Name: Usando In Vitro células vivas imágenes para explorar quimioterápicos entregado por nanopartículas basadas en lípidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprende a visualizar la captación y distribución de agentes quimioterapéuticos en células vivas mediante imágenes en tiempo real. Este método evita artefactos de fijación y permite evaluar dinámicamente la entrega de fármacos en investigación oncológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Las instalaciones de microscopía utilizadas son parte del centro de la proyección de imagen óptica de Erasmus, y nos gustaría agradecer al personal de la OCI por sus servicios.

1. preparación <ol><li>montar la cámara de proyección de imagen, que consta de dos partes.
	<ol><li>Colocar un vidrio de cubierta de 25 mm ( figura 1A -1) en la parte inferior de la cámara ( figura 1A -2) y la parte superior del tornillo en la parte inferior ( figura 1A -3). No apriete demasiado, ya que puede romper el vidrio. Autoclave de toda la cámara ( figura 1A -4).</li>
	</ol></li> <li>Preparar medio de cultivo celular complementando Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s medio (DMEM) sin rojo de fenol con 10% de suero de ternera fetal inactivado con calor (FCS) y 1 mM L-glutamina bajo condiciones estériles. Almacenar a 4 ° C y caliente a 37 ° C antes de su uso.</li>
	<li>Mantener las células con medio de cultivo celular en cultivo frascos usando técnicas de cultivo estándar celular. 
	Nota: Aquí, dos líneas celulares de ratón melanoma B16BL6 11 Lewis lung carcinoma (LLC) y dos melanomas humanos, BLM y 1F6 12, se utilizó y.</li>
	<li>Hacer gelatina de 0.1% por peso y disolver la gelatina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C durante la noche. Esterilizar la solución por filtración a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.</li>
</ol> 2. Las células de la placa <ol><li>Retire la cámara de proyección de imagen de la bolsa de esterilización en un gabinete de flujo laminar con cuidado apriete la cámara y colocar en una placa Petri. 
	Nota: Para evitar contaminación, mantenga la cámara de proyección de imagen en una placa Petri hasta que la cámara puede colocarse bajo el microscopio.</li>
	<li>Cubrir el cristal de la cámara de proyección de imagen con 1 mL de 0.1% gelatina estéril por 20 min a 37 ° C y 5% CO 2. 
	Nota: Esto permitirá mejor accesorio celular.</li>
	<li>Quitar el medio de los frascos de cultivo celular (ver pasos 1.2 y 1.3), lavar una vez con PBS 1 x y separar las células utilizando tripsina 0.25%. Inactivar la tripsina mediante la adición de medio de cultivo celular, recoger las células, desactivación a 1.100 x g durante 5 minutos y resuspender el precipitado en 5 mL de medio de cultivo celular.</li>
	<li>Diluir 20 μl de la suspensión celular con 20 μl de azul de tripán (que va ser tomada por las células muertas). Contar el número de células vivas y muertas usando un hemocitómetro; el número de células muertas no debe exceder del 10%.</li>
	<li>Aspirar la gelatina y las células en una disolución que permite un máximo de 70% de cobertura dentro de las 24 h de la placa. Por ejemplo, utilizar una dilución de 5 x 10 4 o 10 x 10 4 células en 1 mL. Permitir que las células se adhieran en el 5% CO 2 y 37 ° C durante 24 h.</li>
</ol> 3. Time-lapse microscopia ( figura 2) Nota: aquí, se utilizó un microscopio confocal con el titular de una etapa a la medida, aunque la mayoría de fabricantes ofrecen una gama de incubadoras para células vivas imágenes que son también es adecuado para investigar la administración de fármacos nanoparticulados.
<ol><li>Evaluar las células bajo un microscopio para la confluencia, la morfología celular y la contaminación. Vuelva a colocar la cámara en la incubadora de CO 2. 
	Nota: La confluencia no debe exceder el 70%. Si la morfología celular es inconsistente (es decir, las células no se adhieren) o se detecta contaminación, deseche la cámara imagen.</li>
	<li>Encender el microscopio confocal ( Figura 1E -1), luz fluorescente ( Figura 1E -2) y computadoras ( Figura 1E -3).</li>
	<li>Conectar el calentador de lente al objetivo y ponerlo a 35 ° C ( Figura 1E -4 + insert).</li>
	<li>Preparar la unidad de incubación, como se muestra en la figura 1B. 
	Nota: Esta unidad consiste en una platina calefactada ( figura 1B -1), una etapa de flujo con un conector para el CO 2 tubos ( figura 1B -2) y sonda de CO 2 ( figura 1B -3) y un parche de cierre rojo ( figura 1B -4). Este parche se utiliza para cerrar temporalmente la unidad hasta que se coloca la cámara imagen.</li>
	<li>Coloque la unidad de incubación sobre la platina del microscopio y conectar el en - y hacia fuera - flujo CO 2 tubos ( Figura 1E -5). Abra la válvula principal de CO 2 ( Figura 1E -6) y encienda el controlador de 2 CO ( Figura 1E -7). Compruebe que el controlador se establece en 5% CO 2. 
	Nota: Para la humedad, CO 2 pasa a través de un humidificador ( Figura 1E -8). Para los experimentos de la hipoxia, un regulador de 2 O separado ( Figura 1E -9) está incluido en la configuración de.</li>
	<li>Ajustar la temperatura de la etapa a 37 ° C ( Figura 1E -10). Para los experimentos de hipertermia, ajuste la temperatura a 42 ° C. permitir la unidad de incubación para alcanzar la temperatura seleccionada y CO un porcentaje de 2.</li>
	<li>Tomar la sala de proyección de imagen del principal CO 2 incubadora y transporte de la cámara en una placa Petri a la sala de microscopía.</li>
	<li>La sala de proyección de imagen ( figura 1A -4) en una a medida, 35 mm de diámetro etapa titular ( figura 1A -5) y cerrar el compartimiento con tapa cierre a medida ( Figura 1A -6). 
	Nota: La tapa permite CO 2 pasar y evita la evaporación y contaminación.
	<ol><li>Abra la unidad de incubación, reemplazar el parche rojo con la imagen de la cámara y cerrar la unidad ( figura 1). Para ello lo más rápido posible para evitar el enfriamiento de las células. Asegúrese de que ningún cable se pegan entre la etapa y el microscopio.</li>
	</ol></li> <li>Deja la unidad para aclimatarse durante 30 minutos</li>
	<li>El software abierto y enciende los lasers. 
	Nota: Aquí, argón nm 488 543 nm helio-neon, láseres de helio-neón 633 nm se utilizó y.</li>
	<li>Hacer una nueva base de datos haciendo clic en &#34; nueva &#34; en la ficha de archivo nombre y guardar la base de datos.</li>
	<li>Establecer la configuración haciendo clic en &#34; Config &#34; debajo de la ficha de adquisición seleccione &#34; modo de canales &#34; y &#34; sola pista &#34; para evaluar un solo fluoróforo o &#34; Multi pista &#34; para varios fluoróforos. Seleccione los filtros de paso de banda apropiado que empareja el fluoróforo (p. ej., 560 a 615 nm filtro para dox y Dox-NP; vea los resultados de representante para más ejemplos). Seleccione el canal de campo brillante en uno de los temas.</li>
	<li>Establecer el control de exploración haciendo clic en &#34; Análisis &#34; debajo de la ficha adquirir conjunto el tamaño de fotograma (1.024 x 1.024), velocidad de escaneo (óptima), escanear dirección (8-bit, solo) y media (4) la exploración haciendo clic en &#34; modo &#34; fijar el agujero de alfiler (200 μm), ganancia y offset ( por ejemplo, 580 700 y 835; Ver figura 3) y energía del laser (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%) haciendo clic en &#34; canales. &#34;</li> <li>guardar esta configuración haciendo clic en &#34; Config &#34; en el configuración ficha y guardar en la base de datos de configuración.</li>
	<li>Establecer el lapso de tiempo haciendo clic en &#34; Multi tiempo X &#34; ( figura 1) en la ficha de Macro haga clic en &#34; solo ubicación &#34;.</li>
	<li>Para mantener las células en el foco, seleccionar el enfoque automático en la macro haciendo clic en &#34; Auto foco. &#34; 
	Nota: enfoque automático se consigue con el láser de 633 nm usando el reflejo del vidrio como un punto de referencia.</li>
	<li>Aplicar la configuración guardada pulsando &#34; pista solo &#34; o &#34; Multi pista, &#34; de desplazamiento a la configuración requerida en la base de datos de configuración, ajuste el intervalo de tiempo (por ejemplo, 15 min), número de análisis (p. ej., 97) y Haga clic en &#34; carga Config. &#34; Nota: Use estos ajustes, se realizará una serie de tiempo de 97 x 15 min = 24 h.</li>
	<li>Nombre del time-lapse en el &#34; Base de nombre de archivo &#34; y seleccione la base de datos (hecha en el paso 3.11) haciendo clic en &#34; Base de datos de imagen &#34; para salvar el lapso de tiempo. Establecer una carpeta temporal haciendo clic en &#34; carpeta Tmp imagen. &#34; Nota: Si el sistema se detiene o se bloquea por cualquier motivo, las imágenes se encuentran en esta carpeta.</li>
	<li>Abra la unidad de incubación, levante el anillo de la proyección de imagen, añada una gota de aceite de inmersión el objetivo y cerrar la unidad tan rápido como sea posible. Enfoque y seleccione una posición en la cámara de proyección de imagen. 
	Nota: Esta posición contiene células en una monocapa, con un mínimo de 70% de confluencia, lo que permite la proyección de imagen de células individuales.</li>
	<li>Verificar los ajustes de configuración para el fondo y corregir si es necesario. 
	Nota: El fondo puede ser corregido reduciendo el poder de ganancia o láser. Cualquier cambio en la configuración hay que salvar (ver paso 3.17) y cargado (ver paso 3.18) nuevamente en la macro de.</li>
	<li>En el gabinete de flujo laminar, diluir drogas gratis o nanopartículas en una concentración de 5 μg/mL droga o el 0,05 μmol de lípidos en el medio de cultivo celular. Filtrar con un filtro de jeringa 0,22 μm si las drogas/nanopartículas no son estériles.</li>
	<li>Abrir la cámara de incubación, levante la tapa de sellado, retire el medio de las células, agregar 1 mL de medicamento diluidas/nanopartículas y cierre la unidad tan rápido como sea posible.</li>
	<li>Centrarse en las células y el lapso de tiempo de inicio haciendo clic en &#34; hora de inicio &#34; en la macro Multi tiempo X.</li>
	<li>Compruebe regularmente si las células siguen en foco o utilizan el enfoque automático (ver paso 3.16). El programa guarda automáticamente el Time-lapse en la base de datos; no cierre la base de datos mientras se ejecuta el programa.</li>
</ol> 4. Análisis de datos <ol><li>dependiendo de la pregunta original de investigación, utilizar programas de software como el ImageJ para análisis de datos (véase la sección resultados para ejemplos).</li></ol>

<ol><li>Duggan, S. T., Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pegylated+liposomal+doxorubicin%3A+a+review+of+its+use+in+metastatic+breast+cancer%2C+ovarian+cancer%2C+multiple+myeloma+and+AIDS-related+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma.</a> Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).</li>
<li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).</li>
<li>Ten Hagen, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+augments+antitumor+activity+of+stealth+liposomal+doxorubicin+%28DOXIL%29+in+soft+tissue+sarcoma-bearing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats.</a> Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).</li>
<li>Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+to+systemic+treatment+with+STEALTH+liposomal+doxorubicin+%28Doxil%29+improved+anti-tumor+activity+in+osteosarcoma-bearing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats.</a> Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).</li>
<li>Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+safety+of+pegylated+liposomal+doxorubicin+%28Doxil%2FCaelyx%29+demonstrated+by+endomyocardial+biopsy+in+patients+with+advanced+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Invest%22%5BJournal%5D)">Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies.</a> Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).</li>
<li>Muggia, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+encapsulated+anthracyclines%3A+new+therapeutic+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons.</a> Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+content+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+using+mild+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia.</a> J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).</li>
<li>Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+optimization+of+idarubicin+thermosensitive+liposomes+provides+ultrafast+triggered+release+at+mild+hyperthermia+and+improves+tumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response.</a> J Control Release. 220, 425-437 (2015).</li>
<li>Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+Doxil+is+taken+up+intracellularly+and+released+doxorubicin+sequesters+in+the+lysosome%3A+Evaluated+by+in+vitro%2Fin+vivo+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging.</a> J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).</li>
<li>Dicheva, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+Thermosensitive+Liposomes%3A+A+Novel+Dual+Targeted+Heat-Triggered+Drug+Delivery+Approach+for+Endothelial+and+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells.</a> Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).</li>
<li>Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+anti-tumour+activity+of+recombinant+human+and+murine+TNF%2C+alone+and+in+combination+with+murine+IFN-gamma%2C+on+a+syngeneic+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma.</a> Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).</li>
<li>Van Muijen, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+expression+of+metastasizing+and+non-metastasizing+human+melanoma+cells+xenografted+into+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice.</a> Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).</li>
<li>Das, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+TIMP3+expression+affects+tumor+progression+and+angiogenesis+in+melanomas+through+regulation+of+directionally+persistent+endothelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).</li>
<li>Brouckaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+augmented+tumor+response+in+B16BL6+melanoma-bearing+mice+treated+with+stealth+liposomal+doxorubicin+%28Doxil%29+correlates+with+altered+Doxil+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics.</a> Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).</li>
<li>Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+doxorubicin+efflux+from+the+nucleus+of+drug-resistant+cancer+cells+following+extracellular+drug+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance.</a> Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).</li>
<li>Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+following+4D+confocal+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+hyperthermia+triggered+doxorubicin+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+improves+intratumoral+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).</li>
<li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+intracellular+Doxorubicin+delivery+through+nanoliposomes+equipped+with+selective+tumor+cell+membrane+permeabilizing+short-chain+sphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids.</a> Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).</li>
<li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+glycoceramides+promote+intracellular+mitoxantrone+delivery+from+novel+nanoliposomes+into+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells.</a> Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Según lo observado en el pasado, la fijación puede destruir nanocarriers liposomal casi inmediatamente y DXR lanzado estos liposomas destruidos todavía tenían el tiempo para entrar en el núcleo, de forma que la interpretación de datos muy difícil e incluso engañosa. Con algunos ajustes microscópicos, sino quimioterápico en las células vivas y tejidos puede investigarse rutinariamente para confirmar o derrocar observaciones histológicas. Un trabajo reciente demostró la absorción, liberación y localización de DXR en células tratadas con dox libre y encapsulado utilizando células vivas Time-lapse imagen9. Este trabajo describe el montaje experimental con más detalle. Utilizando este modelo, es posible visualizar el transporte inmediato de dox al núcleo, donde se acumula continuamente hasta que la célula finalmente muere. En cambio, cuando se utiliza Dox-NP, sólo pequeñas cantidades de dox liberado se encuentran en el núcleo. Aunque continua exposición resulta en acumulación continua de DXR, la señal fluorescente es mucho menor en Dox-NP-versus células tratadas con dox, indicando una diferencia en la concentración celular y citotoxicidad posterior. Además, mediante el uso de marcadores de células vivas, fue demostrado que, al exponer las células a Dox-NP, DXR y el nanocarrier se encuentran en el lisosoma. Esto indica que el liposoma completa es tomado por la célula y muestra la implicación de una vía endocíticas durante la captación de estas nanopartículas. El DXR en el núcleo es claramente de dox liberado. Sin embargo, usando este método, como el DXR y portador co localización y parecen estar atrapados en los lisosomas, es todavía poco concluyentes si esto se encapsula o lanzado dox. Es posible que la estabilidad intrínseca de la nanopartícula evita la liberación de dox cuando localizadas en el lisosoma.
En este protocolo, proyección de imagen de células vivas se demuestra mediante una específica configuración microscópica, con un soporte de fase por encargo (las especificaciones se pueden dar bajo petición). Sin embargo, más fabricantes de microscopio confocal ofrecen una gama de incubadoras que realizar proyección de imagen de células vivas. Preservar las condiciones de cultivo de células (es decir, temperatura, CO2, pH, humedad y esterilidad) es el criterio principal de estas incubadoras y requiere algunas pruebas preliminares para determinar las condiciones adecuadas, que se explicó. Programas de adquisición de datos también pueden ser entregados por los mismos fabricantes. Una opción de "Multi ubicación" hace posible para varios puestos en la misma cámara, la imagen refinado análisis estadístico. Sin embargo, esta opción en la macro en este manuscrito requiere posiciones fijas de XYZ, por la que se pierde la posibilidad de corregir para la deriva de Z. Análisis de la dimensión Z pueden incluirse en este macro y utiliza un enfoque plano para el análisis. Sin embargo, esto requiere análisis adicionales, aumentando la posibilidad de fototoxicidad y blanqueo.
Como con todas las medidas fluorescentes, sobreexposición es un problema, especialmente cuando se comparan dos compuestos con un diferente absorción celular. La intensidad fluorescente no depende sólo la señal intrínseca del compuesto, sino también la tasa de absorción, la concentración y el tiempo de exposición de la droga. Como se muestra en la figura 3, el contenido nuclear de DXR de células tratadas con dox ya es visible, mientras que ninguna señal se observa en células tratadas con Dox-NP. Sólo mediante el aumento de la ganancia puede DXR en células tratadas con Dox-NP visualizarse, conduce a la sobreexposición en células tratadas con dox. Por otra parte, incluso intracelularmente, Dox-NP es heterogénea, que puede dar lugar a inevitables bajo- o sobreexposición. Especialmente al investigar la captura celular de DXR, la ganancia se redujo significativamente para distinguir los organelos (figuras 5B y 5C). Por lo tanto, las mediciones representadas por la densidad de píxeles deben acompañarse de las imágenes representativas para la correcta interpretación de los resultados.
Fototoxicidad, blanqueo y un cociente signal-to-noise bajo también son temas importantes en microscopía fluorescente, y debe establecerse un compromiso entre la calidad de la imagen y la adquisición de la imagen. Sin embargo, incluso cuando la configuración del microscopio es óptima, la calidad de imagen está también determinada por la calidad de las células y el compuesto añadido. DXR da una señal fuerte y, con las precauciones apropiadas, blanqueo no se observó, incluso después de largos periodos (hasta 72 h). Sin embargo, la reducción de la señal fluorescente también puede ser consecuencia de la emanación. La emanación es un fenómeno importante en drogas resistencia15 y ocurre cuando las células bombear la droga desde el sitio intracelular de acción. Una disminución de la señal fluorescente en el tiempo por lo tanto también puede ser consecuencia de la emanación de dox9. Comparación de la señal fluorescente de un lugar no explorado en el final del experimento con la última imagen de la serie Time-lapse demostrará blanqueo (es decir, la señal será más alta en el lugar no explorado) o emanación (es decir, ambos señales serán idénticas). Están disponibles en programas como el ImageJ16varias opciones correccionales (p. ej., antecedentes, deriva, blanqueo, etc.). También, como la intensidad fluorescente aumenta con el tiempo, los valores de configuración pueden ser previamente evaluados en un experimento piloto para minimizar la exposición al final del lapso de tiempo (paso 3.21). Alternativamente, puede utilizarse una cámara de proyección de imagen con las células ya expuestos a la droga para el período de tiempo deseado para inicializar la configuración. Finalmente, para este tipo de análisis, concentraciones de la droga tóxica (paso 3.22) deben ser evitadas y había preestablecida usando bio-análisis convencionales.
Las células son continuamente cultivadas y mantenidas en medio sin rojo de fenol. Rojo de fenol es en la parte roja del espectro y se observan organelos celulares, probablemente lisosomas, presentando información de falsos positivos (paso 1.2). Para permitir el monitoreo de células individuales, confluencia celular no debe exceder 70% (paso 3.1.). El CO2 -velocidad de flujo (paso 3.5) debe ser regulado en un experimento de validación cuando el equipo es adquirido o después del mantenimiento. Cuando la velocidad es demasiado alta, medio se evaporará. Cuando la velocidad es demasiado baja, se incrementará el pH del medio, que puede afectar el crecimiento de la célula. Como el medio es sin los cambios de indicador de pH rojo de fenol pH no pueden ser observados y por lo tanto son fácilmente ignorados. Una vez que se valida el flujo de CO2 , esta configuración puede utilizarse en todos los experimentos futuros.
Utilizando el método descrito aquí, el destino de nanopartículas puede fácilmente ser investigado usando proyección de imagen de células vivas y microscopia Time-lapse. En este procedimiento, se utilizaron nanopartículas disponibles comercialmente. Sin embargo, el destino de termosensible17, liposomas catiónicos10; liposomas con shingolipids de cadena corta de18; y encapsulación de nanopartículas otras drogas también fueron investigados8,19 de esta manera en el tumor y las células normales.

La capacidad de seguir un proceso biológico, como las interacciones célula-célula, inter- y transporte intracelular, absorción compuesta citotóxica e interacción de la proteína-proteína de moléculas individuales en células vivas y tejidos, ha cobrado gran interés en los últimos década, ya que proporciona la dimensión adicional de "tiempo real". En este manuscrito, se describe un método para seguir el destino intracelular de dox libre y dox incorporado en nanopartículas (Dox-NP).
Nanopartículas se han utilizado durante décadas para tratar ciertos tipos de cáncer. DOX-NP ha sido aprobado para el tratamiento de sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA avanzado de ovario y cáncer de pecho y mieloma múltiple1. Fue una de las primeras nanopartículas liposómicos desarrolló e introdujo en el ajuste clínico. La forma libre, dox, enormemente se elimina de la circulación de la sangre, limitar su capacidad para llegar al sitio del tumor en cantidades suficientes. Además, el tratamiento es acompañado por efectos secundarios graves y limitación de dosis, como la estomatitis y la insuficiencia cardíaca. Cuando encapsulado en nanopartículas liposomal pegilada el tiempo de circulación aumenta desde minutos a días2. Este tipo de colesterol que contiene liposomas es bastante estable y esta estabilidad determina la farmacocinética del fármaco encapsulado.
Sin embargo, esta rigidez tiene un inconveniente. La capacidad citotóxica de un compuesto hacia las células tumorales es primero evaluado en vitro, y se ha demostrado que dox es más potente que Dox-NP en citotóxicos ensayos3,4. Fue presumido que la estabilidad de la portadora previene la liberación y la absorción celular de la droga, y vale la pena investigar este fenómeno más lejos. Las propiedades intrínsecas liposómicos, construidas para durar los elementos agresivos en la corriente sanguínea y llegar al sitio del tumor intacto, dio lugar a la alteración biodisponibilidad del componente citotóxico (es decir, dox) en el sitio de destino (es decir, el tumor núcleo de la célula). Aunque Dox-NP difícilmente mejora la respuesta frente a la forma libre, es de valor clínico, como encapsulado reduce significativamente los efectos cardiotóxicos del5. En los años siguientes, otros compuestos fueron encapsulados en portadores de la nano6. También, modificar las compañías dio lugar a la liberación del fármaco activada (es decir, en el sitio del tumor) pero mantuvo estabilidad en la circulación de sangre7,8. A pesar de años de investigación y uso clínico, los sinos intratumoral de nanocarriers como Dox-NP no son todavía completamente claros. En una publicación reciente, se demostró que la nanopartícula es tomada como un todo mientras que el dox queda atrapado en los lisosomas9.
La absorción celular de un lanzamiento de nanopartículas y de la droga son procesos dinámicos que mejor pueden ser monitoreados usando proyección de imagen de células vivas. Por otra parte, histología clásica, en que las células se incuban y después de eso fijo, puede dar resultados falsos si la fijación destruye el portador liposomal e introduce artefactos. El requisito principal para la proyección de imagen de células vivas es visualización, preferiblemente por fluorescencia, del proceso deseado. Ciertos compuestos, como dox, tienen una fluorescencia roja intrínseca. Además, marcadores fluorescentes pueden ser introducidos en el portador y orgánulos celulares pueden visualizarse utilizando marcadores de células vivas. De esta manera, una matriz de parámetros, como la absorción del portador, liberación del fármaco y localización celular de la portadora y la droga, puede ser reflejada y analizada. Aquí, se describe un método que sigue el destino intercelular de dox y Dox-NP en varias células del tumor en tiempo real. Además, este método puede adaptarse fácilmente para crear las condiciones ideales para dirigida (p. ej., cargada de nanopartículas10) y desencadena liberación del fármaco (p. ej., hipertermia,7).

<table><tbody><tr><td>DMEM (sin fenol-rojo)</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>Suplementado con 1 mM de L-glutamina y 10 % de FCS</td></tr><tr><td>Tripsina-versena (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternero</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Inactivar el calor durante 30 min a 55 &ordm; C</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel bovina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Hacer una solución al 0,1% en PBS, estéril</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0,22 &micro; Filtro M - 500 ml&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypan-blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Células: Carcimoma de pulmón</td><td>de Lewis ATCC</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>Células: B16BL6</td><td>El Dr. P. Brouckaert, de la Universidad de Gante,</td><td>donó</td><td>Ref.10</td></tr><tr><td>Células: BLM y 1F6</td> El <td>Dr. van Muijen, de la Universidad de Nimega</td>, <td>donó</td> la placa de Petri <td>Ref.11</td></tr><tr><td></td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Doxorrubicina</td><td>Actavis&nbsp;</td><td></td><td>mencionado como dox en el manuscrito</td></tr><tr><td>Doxil/Caelyx</td><td>Janssen-Cilag</td><td></td><td>mencionado como Dox-NP en el manuscrito</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 0.2 &micro; m</td><td>VWR international</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>Lysotracker-verde DND-26</td><td>Invitrogen</td><td>L7526</td><td>mencionado como marcador lisosomal (LM)-verde en el manuscrito</td></tr><tr><td>Lysotracker-rojo DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>mencionado como marcador liosomal (LM)-rojo en el manuscrito</td></tr><tr><td>Anillo de células Attofluor</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 25 mm #1</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td>CB00250RA1</tr><tr><td>Soporte de escenario + tapa de sellado</td><td>Microscopio</td> ZEISS LSM 510 hecho <td></td><td></td>a medida</tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software LSM 510 versión 3.2 SP2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr></tbody></table>

usando in vitro células vivas imágenes para explorar quimioterápicos entregado por nanopartículas basadas en lípidos

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Técnicas de imagen convencionales pueden proporcionar información detallada sobre los procesos celulares. Sin embargo, esta información se basa en imágenes estáticas en un sistema dinámico de lo contrario, y sucesivas fases son fácilmente pasados por alto o mal interpretadas. Imágenes de células vivas y microscopía de Time-lapse, en la que las células vivas pueden seguir para horas o incluso días de una manera más o menos continua, por lo tanto son muy informativos. El protocolo aquí descrito permite la investigación de la suerte de nanopartículas quimioterapéuticas después de la entrega de doxorrubicina (dox) en células vivas. DOX es un agente intercalante que debe liberarse su nanocarrier a ser biológicamente activos. A pesar de su registro clínico durante más de dos décadas, su absorción, descomposición y liberación del fármaco no se entienden. Este artículo explora la hipótesis de que las nanopartículas basadas en lípidos son tomadas por las células del tumor y se degradan lentamente. Dox liberado entonces se transloca al núcleo. Para evitar artefactos de fijación, proyección de imagen de células vivas y microscopía de Time-lapse, que se describe en este procedimiento experimental, se pueden aplicar.

Etiquetado portadores liposomal con diferentes marcadores ha sido descrito previamente9. Portadores con dioctadecyl far-red tetramethylindotricarbocyanine perclorato (lo hizo; Ex = 644 nm; Em = 665 nm) o 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) verde (CF-PE; Ex = 490 nm; Em = 515 nm) se presenta en este manuscrito. Para mostrar intercelulares similitudes y diferencias en la absorción, liberación y localización intracelular, se estudiaron varios tipos de tumor. Estos incluyen dos líneas de ratón, el melanoma B16BL6 del11 y el carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) y dos melanomas humanos, un altamente metastático (BLM) y una de12,de melanoma no metastásico (1F6)13. Todos los experimentos se realizaron utilizando células vivas. En todos los experimentos, una concentración de 5 μg/mL dox, 5 μg/mL Dox-NP o 0,05 μmol de nanopartículas fueron administrados para 3 o 24 h. medidos y analizado dox (en forma libre, liberado, encapsulado, secuestrado o intercalado) se denominan DXR. 40 X (apertura numérica: 1.3) objetivo de aceite fue utilizado, y la proyección de imagen fue realizada con un láser de argón 488 de nm (energía de 10% / 0,2 mW) y un filtro de paso banda 505 a 550 nm para CF-PE y marcador lisosomal (LM)-verde. A 543 nm láser de helio-neon (100% / potencia de 0,2 mW) y un filtro de paso banda de 560 a 615 nm para dox, Dox-NP y rojo marcador lisosomal. A 633 nm láser de helio-neon (potencia 100% / 0.5 mW) y un filtro de paso de largo 640 nm se utilizó para lo.
Debido a su encapsulado, la citotoxicidad en vitro , biodisponibilidad y farmacocinética de dox fueron significativamente alterados3,9,14. La diferencia entre la biodisponibilidad de la droga cuando se administra en forma libre y encapsulado se demuestra en la figura 3. DOX es un agente intercalante y debe entrar al núcleo celular para ser citotóxico. Figura 3 y relacionados peliculas 1 y 2 muestran un 3 h Time-lapse de BLM células tratadas con dox o Dox-NP en condiciones idénticas. Dentro de minutos de exposición de dox, DXR nuclear puede observarse (Figura 3A, 1 película) y, utilizando una menor ganancia (insertar), puede verse intercalando en el núcleo. En cambio, cuando se exponen a Dox-NP, DXR intracelular es apenas visible dentro de este marco de tiempo (figura 3B, película 2). Sólo mediante el aumento de la ganancia del fotomultiplicador, DXR en el citoplasma puede observarse (insertar). Utilizar ImageJ, analizaron la densidad de píxeles de DXR citoplásmica y nuclear. Como las células están en movimiento durante la evaluación de lapso de tiempo, es importante combinar los fluorescentes con imágenes de campo claro. Esto presenta la posibilidad de seguimiento de las células individuales y estabilizar la deriva XY usando plugins específicos en ImageJ. En el análisis presentado en la figura 3, la imagen de campo claro se utiliza para dibujar una región de interés (ROI) en el citoplasma (línea sólida) y el núcleo (línea punteada). El Gerente de ROI en ImageJ puede encontrarse en el menú Analyze &#62; herramientas &#62; Gerente de ROI. Los ROIs se utilizan en la imagen fluorescente para analizar densidad de píxeles mediante la opción del menú Analyze &#62; medida. La diferencia entre la densidad de píxeles en el núcleo (figura 3) y el citoplasma (figura 3D) de las células tratadas dox o con Dox-NP confirma lo que se ve en las imágenes. Además, las células fueron incubadas durante 24 h con dox o Dox-NP, después de que el compuesto fue reemplazado por medio y reflejado inmediatamente con el aumento de la sensibilidad de la ganancia del fotomultiplicador (figura 4). Otros ámbitos, como la energía del laser, offset, agujero de alfiler y visualización de imágenes, eran idénticos. Es sorprendente la baja señal DXR en Dox-NP-células tratadas con respecto al Tratado de dox. Con una ganancia de 700, DXR en las células tratadas con Dox-NP se hace visible, mientras que la imagen de dox ya está sobreexpuesta. Este experimento simple en vitro visualiza una diferencia significativa en la biodisponibilidad de libre versus droga encapsulada.
Cuando las células están continuamente expuestas a Dox-NP durante 24 h, DXR se acumula con el tiempo, como se muestra en la figura 5A y películas 3 y 4. La señal aumenta en el citoplasma, y más tarde, DXR también se encuentra intercalada en el núcleo. Estas observaciones son confirmadas por las gráficas de densidad de píxeles (figura 5B). La densidad de píxeles citoplásmico medido es menor en BLM en comparación con las células 1F6 debido a la diferencia en la distribución intracelular. Mientras que DXR en células 1F6 se distribuye a lo largo de la célula, DXR en células BLM está más concentrado en un organelo cerca del núcleo (figura 5).
Por lo tanto, se investigó la localización de drogas y portador en diferentes líneas celulares (figura 6). Las células fueron incubadas durante 24 h con Dox-NP/hizo y reflejada. Usando la imagen de campo claro, un recubrimiento de la membrana celular (línea sólida) y núcleo (línea punteada) fue dibujado en la imagen fluorescente de tres diferentes líneas celulares. Se demuestra aquí que el portador, con lo hizo, sigue el mismo patrón citoplásmico como DXR: concentra en un organelo cerca del núcleo de BLM, alrededor del núcleo entero en LLC y esparcidas al azar por todo el citoplasma en las células B16BL6. En el núcleo, sólo DXR y no lo hizo puede verse, indicando lanzado dox. Al reducir la ganancia del fotomultiplicador, vesículas celulares individuales que contienen DXR y el portador, con lo, así como con el CF-PE (figuras 6B y 6C), se pueden ver.
DXR citoplásmico secuestra en pequeñas vesículas y células fueron etiquetadas con un marcador lisosomal de células vivas en verde o rojo. Puede seguir el movimiento de estos lisosomas en las células (película 5). DXR citoplásmico y el nanocarrier colocalize dentro de estas estructuras, y la diferencia intercelular en el patrón DXR, como se ve en la figura 6, se explica aquí. Lisosomas se distribuyen al azar por todo el citoplasma en B16BL6 y se encuentran cerca del núcleo en las células de la BLM (Figura 7A). Utilizar ImageJ, la colocalización entre DXR y portador en el lisosoma se calculó (figura 7B). Las imágenes de color se hicieron binario (proceso de &#62; binario &#62; binario hacer) y con el plug-in de colocalización (analizar &#62; colocalización), se hizo una imagen de colocalización de DXR con hizo. Esto crea una imagen de color verde-rojo-blanco, con píxeles blancos que representan los píxeles colocalized de ambas imágenes. A través del menú artículo proceso &#62; binario &#62; hacer binario, los píxeles blancos se separó y convierten a píxeles negros, de los cuales se mide la densidad de píxeles (analizar &#62; medida). Después de eso, se hizo una imagen de colocalización entre este DXR-de la imagen y la imagen binaria del marcador lisosomal (LM) y la densidad de píxeles medidos. Los datos de colocalización están el porcentaje de píxeles positivos para DXR-hizo y marcador DXR-hizo/lisosomal (figura 7). Que el portador, etiquetado con el CF-PE, así como lo hizo, se encuentra en el lisosoma también se muestra en la figura 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig1.jpg"> 
Figura 1: instrumentos y equipos configuración. A) imágenes cámara + necesidades. vidrio de cubierta #1 de 25 mm (1), parte inferior de la cámara (2), superior de la cámara (lugard arriba hacia abajo) y junta tórica (3), titular de la etapa (4) y cierre la tapa (5). Barra de escala: 2 cm. B) unidad de incubación. Platina del microscopio climatizada (1), flujo etapa con en - y hacia fuera - flujo de CO2 (2), una sonda de2 CO (3) y un parche de cierre (4). Barra de escala: 2 cm. C) imágenes cámara en la unidad de incubadora, como se ha visto bajo el microscopio. D) macro de la serie y tiempo. E) equipo para la proyección de imagen. Invertido microscopio (1), luz fluorescente (2), informática (3), calentador de anillo (4, insertar) y controlador (Figura 4, principal), tubería de flujo de CO2 (5), CO2 válvula (6), controlador de CO2 (7), CO2 humidificador (8), O la válvula2 y regulador (9) y regulador de temperatura de la etapa (10). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig2.jpg"> 
Figura 2: esquemática de los parámetros de microscopio en protocolo sección 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig3.jpg"> 
Figura 3: investigando la captación a corto plazo de dox y Dox-NP.  Células BLM fueron expuestas continuamente a dox o Dox-NP 3 h, y un time-lapse fue tomado. (A) fotografías de Time-lapse de las células que se incubaron con dox. (B) fotografías de Time-lapse de las células se incubaron con Dox-NP. Barra de escala = 50 μm. (C) píxeles densidad aumento de DXR nuclear en células tratadas dox y con Dox-NP. (D) aumento de densidad de píxeles de DXR citoplasmática en células tratadas dox y con Dox-NP. Los datos representan la media ± SD de 3 células por campo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig4.jpg"> 
Figura 4: investigar la absorción a largo plazo de dox y Dox-NP en diferentes líneas celulares. Las células fueron expuestas a dox o Dox-NP e imagen 24 h más tarde. Imágenes fueron tomadas inmediatamente después del retiro de las drogas, con 3 diferentes ganancias. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig5.jpg"> 
Figura 5: investigar la absorción celular y liberación de agentes liposómicos. Las células fueron expuestas continuamente a Dox-NP durante 24 h, y un time-lapse fue hecho. (A) imágenes fijas de los time-lapse. Barra de escala = 50 μm. (B) píxeles densidad aumento de DXR en el núcleo y el citoplasma. Los datos representan la media ± SD de 3 células por campo. Imágenes (C) demostrar la localización de DXR dentro de la célula. Línea sólida: membrana celular, línea punteada: núcleo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig6.jpg"> 
Figura 6: investigar la localización de drogas y portador en líneas celulares diferentes. (A) las células fueron expuestas a Dox-NP/24 h y reflejadas. Barra de escala = 50 μm. (B) las células fueron expuestas a Dox-NP/hizo/CF-PE durante 24 h y reflejadas con una ganancia de intensidad baja para distinguir las vesículas individuales. (C) el campo brillante y DXR superposición mostrando DXR en vesículas citoplasmáticas (flecha). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig7.jpg"> 
Figura 7: investigación de la localización intracelular de la droga y portador de. Las células fueron expuestas a Dox-NP/hizo o CF-PE/lo hizo por 24 h, y lisosomas se visualizan mediante el marcador lisosomal de células vivas (LM) en color verde o rojo. (A) localización intracelular de DXR y el portador (lo hizo). Las flechas representan 3 ejemplos de DXR e hicieron localizadas en el lisosoma. Barra de escala = 50 μm. (B) análisis co-localización de DXR y el portador (hizo) en los lisosomas (LM) con ImageJ. (C) porcentaje de co-localización de DXR y el portador en los lisosomas. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos individuales. (D) el secuestro Lysosomal del portador había visualizado usando dos diferentes marcadores. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig7large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov1.jpg"> 
Película 1: relacionados con Figura 3 : Las células de la BLM se incubaron con dox para 3 h. Time-lapse: 19 imágenes, con un intervalo de 10 minutos de fotogramas: 3 fps. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_1_BLM_Doxorubicin_for_3h.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov2.jpg"> 
Película 2: relacionados con Figura 3 : Las células de la BLM se incubaron con Dox-NP para 3 h. Time-lapse: 19 imágenes, con un intervalo de 10 minutos de fotogramas: 3 fps. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_2_BLM_Doxil_for_3h.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov3v3.jpg"> 
Película 3: relacionados con Figura 5 : Las células de la BLM se incubaron con Dox-NP para 24 h. Time-lapse: 96 imágenes, con un intervalo de fotogramas de 15 min.: 8 fps. Barra de escala = 50 μm.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a href=""></a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a>objetivo vi"="_blank"&gt; haga clic aquí para ver este video. (Clic para descargar).
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov4.jpg"> 
Movie 4: relacionados con Figura 5 : 1F6 células fueron incubadas con Dox-NP durante 24 h. Time-lapse: 96 imágenes, con un intervalo de fotogramas de 15 min.: 8 fps. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_4_1F6_Doxil_for_24h.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 5" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov5.jpg"> 
Movie 5: relacionados con Figura 7 : Lisosomas de B16BL6 células fueron teñidas con un marcador de células vivas. Time-lapse: 10 imágenes, con un intervalo de 10 s. tarifa de marco: 3fps. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_5_B16BL6_lysotracker.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)</a>

Proyección de imagen de células vivas es una poderosa herramienta para visualizar procesos dinámicos. El examen de las células fijas proporciona sólo imágenes estáticas, que pueden conducir a malas interpretaciones y confusión sobre el proceso. Este trabajo presenta un método para estudiar la absorción, liberación de fármaco y localización intracelular de la nanopartículas en las células vivas.

Usando In Vitro células vivas imágenes para explorar quimioterápicos entregado por nanopartículas basadas en lípidos

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

El objetivo general de esta técnica de imagen en células vivas es seguir procesos celulares como la absorción y distribución de agentes quimioterapéuticos sin necesidad de fijación. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer, tales como: cómo los agentes quimioterapéuticos, ya sea en forma libre o encapsulados en nanopartículas, son absorbidos por las células tumorales. La principal ventaja de esta técnica es que se están obteniendo imágenes de células vivas, evitando así artefactos de fijación y permitiendo una evaluación dinámica en tiempo real.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos que las nanopartículas se descomponían durante la fijación, lo que llevaba a una interpretación errónea de la entrega del fármaco. Para armar la cámara de imagen, coloque un cubreobjetos de 25 milímetros en la parte inferior de la cámara y enrosque la parte superior a la parte inferior. No apriete demasiado, ya que el vidrio puede romperse.Sterilice toda la cámara en autoclave. Para sembrar las células, retire la cámara de imagen del bolsa de esterilización dentro de una cabina de flujo laminar. Ajuste cuidadosamente la cámara y colóquela en una placa de Petri.Recubra el vidrio de la cámara de imagen con un mililitro de gelatina estéril al 0,1 por ciento durante 20 minutos a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono. Después de eliminar el medio de los frascos de cultivo celular, lave las células una vez con PBS 1x y desprenda las células utilizando tripsina al 0,25 por ciento. Inactive la tripsina agregando medio de cultivo celular.Luego, recolecte las células y centrifúguelas a 1.100 G durante cinco minutos. Re-suspenda el precipitado en cinco mililitros de medio de cultivo celular. Después de contar las células según se describe en el protocolo del texto, aspire la gelatina y siembre las células en una dilución que permita un máximo del 70 por ciento de cobertura dentro de las 24 horas.Deje que las células se adhieran durante 24 horas en un ambiente con cinco por ciento de dióxido de carbono y a 37 grados centígrados. Realice una evaluación de las células bajo el microscopio para verificar la confluencia, la morfología celular y la contaminación. Luego, encienda el microscopio confocal, la luz fluorescente y la computadora.Conecte el calentador de lente al objetivo y ajústelo a 35 grados. Prepare la unidad de incubación como se muestra en el protocolo del texto. Coloque la unidad de incubación sobre la platina del microscopio y conecte los tubos de entrada y salida de dióxido de carbono.Abra la válvula principal de dióxido de carbono y encienda el controlador de dióxido de carbono. Verifique que el controlador esté ajustado al cinco por ciento de dióxido de carbono. Condiciones adecuadas de cultivo celular, como temperatura, CO2, pH, humedad y esterilidad, son cruciales para la obtención de imágenes celulares a largo plazo.Por lo tanto, cada incubadora debe probarse adecuadamente. Establezca la temperatura del platino en 37 grados Celsius. Permita que la unidad de incubación alcance la temperatura seleccionada y el porcentaje de dióxido de carbono.Saque la cámara de imagen del incubador principal de dióxido de carbono y transporte la cámara en una placa de Petri hasta la sala de microscopía. Coloque la cámara de imagen en un soporte personalizado para platina de 35 milímetros de diámetro y cierre la cámara con una tapa sellante personalizada. Abra la unidad de incubación y, trabajando lo más rápido posible para evitar el enfriamiento de las células, sustituya el parche rojo por la cámara de imagen y luego cierre la unidad.Asegúrese de que ningún cable esté atrapado entre la platina y el microscopio. Deje que la unidad se aclimatare durante 30 minutos. A continuación, abra el software y encienda el láser.Cree una base de datos nueva haciendo clic en "Nuevo" bajo la pestaña Archivo. Asigne un nombre y guarde la base de datos. Establezca la configuración haciendo clic en "Configuración" bajo la pestaña Adquirir.Seleccione el modo de canal y "Pista única" para evaluar un solo fluoróforo. Seleccione "Pista múltiple" para varios fluoróforos. Luego, elija los filtros de paso de banda adecuados, coincidiendo con el fluoróforo.Seleccione el canal de campo brillante en una de las pistas. El escaneo se ve comprometido entre la señal fluorescente de los compuestos y la calidad de la imagen. La sobreexposición, el fotoblanqueo, la relación señal-ruido, la calidad de las células y los compuestos añadidos son todos factores que pueden influir en los resultados y que deben probarse adecuadamente.Configure el control de escaneo haciendo clic en Escanear"bajo la pestaña Adquirir. Luego, haga clic en Modo"para establecer el tamaño del cuadro, la velocidad de escaneo, la dirección de escaneo y el promedio de escaneo. Haga clic en Canales"para ajustar el Pinhole, la Ganancia y el Desplazamiento, así como la potencia del láser.Guarde estos ajustes haciendo clic en Config" en la pestaña Configuración y guárdelos en la base de datos de configuración. Establezca el intervalo de tiempo haciendo clic en Muti TimeX" en la pestaña Macro. Haga clic en Una sola ubicación.Aplique la configuración guardada haciendo clic en Pista individual y desplácese hasta la configuración requerida en la base de datos de configuración. Establezca el intervalo de tiempo y el número de escaneos. Cargue la configuración haciendo clic en Cargar conf.Asigne un nombre al lapse de tiempo en el Nombre de Archivo Base y seleccione la base de datos haciendo clic en "Base de Datos de Imágenes" para guardar el lapse de tiempo. Establezca una carpeta temporal haciendo clic en "Carpeta de Imágenes Temporal". A continuación, abra la unidad de incubación, levante el anillo de imagen, agregue una gota de aceite de inmersión al objetivo y cierre la unidad lo más rápido posible. Enfoque y seleccione una posición en la cámara de imagen.En la cabina de flujo laminar, diluya el fármaco libre o los nanopartículas a una concentración de cinco microgramos por mililitro de fármaco o 0,05 micromoles de lípidos en medio de cultivo celular. Filtre mediante un filtro de jeringa de 0,22 micrones si el fármaco o las nanopartículas no son estériles. Abra la cámara de incubación y levante la tapa superior.Luego, retire el medio de las células, agregue un mililitro de fármaco diluido o nanopartículas y cierre la unidad lo más rápido posible. Enfóquese en las células y realice un escaneo rápido haciendo clic en "Único" en la pestaña Control de Escaneo. Cuando la imagen de campo claro muestre las células enfocadas, inicie el lapse de tiempo haciendo clic en "Iniciar Tiempo" en el Macro de Tiempo Múltiple.El número de repeticiones y el tiempo restante se muestra en la macro y en las imágenes. Verifique periódicamente si las células siguen enfocadas o utilice el enfoque automático. El programa guarda automáticamente la serie temporal en la base de datos.No cierre la base de datos mientras el programa está en ejecución. Este es un registro de lapsos de tiempo de tres horas de células expuestas a doxorrubicina libre. Observe la absorción y la translocación inmediata de la doxorrubicina fluorescente roja hacia el núcleo.Aquí, las células se incuban durante tres horas con doxorrubicina encapsulada. La señal fluorescente es mucho más baja y se localiza en el citoplasma. La señal es apenas visible en el núcleo.Al transferir estas películas de lapso de tiempo a Image J, se puede dibujar una región de interés alrededor del núcleo y se puede medir la densidad de píxeles. La gráfica presentada aquí muestra la diferencia en la captación nuclear a lo largo del tiempo en células incubadas con doxorrubicina libre o encapsulada. Aquí se muestran células incubadas con doxorrubicina encapsulada, indicada en rojo.La señal púrpura representa el vehículo y los lisosomas se tiñen con un marcador verde para células vivas. La comparación de ambos tipos celulares muestra una diferencia en la distribución lisosomal. Los lisosomas en las células B16BL6 se distribuyen a lo largo del citoplasma.Por otro lado, los lisosomas en las células BLM se localizan cerca del núcleo. Sin embargo, ambas líneas celulares muestran una alta colocalización de la señal roja y púrpura en los lisosomas, lo que indica que la doxorrubicina y su vehículo quedan atrapados en estos orgánulos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes de la incorporación de agentes quimioterapéuticos y otros marcadores fluorescentes en células vivas durante varias horas o incluso días.

using-vitro-live-cell-imaging-to-explore-chemotherapeutics-delivered

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Se presenta un nuevo enfoque para cuantificar la localización de las nanopartículas en los vasos sanguíneos de los tumores humanos transplantados con dinámica y en tiempo real de imágenes intravital en un modelo de embrión aviar.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Nanopartículas de plantas virales (VNPs) son prometedoras plataformas para aplicaciones en biomedicina. A continuación, se describen los procedimientos para la propagación de plantas VNP, purificación, caracterización y bioconjugación. Finalmente, mostramos la aplicación de VNPs para la recalada del tumor y la formación de imágenes mediante un modelo de xenotrasplante de ratón y de imágenes de fluorescencia.

Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

Se describe un método para la formación de imágenes respuesta a tratamiento contra el...

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

El uso de fluoróforos para la obtención de imágenes in vivo puede verse muy limitado por la opsonización, el aclaramiento rápido, la baja sensibilidad de detección y los efectos citotóxicos en el huésped. La encapsulación de fluoróforos en liposomas mediante hidratación y extrusión de película conduce a la extinción y protección de la fluorescencia, lo que permite obtener imágenes in vivo con una alta sensibilidad de detección.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico

Los estudios de biomoléculas in vivo son cruciales para comprender la función molecular en un contexto biológico. Aquí describimos un método novedoso que permite la internalización de biomoléculas fluorescentes, como el ADN o las proteínas, en microorganismos vivos. También se presenta y discute el análisis de datos in vivo registrados por microscopía de fluorescencia.

Internalización y Observación de fluorescente Biomoléculas en microorganismos que viven a través de electroporación

Una nanopartícula de cristal líquido (LCNP) nanotransportador es explotado como un vehículo para la administración controlada de una carga hidrofóbica en la membrana plasmática de las células vivas.

Targeted membrana plasmática Entrega de cargo encapsulado hidrofóbico en un cristal líquido portador de nanopartículas

La escasa comprensión del rendimiento in vivo de las nanomedicinas obstaculiza su traslación clínica. Aquí se describen los procedimientos para evaluar el comportamiento in vivo de los nanomedicamentos contra el cáncer a nivel sistémico, tisular, unicelular y subcelular en ratones inmunocompetentes portadores de tumores. Este enfoque puede ayudar a los investigadores a identificar nanomedicamentos prometedores contra el cáncer para su traslación clínica.

Un procedimiento adecuado para evaluar la<em&gt; En Vivo</em&gt; Rendimiento de cáncer Nanomedicinas

Proyección de imagen de células vivas proporciona una riqueza de información en las células o poblaciones enteras que es inalcanzable por célula fija la proyección de imagen solamente. Aquí, se describen protocolos de células vivas para evaluar las decisiones de destino celular después del tratamiento con el fármaco anti-mitotic paclitaxel.

A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

El objetivo de este protocolo es sintetizar liposomas marcados con fluorescencia y utilizar la citometría de flujo para identificar la localización in vivo de liposomas a nivel celular.

Preparación, administración y evaluación de la captación celular in vivo específica del tejido de liposomas marcados con colorante fluorescente

Presentamos un protocolo para el uso de la microendoscopía láser confocal de fibra óptica (LMC) para estudiar de forma no invasiva la distribución espacio-temporal de los liposomas en el ojo tras la inyección subconjuntival.

Imágenes espacio-temporales in vivo de sistemas oculares de administración de fármacos mediante microendoscopía láser confocal de fibra óptica

Aquí, se presenta un protocolo para la formulación de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulan el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga. La potencia de estos LNP se probó in vitro en células HepG2 e in vivo en ratones C57BL/6.

Prueba de la eficiencia in vitro e in vivo de nanopartículas lipídicas de ARNm formuladas mediante mezcla microfluídica

Aprende a visualizar la captación y distribución de agentes quimioterapéuticos en células vivas mediante imágenes en tiempo real. Este método evita artefactos de fijación y permite evaluar dinámicamente la entrega de fármacos en investigación oncológica.

Usando In Vitro células vivas imágenes para explorar quimioterápicos entregado por nanopartículas basadas en lípidos

Explorar más videos