot;sucio&quot;, con muchas células muertas y pegajosas. BAL se lleva a cabo mediante la introducción de una solución salina en los bronquiolos terminales y, posteriormente, la recuperación de esta solución. La solución recuperada se puede utilizar para cuantificar y analizar fenotípicamente pulmón residente y células inflamatorias infiltrantes. se aplica con frecuencia este método para estudiar afluencia celular en modelos de enfermedades de las vías respiratorias, tales como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), y modelos de enfermedades infecciosas. Aparte de la composición celular, la composición molecular de las vías respiratorias pulmonares también se refleja en el fluido BAL. Para analizar esto, inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunotransferencia, y el análisis simultáneo de múltiples citoquinas por una matriz de citoquinas perla puedeRealizado para evaluar la presencia de citocinas y quimiocinas. El BAL es un método bien establecido para estudiar la afluencia de células inflamatorias en modelos animales de enfermedades respiratorias inflamatorias. La observación de un influjo celular alterado ( por ejemplo, niveles aumentados de linfocitos, eosinófilos o neutrófilos) puede conducir a una mejor comprensión de la enfermedad y puede ser un parámetro objetivo para evaluar el desempeño de una intervención terapéutica. La interpretación precisa y reproducible del análisis celular BAL requiere que el BAL se realice correctamente y que el fluido recogido sea manejado y procesado adecuadamente. El término &quot;lavado bronquial&quot; fue introducido hace más de ochenta años por Stitt 3 . En 1961, Myrvik obtuvo macrófagos alveolares del líquido de lavado de pulmones de conejo 3 . BAL es ahora un método comúnmente utilizado para analizar y monitorear los pulmones en el modelo de ratón,Todavía no hay un informe de un procedimiento BAL estandarizado en la literatura científica 4 , 5 . Además, hay probablemente tantas maneras de realizar BAL como hay laboratorios de investigación utilizando la técnica 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Es importante que los datos obtenidos del BAL representen todo el pulmón murino, y no sólo una parte del pulmón. Este tipo de variabilidad complica la interpretación y comparación de resultados entre diferentes ensayos. Aquí, se describe un procedimiento BAL básico, barato y reproducible que permite la recogida de la fracción celular y soluble presente en el lumen de la vía aérea del ratón. En resumen, se coloca un catéter en la tráquea expuestaFa ratón terminalmente anestesiado. Una jeringa está conectada al catéter, y una solución salina tamponada que contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) se introduce en los pulmones. El lumen del pulmón se muestrea por lavado suave y repetido de la solución salina usando el émbolo. La presión negativa aplicada durante este paso es mínima para evitar el colapso de la vía aérea. Después de la recolección, el BAL obtenido debe procesarse adicionalmente para enumerar e identificar las células mediante citometría de flujo.

<table><tbody><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>ácido etileendiaminotetra acético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>irritante</td></tr><tr><td>aguja de 23 g x 1 1/4</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>tamaño: 0,60 x 30 mm</td></tr><tr><td>aguja de 26 g x 1/2 Henke</td><td>Sass Wolf</td><td>4710004512</td><td>tamaño: tubo de plástico de 0,45 x 12 mm</td></tr><tr><td></td><td>Tecnología médica BD</td><td>427411</td><td>Tubos de polietileno, diámetro interno 0,58 mm (0,023") diámetro exterior 0,965 mm (0,38") 30,5 m (100')</td></tr><tr><td>pentobarbital sódico</td><td>Kela NV</td><td>514</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS sin Ca2+ Mg2+ o rojo de fenol; jeringas estériles filtradas</td></tr> de <tr><td>1 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td>pinzas no pirogénicas y no tóxicas</td></tr><tr><td>Fine</td><td>Science Tools GmbH&nbsp;</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Fine Science Tools GmbH&nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga 50 mL</td><td>TH. Geyer</td><td>7696705</td> Tubo de centrífuga <td>libre de Rnasa / Dnasa / endotoxina</td></tr><tr><td>15 mL</td><td>TH. Tubo</td> de microcentrífuga Geyer <td>7696702</td><td>libre de ARNasa/Dnasa/endotoxinas</td></tr><tr><td>1,5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0030 120.094</td> microcentrífuga de <td>polipropileno</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>tampón de lisado de cloruro-potasio (ACK)</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td> con <td>filtro estéril</td></tr><tr><td>vivos/muertos - efluor 506</td><td>ebioscience</td><td>65-0866-18 &nbsp;</td><td>tinte de viabilidad fijable</td></tr><tr><td>CD11c-PE-cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF-PE</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>552126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MHCII-APCefluor780</td><td>Biolegend</td><td>107628&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE-cy5</td><td>VWR</td><td>55-0031-U100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE-cy5</td><td>eBiosciences</td><td>15-0193-83&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-V450</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>560455&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G-AF700</td><td>Biolegend</td><td>127621</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de conteo absolutas</td><td>Life Technologies Europe B.V.&nbsp;</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos 340 y micro; l placa de almacenamiento</td><td>Falcon</td><td>353263</td><td>parte inferior en V, citómetro de flujo de polipropileno natural</td></tr><tr><td></td><td>Catéter BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>393202</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lavage broncoalveolar (BAL) es un procedimiento experimental que se utiliza para examinar el contenido celular y acelular de la luz pulmonar ex vivo para obtener una visión de un estado de enfermedad en curso. Aquí, se describe un método simple y eficiente para realizar BAL en los pulmones murinos sin la necesidad de herramientas o equipos especiales. El líquido BAL se aísla insertando un catéter en la tráquea de ratones terminalmente anestesiados, a través de los cuales se instila una solución salina en los bronquiolos. El líquido instilado se retrae suavemente para maximizar la recuperación del líquido BAL y para minimizar las fuerzas de corte. Esta técnica permite conservar la viabilidad, la función y la estructura de las células dentro de las vías respiratorias y del líquido BAL. Numerosas técnicas se pueden aplicar para obtener una mayor comprensión de la enfermedad del estado del pulmón. Aquí, una técnica comúnmente utilizada para la identificación y enumeración de diferentes tipos de células inmunes es, En los que la citometría de flujo se combina con un panel selecto de marcadores fluorescentes marcados específicamente con la superficie celular. El procedimiento BAL presentado aquí también puede usarse para analizar agentes infecciosos, constituyentes de fluidos o partículas inhaladas en pulmones murinos.

Después de realizar BAL con 3x 1 ml de solución salina tamponada, un volumen de entre 2 y 3 ml debe ser recuperado. Este fluido BAL se puede analizar adicionalmente para caracterizar el contenido celular y no celular. Para investigar la presencia de citocinas y quimiocinas, ELISA 19, inmunotransferencia 20, y el análisis simultáneo de múltiples citoquinas por una matriz de citoquinas talón 21 se puede realizar. Además, el contenido de albúmina y de proteína total de este fluido se puede determinar 22. Como un ejemplo, este manuscrito describe cómo analizar el contenido celular del fluido BAL por citometría de flujo. El fluido BAL analizado se recogió a partir de ratones Balb / cAnNCrl hembra (edad: 7 semanas) 24 h después de que fueron instilada por vía intratraqueal con lipopolisacárido. Los siguientes anticuerpos, acoplados a un fluoróforo, wSe usaron para identificar los diferentes tipos de células: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g y CD11b (véase Tabla 1 y Tabla de Materiales ). También se usó el colorante de viabilidad fijable. Utilizando una estrategia de gating basada en la expresión diferencial de antígenos en las superficies de las diferentes poblaciones celulares ( Figura 1 ), fue posible identificar macrófagos, células dendríticas, células B, células T, neutrófilos y eosinófilos. En primer lugar, los restos y los dobletes se cerraron basándose en los parámetros de dispersión hacia adelante y hacia el lado. Un colorante de viabilidad facilitó la activación de las células vivas. A continuación, se identificaron células CD11c altas y células CD11c bajas. En la población CD11c alta, se identificaron macrófagos y células dendríticas basándose en la expresión de MHCII y SiglecF, respectivamente. En la población CD11c baja, se identificaron células T y células B basándose en la expresión de CD3ε y CD19, respectivamente. Ene restantes población celular, neutrófilos y eosinófilos se identificaron en base a la expresión de los marcadores CD11b y Ly-6G, respectivamente. Se añadieron perlas de recuento para determinar el número de células absolutos de las diferentes poblaciones celulares mediante la comparación de la proporción de acontecimientos de talón a los eventos celulares 23. Estas perlas de conteo se identificaron en base a su orientadas hacia y propiedades dispersión lateral (Figura 1). Tabla 4 proporciona una visión general de los números de células absolutos de las diferentes poblaciones de células en el fluido BAL de un ratón ingenuo y un ratón que fue estimulado durante 24 h con 5 g de lipopolisacárido. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55398/55398fig1.jpg" /> Figura 1: Estrategia de apertura de puerta para la citometría de flujo de detección de macrófagos, células dendríticas, células T, células B, neutrófilos y eosinófilos iFluid n BAL. Se aislaron células de BAL usando el protocolo descrito BAL. Las células fueron aisladas de los ratones 24 h después de la instilación intratraqueal de lipopolisacárido. contar bolas y las células se identificaron basándose en propiedades prospectivas y dispersión lateral. En la puerta de células, se identificaron células individuales utilizando dispersión frontal y lateral. En esta última población, se identificaron las células que estaban vivos. A continuación, se identificaron pilas de gran CD11c y las células de baja CD11c. En la alta población CD11c, se identificaron macrófagos y células dendríticas basado en la expresión MHCII y SiglecF, respectivamente. En el CD11c baja población, se identificaron las células T y células B basado en CD3e y la expresión CD19, respectivamente. En la población de células restante, se identificaron los neutrófilos y eosinófilos basado en CD11b y expresión Ly-6G, respectivamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55398/55398fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una</a>Versión más grande de esta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Población celular </td><td> Número absoluto de células en ratones ingenuos </td><td> Número absoluto de células en ratones estimulados con LPS </td></tr><tr><td> Macrófagos </td><td> 79.612 </td><td> 25.439 </td></tr><tr><td> células dendríticas </td><td> 495 </td><td> 671 </td></tr><tr><td> Células T </td><td> 45.271 </td><td> 28.089 </td></tr><tr><td> Células B </td><td> 4.164 </td><td> 2.926 </td></tr><tr><td> Neutrófilos </td><td> 632 </td><td> 566.716 </td></tr><tr><td> Eosinófilos </td><td> 3.483 </td><td> 4.332 </td></tr></tbody></table> Cuadro 4: RepresenResultados tativos del Análisis de citometría de flujo sobre el fluido BAL de los ratones estimulados con LPS Naïve y.

El estado de salud de los pulmones se refleja por el tipo y número de células inmunitarias que están presentes en los bronquiolos del pulmón. Se describe una técnica de lavado broncoalveolar que permite el aislamiento y estudio de las células no adherentes y factores solubles en el tracto respiratorio inferior de los ratones.

Lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener los contenidos celulares y acelulares del lumen pulmonar mediante lavado broncoalveolar para análisis ex vivo y para evaluar el estado actual de la enfermedad en el animal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología respiratoria sobre los mecanismos inmunitarios inducidos por infección e inflamación, mediante la cuantificación de las respuestas innatas celulares y humorales en el pulmón. Las principales ventajas de esta técnica son que es sencilla, eficiente y altamente reproducible, y no requiere equipos ni herramientas especiales.Antes de comenzar el procedimiento, cree un catéter insertando una aguja de calibre 23 en un trozo de 0,5 centímetros de tubo de polietileno plástico transparente de calibre 21 y coloque al animal en posición supina. Sujete las extremidades del ratón y desinfecte el cuello con etanol al 70 %. Luego, use un bisturí para realizar una incisión en la piel cerca de la tráquea.Abra la piel para exponer las glándulas salivales y use pinzas para separar las glándulas y revelar el músculo hioides esternal. Use las pinzas para incisionar el músculo alrededor de la tráquea. Cuando sea visible, use las pinzas para pasar una sutura de algodón debajo del tejido traqueal.A continuación, utilice una aguja de calibre 26 para perforar cuidadosamente el centro de la tráquea entre dos anillos cartilaginosos e inserte el catéter previamente preparado aproximadamente 0,5 centímetros dentro de la luz traqueal. Estabilice el catéter con el hilo de sutura. Luego, cargue una jeringa de un mililitro con un mililitro de solución salina balanceada estéril suplementada con 100 micromolar de EDTA.Conecte la jeringa cargada al catéter e inyecte suavemente la solución salina balanceada y EDTA en el pulmón. Cuando se haya inyectado toda la solución salina, aspire suavemente la solución mientras masajea el tórax. Es muy importante tener cuidado al inyectar y al recuperar el líquido para maximizar la recuperación del líquido de lavado broncoalveolar y minimizar las fuerzas de cizallamiento.Si el fluido sólido pasa por la nariz, asegure nuevamente la sutura a lo largo del catéter. Cuando se haya recogido todo el aspirado, transfiera el líquido a un tubo de 15 mililitros sobre hielo y repita la lavado otras dos veces. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en siete minutos si se realiza adecuadamente.Después de la tercera recogida de lavado broncoalveolar, centrifugar el aspirado combinado y almacenar el sobrenadante a 80 grados centígrados bajo cero. Re-suspender el sedimento en 200 microlitros de tampón de lisis ACK. Tras no más de dos minutos a temperatura ambiente, diluir el tampón de lisis con un mililitro de PBS frío y recoger las células mediante centrifugación.Re-suspenda el precipitado en el volumen adecuado de PBS según el número de muestras que se analizarán y alícuote las células en el número apropiado de pocillos de una placa de 96 pocillos para el análisis. Recopile las células mediante otra centrifugación y re-suspenda los precipitados en 50 microlitros de bloqueo FC y PBS. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, agregue 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos adecuada de interés a cada pocillo e incube las células durante 30 minutos a 4 grados centígrados protegidas de la luz.Al final de la incubación, centrifugue la placa y deseche el sobrenadante, re-suspendiendo los pellets en un volumen final de 200 microlitros de tampón FAX por pocillo para el análisis citométrico de flujo. Mediante una estrategia de selección basada en la expresión diferencial de antígenos en las superficies de diversas poblaciones celulares del lavado broncoalveolar, es posible identificar una variedad de tipos de células inmunitarias. Las células y los singletes se seleccionan según sus propiedades de dispersión hacia adelante y lateral.Se seleccionan las células negativas para el colorante de viabilidad/muerte, seguido por la identificación de las células Cd11c Alta y Cd11c Baja. En la población Cd11c Alta, los macrófagos y las células dendríticas pueden identificarse según su expresión de MHC-II y SinglecF, respectivamente. En la población Cd11c Baja, las células T y las células B pueden identificarse según su expresión de CD3/CD19 y MHC-II, respectivamente.En las células restantes, los eosinófilos y los neutrófilos pueden identificarse por su expresión del marcador Cd11b o Ly-6G, respectivamente. También se pueden agregar cuentas de conteo para determinar los números absolutos de células de las diferentes poblaciones celulares comparando la relación de eventos de cuentas frente a células, por ejemplo, en animales naïve frente a estimulados con LPS. Después de recolectar el líquido de lavado broncoalveolar (BAL), se pueden realizar otras técnicas como ELISA, inmunotransferencia o matriz de cuentas para citocinas para responder preguntas adicionales sobre el contenido acelular del líquido BAL.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la inmunología exploraran el contenido celular y acelular del lumen pulmonar de los ratones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar de manera eficiente y reproducible el lavado broncoalveolar (BAL).

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Mediciones repetidas de la fisiología respiratoria y el muestreo de roedores de las células de las vías respiratorias inflamatorias son deseables, pero en general no es factible. A continuación se describe un método reproducible para la intubación por vía oral ratones que permite mediciones repetidas de la hiperreactividad de las vías respiratorias y el muestreo de las células de las vías respiratorias inflamatorias.

A reversible, método no invasivo para las mediciones de resistencia de las vías y Toma de Muestras Líquido del Lavado broncoalveolar en ratones

Nos ilustran no quirúrgico de entrega de materiales de prueba en los pulmones de ratones anestesiados a través de la tráquea. Este método permite la exposición del pulmón a los patógenos bacterianos y virales, las citocinas, los anticuerpos, los granos, productos químicos, ni colorantes. Nos describen con más detalle la recolección y procesamiento de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón (LDLNs) por citometría de flujo.

No quirúrgico instilación intratraqueal de ratones con el análisis de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón por citometría de flujo

Fuente: Venuprasad, K., et al. Administración intratraqueal de Haemophilus influenzae en modelos de ratón para estudiar la inflamación de las vías respiratorias. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la recolección y el procesamiento del líquido de lavado broncoalveolar de un ratón sacrificado infectado con Haemophilus influenzae no tipificable para su análisis posterior.

Recolección de líquido de lavado broncoalveolar de un modelo de ratón infectado con Haemophilus influenzae no tipificable

Este video demuestra el uso de la citometría de flujo para identificar y contar varias células inmunitarias en el líquido de lavado broncoalveolar. Inicialmente, las células inmunitarias individuales se identifican utilizando un colorante de viabilidad, seguido de la tinción diferencial de las proteínas marcadoras de superficie, lo que permite la enumeración precisa de cada tipo de célula.

Identificación y enumeración de células inmunitarias en líquido de lavado broncoalveolar mediante citometría de flujo

Este video muestra una técnica in vitro para identificar células inmunitarias que residen en pulmones murinos. Después de aislar las células inmunitarias diana del tejido pulmonar murino, se marcan en la superficie utilizando un cóctel de anticuerpos marcados con fluoróforos contra marcadores específicos en las células inmunitarias innatas y adaptativas. Además, los monocitos, macrófagos y células dendríticas se marcan mediante un marcador intracelular. A continuación, se identifican los...

Un método in vitro para identificar células inmunitarias innatas y adaptativas que residen en pulmones murinos

La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

Se describe un método para inducir la inflamación pulmonar neutrofílica por desafío para el lipopolisacárido de aerosol por nebulización, para modelar la lesión pulmonar aguda. Además, también se describen técnicas quirúrgicas básicas para la separación de pulmón, la intubación traqueal y lavado broncoalveolar.

Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.

Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Los ratones expuestos al ozono combinado y a las endotoxinas bacterianas muestran una muerte celular muy extendida, incluida la de los neutrófilos. Observamos adaptaciones celulares tales como interrupción del lamellipodia citoesquelético, expresión celular creciente de la subunidad compleja del synthase del ATP de V β y angiostatin en lavado bronco-alveolar, supresión de la inmunorespuesta del pulmón y reclutamiento retrasado del neutrófilo.

Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS

En este estudio, presentamos un protocolo eficaz y reproducible para aislar las poblaciones inmunes del sistema respiratorio murino. También proporcionamos un método para la identificación de todas las células inmunes innatas y adaptativas que residen en los pulmones de ratones sanos, utilizando un panel de citometría de flujo basado en 9 colores.

Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

Aquí, describimos la medición de la tos utilizando un sistema de pletismografía de cuerpo entero (WBP) no invasivo y en tiempo real y los procedimientos normativos para la recolección de muestras de tejido de ratones e introducimos algunos métodos para evaluar la inflamación de las vías respiratorias.

Métodos para detectar la tos y la inflamación de las vías respiratorias en ratones

Aprende el lavado broncoalveolar en ratones para analizar células inmunitarias pulmonares mediante citometría de flujo. Este método simple y reproducible permite estudiar mecanismos de infección e inflamación respiratoria.

Lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias

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