Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

El objetivo general de este método es guiar de forma rápida y confiable la cuantificación de fibras musculares en músculos completos de rata de manera automática e independiente del usuario, utilizando una plataforma de código abierto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo neuromuscular sobre defectos provocados por el envejecimiento, enfermedades o traumatismos en los músculos esqueléticos. La principal ventaja de esta técnica es que puede utilizarse para analizar de manera confiable las poblaciones de fibras musculares y generar imágenes de alta calidad de secciones transversales musculares.

Después de un descongelamiento adecuado, enjuague cuidadosamente los especímenes en PBS suplementado con Triton X, o PBST, realizando un lavado de 10 minutos y otro de cinco minutos. Después del segundo lavado, seque al aire las secciones durante dos minutos. Luego, utilice un bolígrafo hidrófobo para delimitar los cortes transversales individuales.

Después de otros 15 minutos de secado al aire, bloquee cualquier unión inespecífica con PBST suplementado con suero de cabra durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lave las laminillas y añada la mezcla adecuada de anticuerpos primarios a cada muestra para una tinción de una hora a temperatura ambiente protegida de la luz. Al final de la incubación, enjuague las laminillas con un lavado de 10 minutos y otro de cinco minutos con PBST.

Luego, marque las secciones musculares con el cóctel adecuado de anticuerpos secundarios durante una hora protegidas de la luz. Después de lavar las laminillas dos veces en PBST, como se ha demostrado, séquelas y luego tiña los núcleos con un kit de tinción nuclear DAPI según las instrucciones del fabricante. Elimine el exceso de DAPI mediante un lavado de un minuto con PBST, seguido de un breve secado al aire.

Luego, cubra las muestras con medio de montaje fluorescente y cubreobjetos, y almacene los portaobjetos a cuatro grados Celsius protegidos de la luz. Entre 24 y 48 horas después de la tinción, cargue los portaobjetos en un escáner de diapositivas y abra un nuevo proyecto en el software del programa. Para la vista previa del portaobjeto, seleccione el canal DAPI y el objetivo de 2,5x, y enfoque manualmente el primer espécimen.

Delinee cada corte transversal que debe incluirse para el proceso detallado de adquisición y establezca los tiempos de exposición para cada canal. A continuación, ejecute la adquisición automática de imágenes, verificando la correcta adquisición del primer campo de visión, para evitar una adquisición incorrecta al inicio del proceso automatizado. Cuando la adquisición de imágenes haya finalizado, revise manualmente que el enfoque automático de los cortes transversales sea correcto y que las fibras individuales sean claramente distinguibles.

Es fundamental que el enfoque automático se verifique y corrija manualmente para cada imagen según sea necesario. El proceso automatizado de cuantificación de fibras musculares requiere imágenes de alta calidad para obtener resultados óptimos. Luego, para cada sección transversal que deba incluirse en los análisis finales, exporte cada canal excepto DAPI por separado como archivos JPEG, y nombre y organice los archivos en carpetas debidamente etiquetadas de acuerdo con los canales expuestos.

Antes de comenzar el proceso de cuantificación de fibras musculares, revise cada imagen en el software de edición de imágenes adecuado para confirmar un contraste suficiente entre las fibras teñidas y el fondo. A continuación, en ImageJ, utilice el comando Complementos>Macros>Editar para mostrar el código fuente del macro y cambie el directorio de carpetas para cada canal en el código fuente del macro. Ahora, use el comando Ejecutar para iniciar el macro.

Todas las imágenes de la carpeta se cargarán en la macro y se cuantificarán en orden consecutivo. Al final de la cuantificación, exporte los resultados al software de hoja de cálculo adecuado e identifique los valores de las fibras lentas, intermedias y rápidas contadas positivamente. Luego se puede calcular el número total de fibras.

La tinción por inmunofluorescencia de las fibras musculares es rápida y presenta poca reactividad cruzada, y las imágenes resultantes muestran un alto contraste entre las fibras teñidas y el tejido circundante, así como una clara distinción entre los diferentes tipos de fibras. El análisis automático permite la detección de las poblaciones relativas de fibras musculares con una precisión de más o menos 4 % en comparación con el análisis manual, siendo los recuentos absolutos totales más altos en comparación con el análisis manual. Sin embargo, los recuentos relativos permanecen similares, dentro de un rango de más o menos 4 %.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar este método para automatizar la cuantificación de fibras musculares. No olvide que trabajar con DAPI puede ser peligroso. Por lo tanto, use el equipo de protección adecuado mientras realiza la tinción.