Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

El objetivo general de este procedimiento es aislar y caracterizar eficazmente los macrófagos de los tejidos comúnmente afectados por la inflamación inducida por la dieta, como el hígado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología y la inflamación sobre cómo el fenotipo de los macrófagos residentes en los tejidos puede dictar la progresión de las enfermedades inflamatorias crónicas. La principal ventaja de esto es que el procedimiento optimiza los pasos de aislamiento necesarios para obtener suspensiones unicelulares derivadas de tejidos impactados por inflamación crónica de bajo grado mediada por la obesidad.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Joselyn Allen, una estudiante graduada de mi laboratorio. Para aislar el hígado, primero coloque un ratón empapado en etanol en posición supina sobre una tabla de disección de espuma de poliestireno y asegure las patas delanteras y traseras. A continuación, use una pinza de punta media para agarrar la piel abdominal cerca de la abertura de la uretra y use tijeras de disección afiladas para crear una pequeña incisión en la piel elevada.

Inserte la hoja inferior de las tijeras en la incisión entre la piel y el peritoneo y haga una incisión lateral desde la ingle hasta el mentón. Tire suavemente de la piel hacia atrás para exponer la cavidad peritoneal y la pared torácica intactas y haga una incisión lateral a través del peritoneo. Levante el esternón y haga una incisión con cuidado en el diafragma.

A continuación, mueva los órganos gastrointestinales hacia un lado y localice la vena cava inferior subhepática o IVC. Con pinzas hemostáticas, pinza la VCI suprahepática para mantener una perfusión localizada y conecte una jeringa llena de tampón de perfusión precalentado a un equipo de infusión y recolección de sangre de calibre 23. Presione suavemente el émbolo hasta que el tubo y la aguja se llenen con tampón de perfusión e inserte la aguja paralelamente a la VCI subhepática.

La canulación adecuada de la VCI asegura que el tampón de disociación se distribuya localmente por todo el hígado y los tejidos periféricos, optimizando la digestión de los tejidos. Use una pinza hemostática de cuatro centímetros para asegurar la aguja en su lugar y presione suavemente el émbolo para comenzar la perfusión. Si la aguja está colocada correctamente, el color se eliminará rápidamente del hígado y los lóbulos se agrandarán.

Cortar rápidamente la vena porta para permitir que el tampón de perfusión fluya libremente a través del hígado, masajeando ocasionalmente suavemente los lóbulos entre el pulgar y el índice para facilitar la extracción de la sangre. Cuando solo queden cinco mililitros de tampón de perfusión, reemplace la jeringa del tampón de perfusión con una jeringa llena de tampón de disociación precalentado, continuando masajeando suavemente los lóbulos y perfundiendo el hígado hasta que esté completamente digerido. Confirme una digestión exitosa presionando suavemente el borde romo de un par de pinzas en el lóbulo lateral izquierdo.

Debe aparecer una hendidura en la superficie que se llena lentamente una vez que se retira la pinza. Luego, retire la aguja y use una hoja corta y recta de un par de tijeras de disección para cortar cuidadosamente los ligamentos de conexión para extirpar todo el hígado y la vesícula biliar. Transfiera el hígado a un plato de 10 centímetros que contenga 10 mililitros de DMEM helado y use pinzas dentadas para agarrar la VCI suprahepática cortada.

Con pinzas de punto medio, aplique un movimiento rápido de caricias a cada lóbulo para liberar las células de la cápsula de Glisson y pase el DMEM saturado a través de un filtro de células de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Los altos rendimientos de células viables solo se pueden lograr disociando adecuadamente las células hepáticas de la cápsula de Glisson. Cuando se hayan recogido todas las células, invierta el tubo para mezclar suavemente la suspensión celular y pellet las células por centrifugación.

Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros para tres centrifugaciones más de bajo espín. Después de la última centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros y centrifugue las células una vez más a una velocidad más alta. A continuación, vuelva a suspender el gránulo de células no parenquimatosas en el tampón FACS para el recuento y diluya las células hepáticas hasta la concentración adecuada de acuerdo con su aplicación posterior en tubos de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros marcados.

Los ratones alimentados con una dieta alta en grasas o una dieta alta en grasas y alta en colesterol exhiben una mayor infiltración de macrófagos M1 activados clásicamente en los tejidos afectados, como la aorta. El receptor RON que expresa el receptor RON aórtico CD45 positivo, los macrófagos F4/80 positivos que demuestran un fenotipo antiinflamatorio disminuyen en los ratones alimentados con dieta alta en grasas y colesterol, mientras que los macrófagos proinflamatorios CD45 positivos F4/80 positivos y CD11c positivos se encuentran en mayor número en las aortas aisladas de estos animales. Además, los receptores RON clasificados que expresan macrófagos derivados de aortas digeridas muestran una mayor expresión del gen de la arginasa 1, un marcador de macrófagos M2 bien establecido.

De hecho, la caracterización de los macrófagos residentes en el hígado revela el fenotipo predominante de las subpoblaciones que expresan el receptor RON con poblaciones de macrófagos proinflamatorios CD11c positivas que demuestran una disminución de la expresión de genes que están fuertemente asociados con el fenotipo M2 antiinflamatorio. Se observan tendencias similares en las poblaciones de macrófagos aisladas del tejido adiposo blanco digerido, con poblaciones de macrófagos de fenotipo proinflamatorio que exhiben una disminución de la expresión superficial del receptor RON. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 20 a 30 minutos por animal si se realiza correctamente.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la citometría de flujo, la clasificación de células activadas por fluorescencia y/o la PCR cuantitativa para caracterizar aún más el fenotipo de los macrófagos residentes en el tejido derivado del hígado aislados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar correctamente los macrófagos residentes en el tejido de los hígados enfermos. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.