Usando In Vitro células vivas imágenes para explorar quimioterápicos entregado por nanopartículas basadas en lípidos

El objetivo general de esta técnica de imagen de células vivas es seguir los procesos celulares como la absorción y distribución de agentes quimioterapéuticos sin necesidad de fijación. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer, tales como: cómo las células tumorales absorben los agentes quimioterapéuticos, ya sea en forma libre o encapsulados en nanopartículas. La principal ventaja de esta técnica es que estamos obteniendo imágenes de células vivas, evitando así artefactos de fijación y permitiendo la evaluación dinámica en tiempo real.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando observamos que los nanoparticales se descomponían durante la fijación, lo que llevó a una interpretación errónea de la administración del fármaco. Para montar la cámara de imagen, coloque un cubreobjetos de 25 milímetros en la parte inferior de la cámara y atornille la parte superior en la parte inferior. No apriete demasiado, ya que el vidrio puede romperse.

Autoclave toda la cámara. Para colocar las células en una placa, retire la cámara de imágenes de la bolsa de esterilización en un gabinete de flujo laminar. Apriete con cuidado la cámara y colóquela en una placa de Petri.

Cubra el vidrio de la cámara de imágenes con un mililitro de gelatina estéril al 0,1 por ciento durante 20 minutos a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono. Después de retirar el medio de los matraces de cultivo celular, lave las células una vez con 1x PBS y separe las células con tripsina al 0,25 por ciento. Inactive la tripsina agregando medio de cultivo celular.

Luego, recoja las celdas y gírelas a 1, 100 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio de cultivo celular. Después de contar las células como se describe en el protocolo de texto, aspire la gelatina y coloque las células en una dilución que permita una cobertura máxima del 70 por ciento dentro de las 24 horas.

Permita que las células se adhieran al cinco por ciento de dióxido de carbono y a 37 grados centígrados durante 24 horas. Realizar una evaluación de las células bajo un microscopio para determinar la confluencia, la morfología celular y la contaminación. Luego, encienda el microscopio confocal, la luz fluorescente y la computadora.

Conecte el calentador de lentes al objetivo y ajústelo a 35 grados. Prepare la unidad de incubación como se muestra en el protocolo de texto. Coloque la unidad de incubación en la platina del microscopio y conecte el tubo de dióxido de carbono de entrada y salida.

Abra la válvula principal de dióxido de carbono y encienda el controlador de dióxido de carbono. Compruebe que el controlador esté configurado en un cinco por ciento de dióxido de carbono. Las condiciones adecuadas de cultivo celular, como la temperatura, el CO2, el pH, la humedad y la esterilidad, son cruciales para la obtención de imágenes celulares a largo plazo.

Por lo tanto, para cada incubadora, eso debe probarse adecuadamente. Ajuste la temperatura del escenario a 37 grados centígrados. Permita que la unidad de incubación alcance la temperatura y el porcentaje de dióxido de carbono seleccionados.

Tome la cámara de imágenes de la incubadora principal de dióxido de carbono y transporte la cámara en una placa de Petri a la sala de microscopía. Coloque la cámara de imagen en un soporte de platina de 35 milímetros de diámetro hecho a medida y cierre la cámara con una tapa de sellado hecha a medida. Abra la unidad de incubación y trabaje lo más rápido posible para evitar el enfriamiento de las células; Reemplace el parche rojo con la cámara de imágenes y luego cierre la unidad.

Asegúrese de que no haya cables atascados entre la platina y el microscopio. Deje que la unidad se aclimate durante 30 minutos. A continuación, abra el software y encienda el láser.

Cree una nueva base de datos haciendo clic en "Nuevo" en la pestaña Archivo. Asigne un nombre y guarde la base de datos. Establezca la configuración haciendo clic en "Configuración" en la pestaña Adquirir.

Seleccione el modo de canal "y pista única" para evaluar un solo fluoróforo. Seleccione "Multi Track" para varios fluoróforos. A continuación, elija los filtros de paso de banda adecuados, que coincidan con el fluoróforo.

Seleccione el canal de campo claro en una de las pistas. El escaneo se ve comprometido entre la señal fluorescente de los compuestos y la calidad de la imagen. La sobreexposición, el fotoblanqueo, la relación señal-ruido, la calidad de las células y los compuestos añadidos son factores que pueden influir en los resultados y deben probarse adecuadamente.

Establezca el control de escaneo haciendo clic en "Escanear" en la pestaña Adquirir. A continuación, haga clic en "Modo" para establecer el tamaño del fotograma, la velocidad de escaneo, la dirección de escaneo y el promedio de escaneo. Haga clic en "Canales" para establecer el estenopeico, la ganancia y el desplazamiento, y la potencia del láser.

Guarde estos ajustes haciendo clic en "Configuración" en la pestaña Configuración y guárdelos en la base de datos de configuración. Configure el lapso de tiempo haciendo clic en "Muti TimeX" en la pestaña Macro. Haga clic en Ubicación única.

Aplique la configuración guardada haciendo clic en "Pista única" y desplácese hasta la configuración requerida en la base de datos de configuración. Establezca el intervalo de tiempo y el número de escaneos. Cargue la configuración haciendo clic en Cargar configuración.

Asigne un nombre al lapso de tiempo en el Nombre del archivo base y seleccione la base de datos haciendo clic en Base de datos de imagen" para guardar el lapso de tiempo. Establezca una carpeta temporal haciendo clic en Carpeta de imagen temporal"A continuación, abra la unidad de incubación, levante el anillo de imagen, agregue una gota de aceite de inmersión al objetivo y cierre la unidad lo más rápido posible. Enfoque y seleccione una posición en la cámara de imágenes.

En la cabina de flujo laminar, diluya el fármaco libre o las nanopartículas a una concentración de cinco microgramos por mililitro de fármaco o 0,05 micromoles de lípidos en un medio de cultivo celular. Filtre a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras si el fármaco o las nanopartículas no son estériles. Abra la cámara de incubación y levante la tapa del techo.

Luego, retire el medio de las células, agregue un mililitro de medicamento diluido o nanopartículas y cierre la unidad lo más rápido posible. Concéntrese en las celdas y realice un escaneo rápido haciendo clic en "Único" en la pestaña Control de escaneo. Cuando la imagen de campo claro muestre celdas enfocadas, inicie el lapso de tiempo haciendo clic en "Hora de inicio" en la macro Multi TimeX.

El número de repeticiones y el tiempo restante se muestra en la macro y en las imágenes. Compruebe regularmente si las celdas siguen enfocadas o utilice el enfoque automático. El programa guarda automáticamente el time-lapse en la base de datos.

No cierre la base de datos mientras se está ejecutando el programa. Se trata de un time-lapse de tres horas de células expuestas a doxorrubicina libre. Observar la absorción y translocación inmediata de la doxorrubicina fluorescente roja al núcleo.

Aquí, las células se incuban durante tres horas con doxorrubicina encapsulada. La señal fluorescente es mucho menor y se localiza en el citoplasma. La señal apenas es visible en el núcleo.

Al transportar estas películas de lapso de tiempo a la imagen J, se puede dibujar una región de interés alrededor del núcleo y se puede medir la densidad de píxeles. El gráfico presentado aquí muestra la diferencia en la absorción nuclear a lo largo del tiempo en células incubadas con doxorrubicina libre o encapsulada. Aquí se muestran células incubadas con doxorrubicina encapsulada, que se muestran en rojo.

La señal púrpura representa el portador y los lisosomas se tiñen con un marcador verde de células vivas. La comparación de ambos tipos de células muestra una diferencia en la distribución lisosomal. Los lisosomas de las células B16BL6 se distribuyen por todo el citoplasma.

Mientras que los lisosomas en las células BLM se encuentran cerca del núcleo. Sin embargo, ambas líneas celulares muestran una alta colocalización de la señal roja y púrpura en los lisosomas, lo que indica que la doxorrubicina y su portador están atrapados en estos orgánulos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de la absorción de agentes quimioterapéuticos y otros marcadores fluorescentes en células vivas durante varias horas o incluso días.