Name: Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Aprende a cuantificar automáticamente poblaciones de fibras musculares en secciones completas de músculo de rata mediante inmunohistoquímica de cadenas pesadas de miosina y análisis de imágenes con ImageJ. Este protocolo reduce el tiempo de análisis y la variabilidad entre usuarios.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación de Investigación Christian Doppler. Nos gustaría dar las gracias a Sabine Rauscher de la Imaging Core Facility de la Universidad de Medicina de Viena, Austria, por el apoyo durante todo el proyecto. Los anticuerpos primarios fueron desarrollados por Schiaffino, S., obtenido a partir del hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco, creado por el NICHD del NIH y se mantuvo a la Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, IA.

Todos los procedimientos, incluidos los sujetos con animales se realizaron de acuerdo con los principios del cuidado de los animales de laboratorio según lo recomendado por FELASA 26. La aprobación se obtuvo antes del estudio realizado por la junta de revisión institucional de la Universidad de Medicina de Viena y el Ministerio Austriaco de Investigación y Ciencia (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, número de referencia: BMWF-66.009 / 0222-WF / II / 3b / 2014). 1. Muscle Harvest NOTA: una publicación anterior por Meng et al. 27 es disponible que describe la congelación correcta de las muestras musculares en gran detalle. <ol><li> Obtener músculos enteros o tejido suficiente para adquirir las secciones transversales enteras inmediatamente después de la eutanasia de los animales. <ol><li> Eliminar todo el músculo de una rata anestesiada o sacrificados. Eliminar todo el tejido conectivo y los tendones que rodean el músculo con pinzas y tijeras. Paranesthesia o la eutanasia, siguen las directrices internacionales de FELASA 28. </li></ol></li><li> Pesar muscular usando una balanza de precisión calibrada. Este paso rápido permite análisis comparativos entre las muestras musculares, especialmente después de los procedimientos de intervención. </li><li> Ponga muscular en un recipiente, lleno completamente con compuesto OCT, de acuerdo con el tamaño del músculo con un margen de seguridad de aproximadamente 1 mm a todas las partes (por ejemplo, hecha de papel de aluminio). </li><li> Congelar en aproximadamente 2 min enfriada previamente isopentano utilizando nitrógeno líquido. El isopentano debe comenzar a mostrar cristales de color blanco en la parte inferior del recipiente. NOTA: Este paso es esencial para la preservación de la arquitectura correcta del músculo y de este modo permite que la tinción correcta y analiza fibra 27. </li><li> Guardar las muestras conservadas en OCT durante al menos 24 h a -80 ° C. Las muestras pueden, sin embargo, ser almacenadas a -80 ° C durante varios meses o incluso años, si corre<html> enfría ctly. </li><li> Cortar 10 m secciones transversales de la porción media del músculo a -20 ° C usando un cryotome. Si el corte a 10 micras no es factible, aumentar el espesor en pasos de 2 m hasta un máximo de 20 m. Suficientemente afiladas cuchillas de corte son esenciales para este paso. </li><li> Aplicar las secciones adhesivas a las diapositivas mediante la aproximación de las diapositivas de las secciones transversales. Las secciones transversales se pegarán de forma automática a los portaobjetos adhesivas. Almacenar los portaobjetos a -20 ° C durante la noche antes de la tinción. </li></ol> 2. La tinción Nota: Un gran número de anticuerpos contra proteínas de la cadena pesada de miosina están disponibles; sin embargo, los anticuerpos de alta calidad son esenciales para la adquisición y análisis automatizado. Para diluciones y la referencia a anticuerpos, véase la Tabla 1. Para un archivo de hoja de cálculo para calcular las diluciones correctas y ver el número de cantidades de soluciones requeridas, véasesource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx&quot;&gt;Supplemental archivo 1. <ol><li> Descongelar y aire secar las secciones de músculo congelado durante 10 min antes de que el procedimiento de tinción. </li><li> Lavar los portaobjetos cuidadosamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 0,05% Triton X durante 10 minutos y después durante 5 min. Tritón se ha demostrado que mejora significativamente la calidad de tinción. Véase la discusión para más detalles. </li><li> Deje secciones aire seco durante 2 min y delinear secciones transversales individuales sobre cada portaobjetos con un bolígrafo hidrófobo (para minimizar la cantidad requerida de anticuerpo) y permitir el secado adicional durante 15 min. </li><li> Bloquear todas las diapositivas con PBS + 0,05% de Triton X (PBST) que contenía 10% de suero de cabra durante 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Diluir todos los anticuerpos primarios (Tabla 1) en un cóctel de PBS + Triton X (PBST) que contenía 10% de suero de cabra al 0,05%. Mezclar suficientemente antes de la aplicación. Triton X es esencial para la igualdad de la tinción de las secciones transversales enteras. Calcularaproximadamente 30 l de cóctel de anticuerpo primario por sección transversal. </li><li> Para ver los pasos 2.7-2.13 garantizar una protección suficiente de la luz. luces de la sala se apagaron y bandejas cubiertas de tinción proporcionan una protección adecuada. Además, llenar la bandeja de tinción con el fluido en la parte inferior para proporcionar un ambiente húmedo durante la tinción y evitar el secado. </li><li> Aplicar anticuerpo primario (Tabla 1) cócteles a los portaobjetos durante 1 h en una bandeja de tinción húmedo en la temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos con PBS + 0,05% de Triton X durante 10 min y luego con nuevo PBST durante 5 min. </li><li> Diluir los anticuerpos secundarios en un cóctel de PBS + 0,05% de Triton X (PBST) + 10% de suero de cabra. Calcula 30 l de cóctel de anticuerpo primario por sección transversal. </li><li> Aplicar cóctel de anticuerpos secundarios a los portaobjetos durante 1 h. </li><li> Lavar los portaobjetos con PBS + 0,05% de Triton X (PBST) durante 10 min y con el nuevo PBST durante otros 5 min. </li><li> Aplicar un kit de tinción nuclear DAPI (preferiblemente lectura de usar soluciones) for 15 min o de acuerdo con las instrucciones del fabricante para teñir los núcleos celulares. </li><li> Lavar los portaobjetos brevemente con PBS + 0,05% de Triton X (PBST) durante 1 min. Después, dejar que se desliza brevemente al aire seco. </li><li> Aplicar medio de montaje fluorescente y cubreobjetos. Almacenar a 4 ° C protegido de la luz y realizar formación de imágenes de manera óptima dentro de 24-48 h. </li></ol> 3. Microscopía <ol><li> La carga se desliza dentro de escáner de diapositivas. Un máximo de 12 diapositivas es factible en función del escáner de diapositivas. </li><li> Iniciar un nuevo proyecto. Para la vista previa ajustar el canal de DAPI y la lente de 2.5X. Para el análisis detallado utilizar los canales DAPI, GFP, FITC y Cy5 y el objetivo 20X. El enfoque automático se adquiere a lo largo del proyecto en el canal de DAPI. </li><li> Utilice los siguientes colores para cada canal: -blue DAPI, FITC: verde, rojo de Texas: rojo, Cy5: amarillo. </li><li> Crear vistas previas de cada diapositiva utilizando el canal de DAPI. Para este fin, aplicar el enfoque manual en el primer espécimen y los usen durante la vista previaanálisis para adquirir imágenes de vista previa de cada espécimen. </li><li> Esquema de cada sección transversal que debe ser incluido en el proceso de adquisición detallada. No dibujar contornos cerca de los bordes de la muestra, para asegurar el subtítulo de toda el área de interés. </li><li> Establecer los tiempos de exposición para cada canal. En la mayoría de los casos, los parámetros de exposición de los diferentes canales son idénticos para todas las secciones transversales. </li><li> Ejecutar la adquisición automática de la imagen. Compruebe la adquisición correcta para el primer campo de puntos de vista, para evitar la adquisición incorrecta al principio del proceso automatizado. </li><li> Si es necesario, establecer un control remoto a través de reflejo de software de escritorio. Esto permite que el monitoreo remoto del proceso de adquisición de imágenes mediante la duplicación de la pantalla del ordenador del escáner de diapositivas a otro ordenador a través de cualquier red o conexión a Internet. Aunque, no se pueden hacer cambios a la configuración física con respecto a las diapositivas utilizadas, el entorno virtual del software de adquisición de imágenes permite el seguimiento de la<html> tiempos de enfoque o la exposición correcta de las imágenes. Además, el tiempo estimado para la finalización se puede comprobar con regularidad. </li><li> Después de la finalización de la adquisición de la imagen, controlar el enfoque automático correcto de todas las imágenes controlando manualmente si la arquitectura de las fibras, las fibras individuales y los diferentes tipos de fibras son distinguibles. </li><li> Volver a adquirir centrado incorrectamente áreas de imagen de campos individuales de vista o zonas enteras de interés. Para la readquisición de las áreas individuales, marcar áreas o imágenes a lo largo de todo el proyecto y readquirir las zonas con el enfoque manual. En la mayoría de los casos, un detalle adicional de la imagen en un nivel diferente enfoque conduce a las imágenes enfocadas de forma incorrecta </li><li> Para cada sección transversal que debe ser incluido en el análisis final, exportar cada canal (excluyendo DAPI) por separado como archivos JPEG. Nombrar y clasificar los archivos de acuerdo con los canales expuestos en carpetas con el nombre Texas Red, FITC y Cy5. </li></ol> 4. Análisis de fibra automatizada tienda &quot;&gt; NOTA: La macro se puede obtener de la siguiente página web: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/ <ol><li> Vista previa de cada imagen usando un software de edición de imágenes convencional antes de los análisis y comprobar si hay suficiente contraste entre las fibras de colores y fondo. Si es necesario, ajustar el contraste y el brillo para aumentar la diferencia, mediante comandos de ajuste de brillo y contraste. </li><li> ImageJ abierto o Fiji. Abra la macro utilizando el comando &quot;Plugins - Macros - Editar.&quot; Esto muestra el código fuente de las macros y permite la adaptación rápida de los parámetros. Si es necesario, cambie de directorio de carpetas para cada canal en el código fuente de la macro. NOTA: Los valores para los análisis de fibras musculares se basan en bíceps de rata y los músculos lumbricales, otras especies o los músculos pueden requerir valores diferentes. </li><li> Utilice el comando &quot;Ejecutar&quot; para iniciar la macro. Todas las imágenes de la carpeta ahora se cargan en la macro y cuantificados en un orden consecutivo. Los resultados son shown en una nueva ventana. Este paso puede tomar de segundos a varias horas, dependiendo de la cantidad de ser analizados los datos. </li><li> Exportar la ventana de resultados como un archivo de hoja de cálculo. Identificar valores para Cy5 contado positivamente (lento), FITC (intermedio) y fibras de Rojo Texas (FAST) y resumir para el número de fibras total. </li></ol>

<ol><li>Kung, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Unit+Changes+Seen+With+Skeletal+Muscle+Sarcopenia+in+Oldest+Old+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).</li>
<li>Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+muscle+fiber+clustering+in+the+diaphragm+muscle+of+sarcopenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice.</a> Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).</li>
<li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).</li>
<li>Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+Between+Muscle+Fiber+Type+and+Reactive+Balance%3A+A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mot+Behav%22%5BJournal%5D)">Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study.</a> J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).</li>
<li>Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+Muscle+Overuse+Causes+Bilateral+Changes+in+Muscle+Fiber+Composition+and+Vascular+Supply%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply.</a> PLoS ONE. 9 (12), 116455(2014).</li>
<li>Hopker, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+training+status%2C+age%2C+and+muscle+fiber+type+on+cycling+efficiency+and+endurance+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance.</a> J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).</li>
<li>Pette, D., Staron, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+isoforms%2C+muscle+fiber+types%2C+and+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions.</a> Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).</li>
<li>Suga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type-predominant+promoter+activity+in+lentiviral-mediated+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse.</a> PLoS One. 6 (3), 16908(2011).</li>
<li>Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+muscle+fiber+type+measurements+with+clinical+and+molecular+genetic+data+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).</li>
<li>Rader, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cleft+palate+repair+on+the+susceptibility+to+contraction-induced+injury+of+single+permeabilized+muscle+fibers+from+congenitally-clefted+goat+palates%5BTitle%5D)+AND+%22Cleft+Palate+Craniofac+J%22%5BJournal%5D)">Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates.</a> Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).</li>
<li>Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+type+II+muscle+fiber+damage+from+plyometric+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Athl+Train%22%5BJournal%5D)">Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise.</a> J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).</li>
<li>Lieber, R. L., Fridén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+skeletal+muscle+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of skeletal muscle architecture.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).</li>
<li>Schiaffino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibre+types+in+skeletal+muscle%3A+a+personal+account%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Fibre types in skeletal muscle: a personal account.</a> Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).</li>
<li>Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unloaded+shortening+velocity+and+myosin+heavy+chain+and+alkali+light+chain+isoform+composition+in+rat+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres.</a> J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+isoforms+in+mammalian+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle.</a> J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).</li>
<li>Larsson, L., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+velocity+of+shortening+in+relation+to+myosin+isoform+composition+in+single+fibres+from+human+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles.</a> J Physiol. 472, 595-614 (1993).</li>
<li>Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+methods+for+the+analysis+of+skeletal+muscle+fiber+size+and+metabolic+type%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).</li>
<li>Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieber%2C+RL+%22Skeletal+muscle+structure%2C+function%2C+and+plasticity%22">Skeletal muscle structure, function, and plasticity</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).</li>
<li>Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+muscle+fiber+typing+by+quantitative+enzyme+assays+and+by+myosin+ATPase+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining.</a> J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).</li>
<li>Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+typing+in+routinely+processed+skeletal+muscle+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies.</a> Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).</li>
<li>Likar, B., Pernuš, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+of+serial+transverse+sections+of+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Registration of serial transverse sections of muscle fibers.</a> Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fiber-type-specific+cross-sectional+area+assessment+and+myonuclei+counting+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle.</a> J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), 35273(2012).</li>
<li>Bergmeister, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+muscle+fiber+type+population+analysis+with+ImageJ+of+whole+rat+muscles+using+rapid+myosin+heavy+chain+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry.</a> Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+guidelines+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">FELASA guidelines and recommendations.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), e51586(2014).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+Guidelines+and+Recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Animal+Sci%22%5BJournal%5D)">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Ribarič, S., ČebaŠek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Visualization+of+Myosin+Heavy+Chain+Isoforms+in+Single+Muscle+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections.</a> Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<html> Aquí, demostramos una metodología ampliamente accesible para estudiar y cuantificar las poblaciones de fibras musculares de las secciones transversales de rata mediante inmunohistoquímica de una manera eficiente el tiempo de forma automática. Para la reproducibilidad, se presenta un detallado paso a paso la descripción y modificaciones potenciales para las aplicaciones en otras especies no descritas en este estudio. Además, se discuten las ventajas del procedimiento, los requisitos previos para un funcionamiento ó...

Composición del músculo esquelético sufre cambios profundos durante los procesos fisiológicos tales como el envejecimiento 1, 2, ejercicio 3, 4, 5, 6, 7, o procesos fisiopatológicos tales como la enfermedad 8, 9, 10 o trauma 11. Por lo tanto, varios campos de investigación se concentran en los efectos estructurales de estos procesos para entender los cambios funcionales. Uno de los aspectos clave que determinan la función muscular es la composición de las fibras musculares. Las fibras musculares expresan la cadena pesada de proteínas diferentes de miosina (MHC) y de ese modo se clasifican en fibras lentas, intermedio o rápido 7, 12, 13 </sup<html> &gt;, 14, 15, 16, 17. Fisiológicamente, los músculos tienen diferentes composiciones de fibra muscular dependiendo de su función en el cuerpo. Usando la tipificación de la fibra muscular, las poblaciones de fibra se pueden cuantificar para identificar adaptación a procesos fisiológicos o fisiopatológicos 7, 17. Históricamente, una serie de métodos que requieren mucho tiempo se han aplicado a diferenciar entre tipos de fibras musculares. Para este propósito, las fibras musculares se clasifican ya sea por la reactividad de la ATPasa de la miosina a diversos niveles de pH o actividad de la enzima muscular. Como diferentes calidades de fibra no pudieron evaluarse en una sola sección, se requieren múltiples secciones transversales para identificar todas las fibras musculares y permitir la cuantificación 14, 16, 17 manual,= &quot;xref&quot;&gt; 18, 19, 20, 21, 22. En contraste, las publicaciones recientes utilizan inmunohistoquímica (IHC) contra la proteína de la cadena pesada de la miosina para teñir rápidamente múltiples tipos de fibras en un solo secciones transversales. Sobre la base de las ventajas de este procedimiento, ahora se considera el estándar de oro en el análisis de población de las fibras musculares 19, 23, 24. El uso de protocolos de tinción IHC mejoradas, estábamos recientemente capaces de demostrar que la adquisición completamente automática de las secciones transversales de músculo entero y la posterior cuantificación de la fibra muscular automática es factible el uso de la plataforma ImageJ de código abierto. En comparación con la cuantificación manual, nuestro procedimiento proporcionado una disminución significativa en el tiempo (aproximadamente 10% de manual de análisis) requerida por diapositiva mientras que ser una precisión de ± 4% 25 </sarriba&gt;. El objetivo general de este método es el de describir una guía rápida, fiable, independiente del usuario a la cuantificación de la fibra muscular automática en músculos de rata enteros usando una plataforma de código abierto. Además, se describen las posibles modificaciones que permitan su uso para otros especímenes tales como ratones o los músculos humanos.

<table><tbody><tr><td>Compuesto O.C.T</td><td>Tissue-Tek, Sakura, Países Bajos</td><td></td><td>Para la incrustación de tejido muscular</td></tr><tr><td>Isopentano</td><td></td><td></td><td>para la congelación adecuada del tejido muscular</td></tr><tr><td>Portaobjetos Superfrost Ultra Plus</td><td>Thermo Scientific, Alemania</td><td>1014356190</td><td>portaobjetos adhesivos</td></tr> solución <tr><td>salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific, Alemania</td><td>85112</td><td>Detergente Soluation</td></tr><tr><td>Serum</td><td>de cabra Thermo Scientific, Alemania</td><td>50197Z</td><td>Suero</td></tr><tr><td>de cabra DAKO Medio de montaje fluorescente</td><td>Dako Denmark</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Dako</td><td>bolígrafo Dako Dinamarca</td><td>S200230-2</td><td></td></tr><tr><td>TissueFAXSi plus</td><td>TissueGnostics, Viena, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td><Anticuerpos primarios fuertes> </></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fuerteMHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)</td><td>Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB, Iowa, EE. UU.)</td><td></td> <td>Supernadante</td></tr><tr><td>MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)</td><td>Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB, Iowa, EE. UU.)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MHC-IIb sobrenadante (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)</td><td>Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo (DSHB, Iowa, EE. UU.)</td><td></td><td>Anticuerpos sobrenadantes</td></tr><tr><td><fuertes>secundarios</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa&nbsp; Fluor&nbsp; 633 y nbsp; Cabra Anti-Ratón IgG2b&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Alemania</td><td>A-21146</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Ratón IgG1&nbsp;( y gamma; 1)</td> <td>Thermo Scientific, Alemania</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Cabra Anti-Ratón IgM (&micro; cadena)</td><td>Thermo Scientific, Alemania</td><td>A-21426</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Célula fija ReadyProbes Reactivo</td><td>Thermo Scientific, Alemania</td><td>R37606</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo automatizado rápido de fibra análisis población en músculo de rata secciones representativas uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

La cuantificación de las poblaciones de fibras musculares proporciona una visión más profunda de los efectos de la enfermedad, trauma, y ​​varias otras influencias sobre la composición de músculo esquelético. Varios métodos que requieren mucho tiempo se han utilizado tradicionalmente para estudiar las poblaciones de fibra en muchos campos de la investigación. Sin embargo, recientemente desarrollado métodos inmunohistoquímicos sobre la base de la miosina expresión de la proteína de cadena pesada de proporcionar una alternativa rápida para identificar múltiples tipos de fibra en una sola sección. A continuación, se presenta un protocolo rápido, fiable y reproducible para mejorar la calidad de la tinción, lo que permite la adquisición automática de las secciones transversales integrales y cuantificación automática de las poblaciones de fibra con ImageJ. Para este propósito, los músculos esqueléticos incrustadas se cortan en secciones transversales, teñidas utilizando miosina anticuerpos cadenas pesadas con anticuerpos fluorescentes secundarias y DAPI para la tinción de núcleos de células. secciones transversales enteras se escaneados automáticamente usando un escáner de diapositivas para obtener de alta resolución compuestoimágenes de la muestra completa. análisis de población de fibra se llevan a cabo posteriormente para cuantificar fibras lentas, intermedias y rápidas utilizando una macro automatizado para ImageJ. Hemos demostrado anteriormente que este método puede identificar poblaciones de fibra de forma fiable a un grado de ± 4%. Además, este método reduce la variabilidad inter-usuario y la hora por los análisis significativamente utilizando la plataforma ImageJ de código abierto.

músculo de rata entero secciones transversales se tiñeron rápidamente usando inmunohistoquímica para identificar MHC I, IIA y IIB fibras musculares. El uso de un escáner de portaobjetos de microscopio fluorescente, las secciones transversales enteras fueron entonces adquieren automáticamente para fibra muscular automatizado análisis con ImageJ. El concepto del procedimiento se basa en proporcionar un flujo de trabajo sencillo, fiable y eficiente en el tiempo para la cuantificación de las...

Aquí, se presenta un protocolo para análisis rápido de la fibra muscular, lo que permite mejorar la calidad de la tinción, y la adquisición de ese modo automático y la cuantificación de las poblaciones de fibra utilizando el ImageJ software disponible libremente.

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

El objetivo general de este método es guiar de forma rápida y confiable la cuantificación de fibras musculares en músculos completos de rata de manera automática e independiente del usuario, utilizando una plataforma de código abierto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo neuromuscular sobre defectos provocados por el envejecimiento, enfermedades o traumatismos en los músculos esqueléticos. La principal ventaja de esta técnica es que puede utilizarse para analizar de manera confiable las poblaciones de fibras musculares y generar imágenes de alta calidad de secciones transversales musculares.Después de un descongelamiento adecuado, enjuague cuidadosamente los especímenes en PBS suplementado con Triton X, o PBST, realizando un lavado de 10 minutos y otro de cinco minutos. Después del segundo lavado, seque al aire las secciones durante dos minutos. Luego, utilice un bolígrafo hidrófobo para delimitar los cortes transversales individuales.Después de otros 15 minutos de secado al aire, bloquee cualquier unión inespecífica con PBST suplementado con suero de cabra durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lave las laminillas y añada la mezcla ad

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Marinello, M., et al. Caracterización de uniones neuromusculares en ratones mediante microscopía confocal y de superresolución combinada. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra la preparación, inmunotinción e imágenes de uniones neuromusculares en tejido muscular de rata utilizando microscopía confocal y de superresolución para visualizar y analizar estructuras presinápticas y postsinápticas.

Caracterización de uniones neuromusculares en ratones mediante microscopía confocal y de superresolución combinada

Describimos una nueva técnica experimental que llamamos mínimamente invasiva del músculo incrustación (MIME), que se basa en la evidencia que el tejido muscular esquelético contiene células viables miógenas que pueden facilitar la miogénesis mediada por células de donantes cuando están implantados en un músculo de host.

Mínimamente invasiva músculo incrustación (MIME) - una nueva técnica Experimental para facilitar la miogénesis mediada por células de donantes

La coloración de Immunohistochemical de las isoformas de cadena pesada de miosina ha surgido como discriminador de estado de la técnica del tipo de fibra del músculo esquelético (es decir, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aquí, presentamos un protocolo de tinción junto con un algoritmo novela semi-automatizado que facilita la rápida evaluación de la morfología del tipo de fibra y fibra.

Análisis semi-automatizado de fibra tipo composición y morfología del músculo esquelético de ratón

La capacidad de detectar con precisión los componentes de la unión neuromuscular es crucial en la evaluación de modificaciones en su arquitectura debido a procesos patológicos o de desarrollo. Aquí presentamos una descripción completa de un método sencillo para obtener imágenes de alta calidad de uniones neuromusculares de montaje completo que se pueden utilizar para realizar mediciones cuantitativas.

Disección De Fibras Musculares Esqueléticas Individuales Para Análisis Inmunofluorescentes Y Morfométricos De Las Uniones Neuromusculares De Montaje Completo

Este protocolo describe un método para el análisis morfométrico de uniones neuromusculares mediante microscopía combinada confocal y STED que se utiliza para cuantificar cambios patológicos en modelos de ratón de SMA y CMS relacionados con ColQ.

Caracterización de uniones neuromusculares en ratones mediante microscopía combinada confocal y de superresolución

La creciente evidencia indica que la infiltración excesiva de lípidos dentro del músculo esquelético resulta en lipotoxicidad y diabetes. Aquí, presentamos un protocolo completo, que incluye procesamiento de tejidos, tinción con Bodipy, adquisición de imágenes y análisis, para cuantificar el tamaño, la densidad y la distribución subcelular de las gotas lipídicas de una manera específica de tipo de fibra.

Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

El protocolo muestra un método para examinar la correlación espacial entre los terminales presinápticos, los receptores postsinápticos y las células de Schwann perisinápticas en el músculo gastrocnemio medial de la rata utilizando inmunohistoquímica fluorescente con diferentes biomarcadores, a saber, neurofilamento 200, transportador vesicular de acetilcolina, alfa-bungarotoxina y S100.

Visualización de las características morfológicas de la unión neuromuscular en el músculo gastrocnemio medial de rata

Aquí, presentamos un protocolo para analizar los cambios en la densidad mitocondrial y la distribución longitudinal mediante imágenes de músculo esquelético vivo utilizando microscopía confocal para el escaneo de redes mitocondriales.

Análisis de la densidad mitocondrial y la distribución longitudinal en fibras musculares vivas de rata mediante microscopía confocal

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

Este protocolo describe el aislamiento de fibras musculares individuales intactas del sóleo oxidativo y el establecimiento de cultivos de mioblast altamente purificados derivados de estas fibras. El procedimiento optimizado proporciona de forma fiable aproximadamente 300–500 miofibras intactas por ratón, permitiendo análisis moleculares y celulares posteriores.

Ensayo de aislamiento de fibra única para la evaluación del comportamiento oxidativo de miofibras

Aprende a cuantificar automáticamente poblaciones de fibras musculares en secciones completas de músculo de rata mediante inmunohistoquímica de cadenas pesadas de miosina y análisis de imágenes con ImageJ. Este protocolo reduce el tiempo de análisis y la variabilidad entre usuarios.

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica (Video) | JoVE Journal

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

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