Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad
3 de abril de 2017
Este protocolo permite un investigador aislar y caracterizar tejido residente macrófagos en varios sello inflamado los tejidos extraídos de modelos inducida por la dieta de los trastornos metabólicos.
El objetivo general de este procedimiento es aislar y caracterizar eficazmente macrófagos de tejidos comúnmente afectados por inflamación inducida por la dieta, como el hígado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología y la inflamación sobre cómo el fenotipo de los macrófagos residentes en el tejido puede determinar la progresión de enfermedades inflamatorias crónicas. La principal ventaja de este enfoque es que el procedimiento optimiza los pasos de aislamiento necesarios para obtener suspensiones de células individuales derivadas de tejidos afectados por inflamación crónica de bajo grado mediada por la obesidad.
La procedura será demostrada por Joselyn Allen, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para aislar el hígado, primero coloque un ratón empapado en etanol en posición supina sobre una tabla de disección de espuma de poliestireno y sujete las patas delanteras y traseras. A continuación, use una pinza de punta mediana para agarrar la piel abdominal cerca de la abertura de la uretra y utilice tijeras de disección afiladas para hacer una pequeña incisión en la piel levantada.
Introduzca la hoja inferior de las tijeras en la incisión entre la piel y el peritoneo y realice una incisión lateral desde la ingle hasta el mentón. Tire suavemente de la piel hacia atrás para exponer la cavidad peritoneal intacta y la pared torácica, y haga una incisión lateral a través del peritoneo. Levante el esternón y corte cuidadosamente el diafragma.
Luego mueva los órganos gastrointestinales hacia un lado y localice la vena cava inferior subhepática o VCI. Utilizando pinzas hemostáticas, ocluya la VCI suprahepática para mantener una perfusión localizada y conecte una jeringa llena de tampón de perfusión precalentado a un conjunto de recolección e infusión sanguínea de calibre 23. Presione suavemente el émbolo hasta que la tubería y la aguja se llenen con el tampón de perfusión e inserte la aguja en paralelo a la vena cava inferior subhepática.
La canulación adecuada de la vena cava inferior garantiza que el tampón de disociación se distribuya localmente a través del hígado y los tejidos periféricos, optimizando la digestión del tejido. Utilice una pinza hemostática de cuatro centímetros para asegurar la aguja en su lugar y presione suavemente el émbolo para comenzar la perfusión. Si la aguja está correctamente posicionada, el color desaparecerá rápidamente del hígado y los lóbulos se agrandarán.
Corte inmediatamente la vena porta para permitir que el tampón de perfusión fluya libremente a través del hígado, masajeando ocasionalmente los lóbulos suavemente entre el pulgar y el índice para facilitar la eliminación de la sangre. Cuando queden solo cinco mililitros de tampón de perfusión, sustituya la jeringa de tampón de perfusión por una jeringa llena de tampón de disociación precalentado, continuando con el suave masaje de los lóbulos y la perfusión del hígado hasta que esté completamente digerido. Confirme una digestión exitosa presionando suavemente el borde romo de un par de pinzas en el lóbulo lateral izquierdo.
Debe aparecer una indentación en la superficie que se llenará lentamente una vez que se retire la pinza. Luego, retire la aguja y use una hoja recta corta de un par de tijeras de disección para cortar cuidadosamente los ligamentos conectores y extirpar todo el hígado y la vesícula biliar. Transfiera el hígado a una placa de 10 centímetros que contenga 10 mililitros de DMEM frío con hielo y use pinzas dentadas para sujetar la VCI suprahepática seccionada.
Utilizando pinzas de punta mediana, aplique un movimiento rápido de frotación a cada lóbulo para liberar las células de la cápsula de Glisson y pase el DMEM saturado a través de un filtro celular de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Solo se pueden obtener altos rendimientos de células viables disociando adecuadamente las células hepáticas de la cápsula de Glisson. Una vez recolectadas todas las células, invierta el tubo para mezclar suavemente la suspensión celular y pelete las células mediante centrifugación.
Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros para tres centrifugaciones adicionales de baja velocidad. Después de la última centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros y centrifugue las células una vez más a mayor velocidad. Luego, resuspenda el sedimento de células no parenquimatosas en tampón FACS para su conteo y diluya las células hepáticas a la concentración adecuada según su aplicación posterior en tubos de poliestireno redondos etiquetados de cinco mililitros.
Los ratones alimentados con una dieta alta en grasas o con una dieta alta en grasas y colesterol muestran una infiltración aumentada de macrófagos M1 clásicamente activados en tejidos afectados, como la aorta. Los macrófagos aórticos positivos para CD45 y F4/80 que expresan el receptor RON, los cuales presentan un fenotipo antiinflamatorio, se reducen en ratones alimentados con una dieta alta en grasas y colesterol, mientras que los macrófagos proinflamatorios positivos para CD45, F4/80 y CD11c se encuentran en números aumentados en aortas aisladas de estos animales. Además, los macrófagos expresantes del receptor RON, aislados mediante clasificación a partir de aortas digeridas, muestran una expresión aumentada del gen Arginasa 1, un marcador bien establecido de macrófagos M2.
De hecho, la caracterización de los macrófagos residentes en el hígado revela el fenotipo predominante de subpoblaciones que expresan el receptor RON, con poblaciones de macrófagos proinflamatorios positivos para CD11c que muestran una expresión disminuida de genes fuertemente asociados con el fenotipo antiinflamatorio M2. Se observan tendencias similares en las poblaciones de macrófagos aisladas del tejido adiposo blanco digerido, donde las poblaciones de macrófagos con fenotipo proinflamatorio exhiben una expresión superficial reducida del receptor RON. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en 20 a 30 minutos por animal si se realiza adecuadamente.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como citometría de flujo, clasificación fluorescente de células activadas y/o PCR cuantitativa para caracterizar más a fondo el fenotipo de los macrófagos residentes en el tejido hepático aislados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar adecuadamente macrófagos residentes en el tejido a partir de hígados enfermos. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este protocolo permite a los investigadores aislar y caracterizar macrófagos residentes en tejidos a partir de tejidos inflamados afectados por trastornos metabólicos inducidos por la dieta. El método se centra en optimizar los pasos de aislamiento para obtener suspensiones de células individuales a partir de tejidos afectados por inflamación mediada por la obesidad.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Inflamación
- Trastornos metabólicos
Antecedentes
- Los macrófagos residentes en tejidos desempeñan un papel crucial en las enfermedades inflamatorias crónicas.
- La inflamación inducida por la dieta afecta diversos tejidos, particularmente el hígado.
- Comprender los fenotipos de los macrófagos puede orientar las estrategias de tratamiento.
- Este protocolo mejora la eficiencia del aislamiento de macrófagos para la investigación.
Objetivo del estudio
- Aislar y caracterizar macrófagos de tejidos inflamados.
- Investigar el papel de los macrófagos en la inflamación crónica.
- Proporcionar un método confiable para obtener suspensiones de células individuales.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de tejido hepático a partir de modelos inducidos por dieta.
- Uso de ratones expuestos al etanol para la extracción de tejido.
- Técnicas de disección para obtener muestras de tejido.
- Caracterización de fenotipos de macrófagos tras el aislamiento.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de macrófagos a partir de tejidos hepáticos.
- Caracterización de fenotipos de macrófagos asociados a la inflamación.
- El protocolo optimizado mejora la eficiencia del aislamiento celular.
- Información sobre el papel de los macrófagos en trastornos metabólicos.
Conclusiones
- El protocolo es efectivo para estudiar macrófagos residentes en tejidos.
- Los hallazgos contribuyen a comprender las enfermedades inflamatorias crónicas.
- La investigación futura puede basarse en esta metodología para obtener mayores conocimientos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La heterogeneidad de los macrófagos en la inflamación inducida por la obesidad es un determinante crítico de la progresión de la enfermedad y del enfoque terapéutico en trastornos metabólicos y cardiovasculares. Este protocolo permite el aislamiento robusto y la caracterización fenotípica de macrófagos residentes en tejidos procedentes del hígado inflamado, la aorta y el tejido adiposo, lo que respalda la confianza predictiva en la fase inicial del descubrimiento y la validación de dianas. El acceso confiable a poblaciones celulares inmunitarias bien caracterizadas mejora la continuidad traslacional y reduce los riesgos de las hipótesis mecanicistas a lo largo del proceso de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación de las vías inflamatorias impulsadas por macrófagos en tejidos relevantes para la enfermedad.
- Apoya la validación funcional de dianas al distinguir los fenotipos de macrófagos proinflamatorios y antiinflamatorios.
- Facilita la reducción del riesgo mecanicista mediante el análisis fenotípico cuantitativo de subpoblaciones de células inmunitarias.
- Mejora la confianza predictiva para la selección de carteras en indicaciones metabólicas y cardiovasculares.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona suspensiones estandarizadas de células individuales para flujos de trabajo posteriores de citometría de flujo y FACS.
- Asegura la reproducibilidad y la obtención de resultados cuantitativos en ensayos de perfilado de células inmunitarias.
- Permite la preparación escalable de sistemas biológicos validados para la selección de compuestos.
- Facilita la evaluación confiable de agentes inmunomoduladores en contextos relevantes para la enfermedad.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea la fenotipificación de macrófagos con estrategias traslacionales de biomarcadores en modelos de enfermedades metabólicas.
- Mantiene la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de dianas inmunitarias.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de fenotipos celulares con la progresión de la enfermedad.
- Reduce el riesgo en modelos preclínicos al permitir una caracterización precisa de las células inmunitarias.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo se integra en la interfaz entre el descubrimiento inicial y la investigación preclínica, permitiendo una transición fluida desde la verificación de hipótesis hasta la identificación de compuestos prometedores y la validación traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya el análisis basado en hipótesis de la función de los macrófagos en tejidos inflamados.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de células inmunitarias para el desarrollo de ensayos.
- Análisis: Ofrece datos de citometría de flujo y expresión génica para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta los fenotipos de las células inmunitarias con estrategias preclínicas de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo reutilizable para el aislamiento de células inmunitarias en modelos de enfermedades metabólicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas inmunitarias.
- Valor operativo: Estandariza y agiliza el aislamiento de células inmunitarias para flujos de trabajo de I+D escalables.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance/no avance y una gestión eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos inmuno-moduladores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección de tejidos, digestión enzimática y análisis de citometría de flujo.
- Exige acceso a instrumentación de FACS y capacidades de PCR cuantitativa para la caracterización posterior.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de aislamiento y tinción para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a múltiples tipos de tejidos inflamados, incluyendo hígado, aorta y tejido adiposo.
- Depende de un diagnóstico cuidadoso para optimizar el rendimiento y viabilidad celular a partir de tejidos densos o fibrosos.
