La evaporación de reducción de Cultura condición aumenta la reproducibilidad del esferoide multicelular Formación en placas de microtitulación

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la escalabilidad y la reproducibilidad de la formación uniforme de esferoides utilizando una técnica de superposición líquida en placas de 384 pocillos. La principal ventaja de esta técnica es que reduce el refuncionamiento excesivo del medio de múltiples placas y, por lo tanto, mejora la reproducibilidad de la formación de esferoides. Hemos desarrollado y validado el método de cultivo de esferoides 3D para pruebas de cribado de artrópodos en nuestro laboratorio y nuestro estudio ha consistido en evaluar cuál es el efecto borde en las placas de los cultivos multicelulares.

Hoy voy a demostrar el procedimiento junto con Sona, un póster del laboratorio. Comience este procedimiento pesando cero coma siete cinco gramos de agarosa de bajo punto de fusión y agréguela a 100 mililitros de mccoy's 5a medium con o sin rojo fenol y sin suero. Calienta la solución en un microondas y revuélvelo cada uno o dos minutos para disolver completamente la agarosa.

A continuación, autoclave la solución para esterilizarlo. Después de dejar que la agarosa esterilizada en autoclave se enfríe a unos 70 grados centígrados, fíltrala a través de un filtro de tapa de botella de 500 mililitros de punto cero y dos micrómetros en una caja de flujo laminar. A continuación, si no se va a utilizar toda la solución a la vez, alícuota.

Guarde esta solución de agarosa lista para usar de forma aséptica en una cámara frigorífica o en un refrigerador de cuatro grados centígrados hasta por cuatro semanas. Trabajando en una caja de flujo, instale un casete dispensador de plástico o metal en un dispensador de reactivos combinado. Coloque el peso del tubo en un recipiente con 70 por ciento de etanol y luego cebe el casete.

Luego, mueva el peso del tubo a un recipiente de PBS y vuelva a cebarlo. A continuación, caliente una alícuota almacenada de solución de agarosa filtrada en el microondas para derretirla. Prepare el casete dispensador con solución de agarosa y luego inicie el protocolo para recubrir 384 microplacas tratadas con cultivo de tejidos de pocillos con 15 microlitros de solución de agarosa filtrada.

Deje que la agarosa en la placa se enfríe durante 15 a 20 minutos antes de sembrar las células como se describe en la siguiente sección del video, o almacenarlas a cuatro grados centígrados y lejos de la luz directa. Finalmente, para limpiar el casete dispensador, coloque el peso del tubo en agua estéril de 70 a 80 grados centígrados y presione el botón de cebado en el dispensador. Esto eliminará cualquier resto de agarosa en las puntas del casete y los tubos.

El siguiente proceso de siembra celular debe realizarse en condiciones estériles y en una caja de flujo laminar. Comience por retirar el número requerido de microplacas tratadas con cultivo de tejido de 384 pocillos recubiertas de agarosa del almacenamiento en frío y dejar que se equilibren a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mientras tanto, prepare el dispensador de reactivos combinado para la visualización de células cebando un casete dispensador de tubo estándar con etanol al 70 por ciento y PBS estéril.

A continuación, utilizando los botones de configuración manual del dispensador, ajuste el volumen de visualización al microlitro requerido y la velocidad de dispensación al medio. Utilice la enzima de disociación celular recombinante para eliminar las células adherentes HCT116 del carcinoma colorrectal humano de un matraz de cultivo de tejidos. En un vaso de precipitados estéril, haga un stock de suspensión celular con células a una densidad de 2,5 veces 10 a la cuarta celdas por mililitro por pocillo en 50 microlitros de medio de crecimiento completo.

Si se va a sembrar más de una placa de 384 pocillos, use un agitador magnético para evitar que se depositen en el fondo del vaso de precipitados. Usando un dispensador, agregue las 25 cien celdas a cada pocillo de una placa de 384 pocillos. Deje reposar los platos durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Mientras tanto, tome una tapa de microplaca ambiental reductora de evaporación y, con una pipeta de cinco mililitros, dispense cuatro mililitros de dimetilsulfóxido al cinco por ciento en el canal del lado izquierdo, barriendo lentamente hacia arriba y hacia abajo. Repita este proceso con el canal del lado derecho. Asegúrese de que el líquido agregado a los canales laterales no se fusione en el centro de la tapa y deje un espacio para el intercambio de gases.

Si se agrega demasiado líquido, se filtrará en el exterior de la tapa y, posteriormente, ingresará al pocillo exterior de la placa de cultivo de tejidos 384. Después de que hayan pasado 30 minutos, examine las células bajo un microscopio. El reposo de las placas durante 30 minutos permite que las células se asienten completamente en el fondo del pozo y cerca unas de otras, lo cual es importante para la formación de esferoides individuales por pocillo.

Centrifugar las placas sembradas durante 15 minutos a cuatro veces G. Después del centrifugado, llene el depósito de líquido de la placa de cultivo de tejidos 384 con agua estéril y reemplace las tapas de las placas regulares con las tapas ambientales llenas de líquido. Coloque las placas en una incubadora rotativa de 37 grados centígrados con 95 por ciento de humedad, cinco por ciento de CO2 y 20 por ciento de oxígeno y permita que las células se agreguen en esferoides tumorales multicelulares o MCTS durante cuatro días. Evite abrir la puerta de la incubadora durante demasiado tiempo en los días posteriores para que el nivel de humedad no baje bruscamente.

En el cuarto día después de la formación de NCTS, use un dispensador de lavadora de microplacas automatizado para agregar 30 microlitros de medio precalentado a cada pocillo. Vuelva a colocar los MCTS en la incubadora y permita que crezcan hasta que alcancen el tamaño deseado para la experimentación. Cada tres días, para reemplazar el medio, ajuste empíricamente la altura Z del colector de lavado y configure la velocidad de dispensación y la velocidad a la que el colector de lavado se desplaza hacia los pozos a la velocidad más baja para minimizar la turbulencia en los pozos.

Aspire 30 microlitros de medio por pocillo y reemplácelo con 30 microlitros de medio fresco precalentado. A continuación, regrese las células a la incubadora. Tome imágenes de los MCTS en un sistema de imágenes automatizado de alto contenido utilizando un objeto de aire de cuatro X con una apertura numérica de 16.

Con el software de imágenes, establezca el tiempo de exposición en 11 milisegundos y el agrupamiento en cuatro por cuatro. Ajuste el número y el espaciado de las pilas z y el agrupamiento de píxeles según lo desee para que el experimento capture un MCTS completo en cada pocillo. Procese las imágenes 2D paso a paso para medir el área MCTS, el eje mayor y menor, el perímetro y la solidez.

Consulte el código m adjunto y los archivos de texto léame para obtener instrucciones específicas. Para determinar la posible aplicabilidad de la rutina, se trataron MCTS de siete días de edad con diferentes concentraciones de los fármacos contra el cáncer, Paclitaxel, PTX, vincristina, VCR, oxaliplatino, OXA, doxirrubicina, DOX y cinco flurouracilos, 5-FU, a tres concentraciones diferentes durante cuatro días. Aquí se muestran imágenes de los MCTS.

Estas imágenes se analizaron para determinar el área, los ejes mayor y menor, el perímetro y la solidez de los MCTS tratados con fármacos en comparación con los controles, CTL. Los ejes mayor y menor se utilizaron para calcular el volumen geométrico. Hubo una disminución dependiente de la concentración en el área y el volumen de MCTS después del tratamiento farmacológico.

Aunque el punto cero de un microgramo por mililitro de vincrystine y el cero punto cuatro microgramos por mililitro de doxirrubicina y cinco de fluorouracilo dieron como resultado un aumento en el área de MCTS, el volumen solo se incrementó significativamente después del punto cero cero un microgramos por mililitros de vincrystine. El perímetro de MCTS fue significativamente diferente solo en las concentraciones más altas de Packlitaxel, Doxyrrubicina y Five Fleurouracil, lo que afectó completamente el tamaño de MCTS. El tratamiento con Packlitaxel y Vincrystine a cero coma dos cinco microgramos por mililitro y cero coma cero seis microgramos por mililitro y Doxirrubicina y cinco Fleurouracilo a 100 microgramos por mililitro, dieron como resultado una disminución significativa en la solidez, lo que indica una desintegración completa a parcial de los MCTS.

En conjunto, estos datos demuestran la utilidad de este método en la investigación de posibles fármacos contra el cáncer. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que no todas las líneas celulares son adecuadas para un método de cultivo 3D en particular y diferentes líneas celulares forman esferoides que muestran diferencias en las formas, el tamaño, la histología y la cinética de crecimiento de los esferoides.

La rutina estimulatoria que hemos desarrollado permite una evaluación efectiva del tamaño del esferoide, particularmente en esferoide parcialmente disintegrado tratado con fármaco que no tienen un límite claramente definido para la medición del área de la sección transversal. Después de ver este video, debe comprender bien el hecho de que la modificación presente aquí no requiere ningún equipo o consumible adicional y se puede implementar de manera rutinaria en su laboratorio de detección de artrópodos.