Usando In Vitro células vivas imágenes para explorar quimioterápicos entregado por nanopartículas basadas en lípidos
1 de noviembre de 2017
Proyección de imagen de células vivas es una poderosa herramienta para visualizar procesos dinámicos. El examen de las células fijas proporciona sólo imágenes estáticas, que pueden conducir a malas interpretaciones y confusión sobre el proceso. Este trabajo presenta un método para estudiar la absorción, liberación de fármaco y localización intracelular de la nanopartículas en las células vivas.
El objetivo general de esta técnica de imagen en células vivas es seguir procesos celulares como la absorción y distribución de agentes quimioterapéuticos sin necesidad de fijación. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer, tales como: cómo los agentes quimioterapéuticos, ya sea en forma libre o encapsulados en nanopartículas, son absorbidos por las células tumorales. La principal ventaja de esta técnica es que se están obteniendo imágenes de células vivas, evitando así artefactos de fijación y permitiendo una evaluación dinámica en tiempo real.
Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos que las nanopartículas se descomponían durante la fijación, lo que llevaba a una interpretación errónea de la entrega del fármaco. Para armar la cámara de imagen, coloque un cubreobjetos de 25 milímetros en la parte inferior de la cámara y enrosque la parte superior a la parte inferior. No apriete demasiado, ya que el vidrio puede romperse.
Sterilice toda la cámara en autoclave. Para sembrar las células, retire la cámara de imagen del bolsa de esterilización dentro de una cabina de flujo laminar. Ajuste cuidadosamente la cámara y colóquela en una placa de Petri.
Recubra el vidrio de la cámara de imagen con un mililitro de gelatina estéril al 0,1 por ciento durante 20 minutos a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono. Después de eliminar el medio de los frascos de cultivo celular, lave las células una vez con PBS 1x y desprenda las células utilizando tripsina al 0,25 por ciento. Inactive la tripsina agregando medio de cultivo celular.
Luego, recolecte las células y centrifúguelas a 1.100 G durante cinco minutos. Re-suspenda el precipitado en cinco mililitros de medio de cultivo celular. Después de contar las células según se describe en el protocolo del texto, aspire la gelatina y siembre las células en una dilución que permita un máximo del 70 por ciento de cobertura dentro de las 24 horas.
Deje que las células se adhieran durante 24 horas en un ambiente con cinco por ciento de dióxido de carbono y a 37 grados centígrados. Realice una evaluación de las células bajo el microscopio para verificar la confluencia, la morfología celular y la contaminación. Luego, encienda el microscopio confocal, la luz fluorescente y la computadora.
Conecte el calentador de lente al objetivo y ajústelo a 35 grados. Prepare la unidad de incubación como se muestra en el protocolo del texto. Coloque la unidad de incubación sobre la platina del microscopio y conecte los tubos de entrada y salida de dióxido de carbono.
Abra la válvula principal de dióxido de carbono y encienda el controlador de dióxido de carbono. Verifique que el controlador esté ajustado al cinco por ciento de dióxido de carbono. Condiciones adecuadas de cultivo celular, como temperatura, CO2, pH, humedad y esterilidad, son cruciales para la obtención de imágenes celulares a largo plazo.
Por lo tanto, cada incubadora debe probarse adecuadamente. Establezca la temperatura del platino en 37 grados Celsius. Permita que la unidad de incubación alcance la temperatura seleccionada y el porcentaje de dióxido de carbono.
Saque la cámara de imagen del incubador principal de dióxido de carbono y transporte la cámara en una placa de Petri hasta la sala de microscopía. Coloque la cámara de imagen en un soporte personalizado para platina de 35 milímetros de diámetro y cierre la cámara con una tapa sellante personalizada. Abra la unidad de incubación y, trabajando lo más rápido posible para evitar el enfriamiento de las células, sustituya el parche rojo por la cámara de imagen y luego cierre la unidad.
Asegúrese de que ningún cable esté atrapado entre la platina y el microscopio. Deje que la unidad se aclimatare durante 30 minutos. A continuación, abra el software y encienda el láser.
Cree una base de datos nueva haciendo clic en "Nuevo" bajo la pestaña Archivo. Asigne un nombre y guarde la base de datos. Establezca la configuración haciendo clic en "Configuración" bajo la pestaña Adquirir.
Seleccione el modo de canal y "Pista única" para evaluar un solo fluoróforo. Seleccione "Pista múltiple" para varios fluoróforos. Luego, elija los filtros de paso de banda adecuados, coincidiendo con el fluoróforo.
Seleccione el canal de campo brillante en una de las pistas. El escaneo se ve comprometido entre la señal fluorescente de los compuestos y la calidad de la imagen. La sobreexposición, el fotoblanqueo, la relación señal-ruido, la calidad de las células y los compuestos añadidos son todos factores que pueden influir en los resultados y que deben probarse adecuadamente.
Configure el control de escaneo haciendo clic en Escanear"bajo la pestaña Adquirir. Luego, haga clic en Modo"para establecer el tamaño del cuadro, la velocidad de escaneo, la dirección de escaneo y el promedio de escaneo. Haga clic en Canales"para ajustar el Pinhole, la Ganancia y el Desplazamiento, así como la potencia del láser.
Guarde estos ajustes haciendo clic en Config" en la pestaña Configuración y guárdelos en la base de datos de configuración. Establezca el intervalo de tiempo haciendo clic en Muti TimeX" en la pestaña Macro. Haga clic en Una sola ubicación.
Aplique la configuración guardada haciendo clic en Pista individual y desplácese hasta la configuración requerida en la base de datos de configuración. Establezca el intervalo de tiempo y el número de escaneos. Cargue la configuración haciendo clic en Cargar conf.
Asigne un nombre al lapse de tiempo en el Nombre de Archivo Base y seleccione la base de datos haciendo clic en "Base de Datos de Imágenes" para guardar el lapse de tiempo. Establezca una carpeta temporal haciendo clic en "Carpeta de Imágenes Temporal". A continuación, abra la unidad de incubación, levante el anillo de imagen, agregue una gota de aceite de inmersión al objetivo y cierre la unidad lo más rápido posible. Enfoque y seleccione una posición en la cámara de imagen.
En la cabina de flujo laminar, diluya el fármaco libre o los nanopartículas a una concentración de cinco microgramos por mililitro de fármaco o 0,05 micromoles de lípidos en medio de cultivo celular. Filtre mediante un filtro de jeringa de 0,22 micrones si el fármaco o las nanopartículas no son estériles. Abra la cámara de incubación y levante la tapa superior.
Luego, retire el medio de las células, agregue un mililitro de fármaco diluido o nanopartículas y cierre la unidad lo más rápido posible. Enfóquese en las células y realice un escaneo rápido haciendo clic en "Único" en la pestaña Control de Escaneo. Cuando la imagen de campo claro muestre las células enfocadas, inicie el lapse de tiempo haciendo clic en "Iniciar Tiempo" en el Macro de Tiempo Múltiple.
El número de repeticiones y el tiempo restante se muestra en la macro y en las imágenes. Verifique periódicamente si las células siguen enfocadas o utilice el enfoque automático. El programa guarda automáticamente la serie temporal en la base de datos.
No cierre la base de datos mientras el programa está en ejecución. Este es un registro de lapsos de tiempo de tres horas de células expuestas a doxorrubicina libre. Observe la absorción y la translocación inmediata de la doxorrubicina fluorescente roja hacia el núcleo.
Aquí, las células se incuban durante tres horas con doxorrubicina encapsulada. La señal fluorescente es mucho más baja y se localiza en el citoplasma. La señal es apenas visible en el núcleo.
Al transferir estas películas de lapso de tiempo a Image J, se puede dibujar una región de interés alrededor del núcleo y se puede medir la densidad de píxeles. La gráfica presentada aquí muestra la diferencia en la captación nuclear a lo largo del tiempo en células incubadas con doxorrubicina libre o encapsulada. Aquí se muestran células incubadas con doxorrubicina encapsulada, indicada en rojo.
La señal púrpura representa el vehículo y los lisosomas se tiñen con un marcador verde para células vivas. La comparación de ambos tipos celulares muestra una diferencia en la distribución lisosomal. Los lisosomas en las células B16BL6 se distribuyen a lo largo del citoplasma.
Por otro lado, los lisosomas en las células BLM se localizan cerca del núcleo. Sin embargo, ambas líneas celulares muestran una alta colocalización de la señal roja y púrpura en los lisosomas, lo que indica que la doxorrubicina y su vehículo quedan atrapados en estos orgánulos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes de la incorporación de agentes quimioterapéuticos y otros marcadores fluorescentes en células vivas durante varias horas o incluso días.
Resumen
Este estudio presenta una técnica de microscopía en células vivas para visualizar en tiempo real la absorción y distribución de agentes quimioterapéuticos. Al evitar los artefactos por fijación, el método permite observar con precisión los procesos de administración de fármacos en células vivas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Neurociencia
- Investigación del Cáncer
Antecedentes
- La imagenología en células vivas proporciona información dinámica sobre los procesos celulares.
- La imagenología en células fijadas puede llevar a interpretaciones erróneas de los mecanismos de entrega de fármacos.
- Las nanopartículas pueden degradarse durante la fijación, lo que complica el análisis.
- La imagenología en tiempo real es esencial para comprender las interacciones de fármacos en la terapia contra el cáncer.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para rastrear la absorción de agentes quimioterapéuticos en células vivas.
- Evaluar la distribución de nanopartículas sin artefactos por fijación.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de administración de fármacos en células tumorales.
Métodos Utilizados
- Preparación de una cámara de imagen para la observación de células vivas.
- Cultivo celular en condiciones controladas (temperatura, CO2, humedad).
- Uso de microscopía confocal para monitorear procesos celulares.
- Adquisición de imágenes de lapso de tiempo para capturar cambios dinámicos a lo largo del tiempo.
Resultados principales
- Visualización exitosa de la absorción y distribución de fármacos en tiempo real.
- Se demostraron las ventajas de la imagenología en células vivas frente a los métodos con células fijadas.
- Proporcionó información sobre el comportamiento de las nanopartículas en células vivas.
- Posibilitó la observación de las respuestas celulares ante la exposición a fármacos.
Conclusiones
- La imagenología en células vivas es una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos de entrega de fármacos.
- El método reduce el riesgo de interpretación errónea asociado con la fijación.
- Las aplicaciones futuras podrían mejorar las estrategias de tratamiento del cáncer.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagenología en células vivas permite el seguimiento en tiempo real de la incorporación de nanopartículas quimioterapéuticas y su tráfico intracelular, abordando un vacío crítico en el desarrollo de fármacos oncológicos donde los artefactos de fijación ocultan eventos dinámicos de liberación del fármaco y translocación nuclear. Este enfoque facilita la desaceleración mecanicista al proporcionar datos cuantitativos y resueltos en el tiempo sobre la cinética de liberación del fármaco y su localización subcelular, informando directamente la optimización de compuestos líderes y la selección de candidatos preclínicos. Al visualizar el destino de nanocarriers basados en lípidos en células tumorales vivas, el método aumenta la confianza predictiva en las etapas iniciales del descubrimiento, reduciendo la pérdida en fases tardías debido a mecanismos de acción mal comprendidos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la observación directa de la liberación de agentes quimioterapéuticos a partir de nanocarriers y su posterior translocación nuclear, aclarando el vínculo mecanicista entre la administración y la actividad biológica.
- Valor operativo: Elimina los artefactos inducidos por la fijación que distorsionan la integridad de las nanopartículas y la distribución del fármaco, asegurando una interpretación precisa de los perfiles de absorción y liberación.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera mediciones cuantitativas de la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo, lo que permite comparar la cinética de fármacos libres frente a encapsulados en un contexto fisiológicamente relevante.
- Valor operativo: Establece una plataforma estandarizada y reproducible para evaluar sistemas de administración de fármacos basados en nanopartículas bajo condiciones de células vivas, facilitando la escalabilidad del ensayo y el reuso entre proyectos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la degradación del nanocarrier y la liberación del fármaco con la colocalización lisosomal y la acumulación nuclear, proporcionando un biomarcador traslacional para la disponibilidad intracelular del fármaco.
- Valor operativo: Facilita decisiones de avance o interrupción al visualizar si los fármacos encapsulados logran una entrega nuclear suficiente para provocar los efectos farmacológicos esperados, reduciendo la incertidumbre mecanicista en modelos preclínicos.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación del fármaco líder, donde la visualización en tiempo real de la liberación del fármaco y su distribución subcelular informa las relaciones estructura-actividad y la optimización del diseño del nanocarrier antes de las pruebas preclínicas de eficacia.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la estabilidad de los nanocarriers, la cinética de liberación del fármaco y las vías de tráfico intracelular al permitir la observación directa de la translocación del doxorrubicina desde el citoplasma hasta el núcleo.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas listas para ensayos sobre la absorción del fármaco y su acumulación nuclear a lo largo del tiempo, permitiendo la comparación paralela de variables de formulación bajo condiciones idénticas en células vivas.
- Análisis: Ofrece datos de intensidad de fluorescencia en intervalos temporales desde regiones definidas de interés (por ejemplo, núcleo, lisosomas), lo que permite la comparación estadística de la eficiencia de entrega del fármaco entre agentes libres y encapsulados en nanopartículas.
- Investigación Traductiva: Relaciona el comportamiento del nanocarrier en células vivas con resultados farmacológicos posteriores mediante la correlación de los patrones de tráfico lisosomal con la disponibilidad del fármaco en el núcleo, apoyando decisiones de avance alineadas con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad de imagen modular aplicable a múltiples plataformas de nanopartículas y agentes quimioterapéuticos, reduciendo el desarrollo metodológico redundante y permitiendo tamizajes mecanicistas en toda la cartera.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en el mecanismo del fármaco al revelar la liberación del fármaco en tiempo real y la translocación nuclear, reduciendo la ambigüedad en la interacción con el blanco y la activación de la vía.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante la preparación estandarizada de cámaras, controles ambientales y parámetros de imagen, minimizando la variabilidad en estudios longitudinales de células vivas.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al identificar nanovehículos no funcionales en fases tempranas, evitando inversiones en sistemas de administración que no logran liberar el fármaco activo en el sitio de acción.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos a nanovehículos según la liberación intracelular demostrada del fármaco y su entrega nuclear, alineando el avance con la validez mecanicista.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imagenología de células vivas, microscopía confocal y adquisición por lapsos de tiempo para mantener la viabilidad celular y la integridad de la señal durante períodos prolongados.
- Depende de instrumentación especializada, incluidas unidades de incubación con control de temperatura y CO2, láseres confocales y detectores sensibles para el seguimiento de nanopartículas con señales bajas.
- Necesita una estandarización entre equipos de preparación celular, dosificación de fármacos y protocolos de imagenología para garantizar la comparabilidad entre estudios y centros.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes líneas celulares, tamaños de nanopartículas y marcadores fluorescentes, ya que las relaciones señal-ruido y los umbrales de fototoxicidad varían según las condiciones experimentales.
- Las limitaciones prácticas incluyen los riesgos de fotoblanqueo durante la imagenología a largo plazo y la necesidad de optimizar cuidadosamente la potencia del láser y la velocidad de barrido para equilibrar la calidad de la señal con la salud celular.
