Name: La evaporación de reducción de Cultura condición aumenta la reproducibilidad del esferoide multicelular Formación en placas de microtitulación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende a formar esferoides multicelulares uniformes mediante la técnica de recubrimiento líquido en placas de 384 pocillos. Este método reduce la pérdida de medio y mejora la reproducibilidad en ensayos de cribado de fármacos.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Educación Checa, Juventud y Deportes (LO1304) y la Agencia Tecnológica de la República Checa (TE01020028). Los autores desean agradecer al Dr. Lakshman Varanasi para tomar las imágenes fijas de tapas ambientales.

1. Preparación de placas recubiertas con agarosa <ol><li> Pesar 0,75 g de agarosa de bajo punto de fusión y añadirlo a 100 ml de medio 5A de McCoy (con o sin rojo fenol) sin suero. Calentar la solución en un horno de microondas y agitar cada 1-2 min para disolver completamente la agarosa. Autoclave la solución para esterilizarlo. </li><li> Se enfría la autoclave de agarosa a aproximadamente 70 ° C y filtrar a través de un 500 mL, 0,22 micras filtro superior por filtración a vacío en una caja de flujo laminar. Alícuota del 0,75% filtrada solución de agarosa (FAS) en volúmenes más pequeños si no se utiliza la solución completa de una vez. Almacenar esta solución de agarosa asépticamente listos para usar en una habitación fría o 4 ° C refrigerador hasta por 4 semanas. </li><li> Adjuntar un pequeño tubo con una Plastica- o casete de dispensación con punta de metal para un dispensador de reactivos Combi y cebar la casete con 70% de etanol (EtOH) y después con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en un cuadro de flujo. </li><li> Antes de su uso, calentar una alícuota almacenada de FAS i<html> n el microondas para que se derrita. El primer casete de dispensación con una solución de agarosa y el abrigo de 384 pocillos, cultivo de tejidos (TC) tratados con &quot;especial&quot; microplacas con 15 l de FAS. Deje que la agarosa en la placa se enfríe durante 15-20 minutos antes de sembrar las células. Almacenar las placas de agarosa recubiertas de forma aséptica, envuelto en una bolsa de polietileno en una habitación fría o a 4 ° C y protegido de la luz directa. NOTA: Evitar el calentamiento repetido del 0,75% FAS para evitar un cambio en la concentración de agarosa en la solución madre. placas de agarosa recubiertas de se pueden almacenar durante hasta 2 semanas cuando se almacena bajo las condiciones antes mencionadas. El FAS no requiere calentamiento durante el recubrimiento de placas. </li><li> Limpiar el casete de dispensación cebando con 70-80 ° C agua estéril para eliminar cualquier resto de agarosa en la punta de cassette y tubos. </li></ol> 2. Cultivo Celular y MCTS Formación <ol><li> HCT116 células de carcinoma colorrectal humano Cultura, como se ha descrito anteriormentelass = &quot;xref&quot;&gt; 8. </li><li> Eliminar el número requerido de agarosa recubiertas, de 384 pocillos, TC-tratados microplacas de almacenamiento en frío y se equilibre a temperatura ambiente (RT) durante 15 min. </li><li> Preparar el dispensador de reactivos Combi para la siembra de células cebando un casete de dispensación tubo estándar con EtOH al 70% y PBS estéril. Ajuste el volumen a la siembra l requerida y la velocidad de dispensación al medio utilizando los botones de ajuste manual en el dispensador. NOTA: El proceso de la siembra de células se lleva a cabo en condiciones estériles y en un cuadro de flujo laminar. </li><li> Disociar las células adherentes del matraz de cultivo de tejidos usando una enzima de disociación celular recombinante. Hacer una acción suspensión de células en un vaso de precipitados estéril con células de semillas a una densidad de 2,5 x 10 4 células / ml por pocillo en 50 l de medio de crecimiento completo. Cuando la siembra de más de un 384-WP, remover las células usando un agitador magnético para evitar que depositarse en el fondo del vaso de precipitados. </li><li> permitir que elplacas en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante 15 minutos a 4 x g. </li><li> Mientras tanto, tomar una tapa de la evaporación del medio ambiente reductor y llenarlo con 8 ml de H2O estéril o el 5% de dimetilsulfóxido (DMSO) en los lados cortos (izquierda y derecha) usando una pipeta de 5 ml (Figura 1A). En primer lugar, prescindir 4 ml de líquido de relleno en la pila de la izquierda mediante el barrido de la punta de la pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo. Repita este paso con el canal del lado derecho. NOTA: Asegúrese de que el líquido añadido a los canales secundarios no mezcla en el centro de la tapa y dejar un espacio para el intercambio de gases (Figura 1A). La adición de una cantidad excesiva de H 2 O resultados en la filtración de H2O en el exterior de la tapa y, posteriormente, en los pocillos exteriores de las placas de 384 pocillos TC. </li><li> Llenar el depósito de líquido de la placa de TC de 384 pocillos con H 2 O estéril y vuelva a colocar las tapas de placas regulares con las tapas ambientales llenas de líquido (Figura 2A). </li><li> Colocar las placas en una incubadora rotativa 37 ° C con 95% de humedad, 5% de CO 2, y 20% de O 2, y permitir que las células se agregan en MCTSes durante 4 días. Evitar la apertura de la puerta de la incubadora durante demasiado tiempo en los días posteriores a fin de evitar que el nivel de humedad caiga bruscamente. </li></ol> 3. Intercambio media usando un sistema robótico <ol><li> En el día 4 después de la formación de MCTS, añadir 30 l de medio de pre-calentado por pocillo usando un dosificador lavador de microplacas automatizado. Permitir que los MCTSes crecer durante 3 días adicionales. Reemplazar el medio regularmente cada 3 días, hasta que alcancen el tamaño deseado para la experimentación. </li><li> Para aspirar un volumen definido de medio de cada pocillo, empíricamente ajustar el -altura z del colector de la lavadora. Aspirar 30 l de medio por pocillo y reemplazarlo con 30 l de medio fresco, pre-calentado. NOTA: Ajuste la velocidad de dispensación y la velocidad a la que el colector se desplaza hacia abajo la arandelaen los pozos en la tarifa más baja para minimizar la turbulencia en los pozos. </li></ol> 4. Imágenes de alta contenido de los MCT y análisis de imágenes semi-automatizado <ol><li> La imagen de MCTS en un sistema automatizado de imágenes de alto contenido utilizando un objetivo de aire 4X (NA 16). </li><li> Ajuste el tiempo de exposición a 11 ms y el binning de 4 x 4. Ajuste el número y el espaciamiento de los -stacks Z y el pixel binning como se desee para el experimento para capturar todo un MCTS por pocillo. </li><li> Procesar las imágenes paso a paso, como se describe en el &quot;readme&quot;, usando una rutina de la casa escrito en lenguaje de programación. Nota: El código .m y léame .txt archivos están disponibles como archivos de código suplementarios (Figura 1B). Las medidas rutinarias de la zona de MCTS, ejes mayor y menor, el perímetro y la solidez de las imágenes 2D. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55403/55403fig1.jpg" /> Figura 1:Preparación de tapas ambientales y un diagrama de flujo de la rutina de semi-automática. (A) Imagen de una tapa de la evaporación del medio ambiente reductor de lleno con el correcto (izquierda) y el exceso (a la derecha) la cantidad de líquido que llena (en este caso, 5% de DMSO). La flecha indica la cubeta de lado corto para añadir líquido. El asterisco muestra el hueco en el centro de la tapa después de la adición del volumen correcto de DMSO. (B) Un flujo de trabajo que muestra las etapas implicadas en la rutina de análisis de imagen semi-automatizado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55403/55403fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<ol><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+relevant+in+vitro+tumor+models+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening.</a> Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).</li>
<li>Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+angiogenic+capability+is+regulated+by+3D+culture+and+integrin+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).</li>
<li>Lao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Methods+to+Generate+Spheroid+Cultures+from+Tumor+Cells%2C+Tumor+Cells+%26+Fibroblasts+or+Tumor-Fragments%3A+Microenvironment%2C+Microvesicles+and+MiRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133895(2015).</li>
<li>Wenzel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-content+screening+for+the+identification+of+compounds+that+target+cells+in+dormant+tumor+spheroid+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions.</a> Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Models+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Breast+Cancer+Metastasis%3A+High-Throughput+Screening+Assay+Development%2C+Validation%2C+and+Pilot+Screen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).</li>
<li>Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+Uniform+Spheroid+Formation+in+384-Well+Plates%3A+The+Effect+of+Medium+Evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation.</a> J. Biomol. Screen. , (2016).</li>
<li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+imaging-based+platform+for+high-content%2C+quantitative+evaluation+of+therapeutic+response+in+3D+tumour+models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models.</a> Sci. Rep. 17 (4), 3751(2014).</li>
<li>Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+tumor+spheroid+culture+model+amenable+to+high-throughput+testing+of+potential+anticancer+nanotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome+Res%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics.</a> J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).</li>
<li>Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+liquid+overlay+technique+to+formulate+heterogenic+3D+co-cultures+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).</li>
<li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/1087057114532352">A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity.</a> Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).</li>
<li>Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+evaporation+for+more+robust+microscale+assays.+Part+1.+Volume+loss+in+high+throughput+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays.</a> Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci. Rep. 6, 19103(2016).</li>
<li>Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Evaluation+of+Oxygen+and+Water+Permeation+through+Microplate+Sealing+Tapes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes.</a> Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).</li>
<li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li>
<li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids%3A+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El recubrimiento de placas de 384 pocillos con filtro de CT con agarosa La práctica estándar en la LOT es utilizar un punto de agarosa de baja fusión 1-1,5% para recubrir las placas, lo que requiere la agarosa y / o unidad de distribución que deben tenerse climatizada para evitar la gelificación de la agarosa 6. La gelificación de la agarosa es materia de preocupación mientras se prepara múltiples platos usando casetes de dispensación de líquido con pequeñas aberturas de...

Las células de cáncer en los tumores están dispuestos fisiológicamente en una estructura compleja, 3 dimensiones (3D), rodeada de matriz extracelular y células que interactúan. Como casi todas las células en los tejidos residen en un entorno 3D, la necesidad de más fisiológicamente relevante en modelos de tumores in vitro que imitan los rasgos tumorales se ha traducido en el desarrollo de varias técnicas de cultivo 3D 1, 2, 3. Estos modelos se están convirtiendo en herramientas fundamentales de investigación para estudiar el papel del microambiente del tumor en respuesta metástasis y celular a la terapéutica en 3D 2. Por otra parte, en comparación con 2-dimensionales cultivos celulares (2D) 4, los modelos 3D permiten una mejor comprensión de las interacciones tumor-estroma, que afectan a las vías de señalización celulares. esferoides tumorales multicelulares (MCTSes) de líneas celulares de cáncer se utilizan con frecuencia en la celda 3D cULTURA modelos debido a su relativa cercanía a los tumores in vivo. Fuera de las varias técnicas en uso, la técnica de los líquidos de recubrimiento (LOT) de la generación de MCTS en placas de agarosa recubiertas de ha ganado un interés significativo para la optimización de plomo y de destino de validación 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Esto es evidente en los recientes estudios que fueron éxito capaz de ejecutar las pantallas piloto de bibliotecas de compuestos en cultivos MCTS utilizando el lote 6, 7. Sin embargo, la variabilidad del pozo a pozo en MCTS morfología y crecimiento debido a la pérdida de evaporación desigual inducida del medio son obstáculos comunes que acompañan a la LOT usando placas de microtitulación (MPs). En consecuencia, la formación de no uniforme MCTSes compromete la importancia y relevanciade los datos de ensayos farmacológicos 8, 12, 13. Además de los problemas de reproducibilidad, otro problema práctico que afecta a ensayos de alto rendimiento basado en lotes es el recubrimiento de los parlamentarios con la agarosa utilizando las unidades de dispensación automático de líquidos. Aunque la unidad de distribución se puede mantener calienta a prevenir la gelificación de agarosa, la obstrucción de la cassette de distribución y el tubo es un problema potencial para los sistemas robóticos 6. Para superar algunos de estos desafíos, hemos ideado recientemente algunas modificaciones en el lote para el cultivo de MCTS 8. Estas modificaciones se basan principalmente en las posibles formas de prevenir la pérdida de medio desigual de los parlamentarios que utilizan instrumentos que se encuentran comúnmente en los laboratorios de análisis de alto rendimiento. Un procedimiento detallado de la LOT modificado para la generación de MCTSes de tamaño uniforme y reproducible a través de 3placas de 84 pocillos (WP) se presentan aquí. El manuscrito también presenta una rutina de semi-automatizado para la evaluación del tamaño de MCTS, en particular en MCTSes parcialmente desintegradas, tratados con el fármaco que no tienen un límite claramente definido para la medición del área en sección transversal.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>McCOY's 5A Medio de</td> Bajo Punto de Fusión <td>Sigma-Aldrich</td><td>M8403</td><td></td></tr><tr><td>" rápido" Filtro Filtermax</td><td>TPP</td><td>99505</td><td>0.22 &mu; m, 500 mL</td></tr><tr><td>Multidrop&trade; Dispensador de reactivos Combi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Casete dispensador de tubo pequeño&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24073295</td><td>Punta de metal&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa TC de 384 pocillos&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>6057308</td><td>Tipo de placa- CellCarrier</td></tr><tr><td>Casete dispensador de tubo estándar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>MicroClime Tapa Ambiental</td><td>Labcyte</td><td>LLS-0310</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora rotativa (SteriStore )</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>23641</td><td>Nº de serie: D00384</td></tr><tr><td>Dispensador de lavadora de microplacas&nbsp;</td>Modelo <td>no especificado</td> <td>de BioTek</td><td>: EL406 y nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de imágenes de alto contenido (CellVoyager)</td> <td>Yokogawa Electric Corporation</td> Modelo <td>no especificado</td><td>: CV7000</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>New England Biolabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&trade; Reactivo de disociación celular recombinante Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>Phenol rojo free</td></tr></tbody></table>

la evaporación de reducción de cultura condición aumenta la reproducibilidad del esferoide multicelular formación en placas de microtitulación

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Modelos de tumores que imitan estrechamente las condiciones in vivo se están volviendo cada vez más popular en el descubrimiento de fármacos y el desarrollo para el cribado de posibles fármacos contra el cáncer. Esferoides tumorales multicelulares (MCTSes) imitan efectivamente las condiciones fisiológicas de los tumores sólidos, haciéndolos excelente en modelos in vitro para la optimización de plomo y la validación de dianas. Fuera de las diversas técnicas disponibles para el cultivo de MCTS, el método líquido superposición de agarosa es uno de los métodos más económicos para la generación de MCTS. Sin embargo, la transferencia fiable de cultivos MCTS utilizando líquido de recubrimiento para la selección de alto rendimiento puede verse comprometida por una serie de limitaciones, incluyendo el recubrimiento de placas de microtitulación (MP) con agarosa y la irreproducibilidad de la formación de MCTS uniforme a través de pozos. MPs son significativamente propensos a los efectos de borde que resultan de la evaporación excesiva de medio desde el exterior de la placa, evitando el uso de toda la placa para la drogapruebas. Este manuscrito ofrece mejoras técnicas detalladas a la técnica de superposición de líquido para aumentar la escalabilidad y la reproducibilidad de la formación uniforme de MCTS. Además, los detalles de una herramienta de software simple, semi-automático, y universalmente aplicable para la evaluación de las características de MCTS después se presenta el tratamiento de drogas.

La pérdida desigual del medio, sobre todo de los pozos periféricos, es un problema frecuentemente encontrado en los parlamentarios con pequeños volúmenes de cultivo. Condiciones de cultivo sustancialmente mejoradas, tales como incubadoras con sistemas bien controlados de temperatura / humidificación y parlamentarios de evaporación reductores y tapas de placas, reducen la pérdida significativa de la media en todos los pozos 8. Para medir la evaporación relativa, se...

La pérdida desigual de medio de placas de microtitulación afecta a la reproducibilidad de la formación de esferoides de tumor multicelulares uniforme. La mejora de las condiciones de cultivo para reducir la pérdida significativa medio mejorará la reproducibilidad de la formación de esferoides y los resultados de los ensayos basados ​​en esferoides utilizando la técnica de los líquidos de recubrimiento.

La evaporación de reducción de Cultura condición aumenta la reproducibilidad del esferoide multicelular Formación en placas de microtitulación

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la escalabilidad y la reproducibilidad de la formación uniforme de esferoides utilizando una técnica de superposición líquida en placas de 384 pocillos. La principal ventaja de esta técnica es que reduce la manipulación excesiva del medio proveniente de múltiples placas, mejorando así la reproducibilidad de la formación de esferoides. Hemos desarrollado y validado en nuestro laboratorio el método de cultivo de esferoides tridimensionales para pruebas de cribado en artrópodos, y nuestro estudio tuvo como objetivo evaluar cuál es el efecto de borde en las placas de los cultivos multicelulares.Hoy demostraré el procedimiento junto con Sona, un cartel del laboratorio. Comience este procedimiento pesando cero punto siete cinco gramos de agarosa de punto de fusión baja y añádalos a 100 mililitros de medio McCoy's 5a con o sin rojo de fenol y sin suero. Caliente la solución en un microondas y agítela cada uno o dos minutos para disolver completamente la agarosa.Luego, esterilice la solución en autoclave. Después de dejar que el agarosa esterilizado en autoclave se enfríe a aproximadamente 70 grados Celsius, filtre la solución a través d

evaporation-reducing-culture-condition-increases-reproducibility

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Se introduce un protocolo para la generación de números grandes (miles a cientos de miles) de talla y esferoides tumorales composición controlado uniforme, utilizando placas de micropocillos disponibles en el mercado.

La producción de grandes cantidades de esferoides tumorales Tamaño controlados utilizando placas de micropocillos

Aquí, describimos un protocolo rápido y flexible para la formación de esferoides celulares 3D a través de la agregación celular. Se adapta fácilmente a múltiples tipos de células y es adecuado para su uso en una variedad de aplicaciones, incluidos los ensayos de migración celular, invasión o anoikis, y para obtener imágenes y cuantificar las interacciones célula-matriz.

Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano es fundamental para entender la fisiología microbiana como un fenómeno de nivel de sistemas. Se introduce un protocolo de manipulación experimental y un enfoque analítico, permitiendo análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano, que es un tema clave de interés en biología de sistemas.

Análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano

Aquí, presentamos varios métodos simples para evaluar la viabilidad y la muerte en esferoides de células cancerosas 3D, que imitan los gradientes fisicoquímicos de los tumores in vivo mucho mejor que el cultivo 2D. El modelo esferoide, por lo tanto, permite evaluar la eficacia del fármaco oncológico con una mejor traducción a condiciones in vivo.

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

Aquí presentamos un método que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección para generar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sin necesidad de transfección génica o vectores retrovirales. Esta estrategia es, por lo tanto, prometedora para la medicina traslacional y representa un avance notable en la tecnología de organoides de células madre.

Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

Aquí describimos un protocolo para el cultivo sistemático de esferoides epidérmicos en cultivo de suspensión 3D. Este protocolo tiene una amplia gama de aplicaciones para su uso en una variedad de tipos de tejidos epiteliales y para el modelado de varias enfermedades y afecciones humanas.

Establecimiento de un sistema de cultivo de esferoides epidérmicos de alto rendimiento para modelar la plasticidad de las células madre de queratinocitos

Estos protocolos ayudarán a los usuarios a sondear el metabolismo energético mitocondrial en esferoides derivados de líneas celulares de cáncer 3D utilizando el análisis de flujo extracelular Seahorse.

Explorando el metabolismo energético mitocondrial de esferoides de microtissue 3D individuales utilizando el análisis de flujo extracelular

Este protocolo detalla un método para la producción de tres tipos diferentes de esferoides de una manera que los hace adecuados para la detección y el análisis de alto contenido a gran escala. Además, se presentan ejemplos que muestran cómo se pueden analizar a nivel de células esferoides e individuales.

Un método robusto para la producción a gran escala de esferoides para aplicaciones de detección y análisis de alto contenido

El presente protocolo describe una técnica para producir esferoides tisulares a gran escala de forma rentable utilizando un dispositivo similar a un sello impreso en 3D.

Generación de esferoides de tejido a través de un dispositivo similar a un sello impreso en 3D

Presentamos un protocolo para el cultivo de esferoides de alta reproducibilidad y su caracterización fenotípica mediante captura de imágenes y proteómica.

Análisis fenotípico semiautomatizado de cultivos celulares esferoides funcionales en 3D

En este trabajo se describen diferentes métodos de formación de esferoides multicelulares para realizar un seguimiento de la microscopía multiparamétrica de células vivas. Mediante el uso de microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM), autofluorescencia celular, colorantes de tinción y nanopartículas, se demuestra el enfoque para el análisis del metabolismo celular, la hipoxia y la muerte celular en cáncer tridimensional vivo (3D) y esferoides derivados de células madre.

Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares

Aprende a formar esferoides multicelulares uniformes mediante la técnica de recubrimiento líquido en placas de 384 pocillos. Este método reduce la pérdida de medio y mejora la reproducibilidad en ensayos de cribado de fármacos.

La evaporación de reducción de Cultura condición aumenta la reproducibilidad del esferoide multicelular Formación en placas de microtitulación (Video) | JoVE Journal

La evaporación de reducción de Cultura condición aumenta la reproducibilidad del esferoide multicelular Formación en placas de microtitulación

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