Name: Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprende a aislar y caracterizar macrófagos residentes en tejidos afectados por inflamación relacionada con la obesidad. Este protocolo optimiza la obtención de suspensiones unicelulares del hígado para estudiar fenotipos inmunológicos.

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Nos gustaría dar las gracias a las instalaciones centrales para citometría de flujo en el Pennsylvania estado Universidad Milenio ciencia compleja.

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Los autores no tienen ningún conflicto de intereses a revelar.

Modelos de trastorno metabólico inducido por la dieta que imitan comorbilidades tales como ateroesclerosis, esteatosis simple, esteatohepatitis y diabetes tipo 2 se utilizan extensivamente para entender mejor los mecanismos moleculares subyacentes de progresión de la enfermedad. Digestión depende de la colagenasa a menudo se utiliza para disociar los tejidos para liberar las células de la matriz extracelular (ECM)16,27. Enzimas como la colagenasa interrumpen colá...

Modelos de ratón se han utilizado para estudiar la dinámica de enfermedades humanas. Correcto aislamiento de las células residentes del tejido de los ratones en un estado enfermo puede proporcionar una plataforma para la comprensión de las contribuciones moleculares y celulares en la patogenia de una enfermedad1. Un trastorno que es de vital importancia es la obesidad. La incidencia de la obesidad sigue aumentando en todo el mundo en paralelo con la resistencia a la insulina y tipo 2 mellitus de la diabetes, enfermedad cardiovascular y enfermedad del hígado graso2,3. Consumo excesivo de nutrientes es más sesgado por disminución de la actividad física provocando señales alteradas provenientes del tejido adiposo, que puede alterar el medio celular de otros tejidos periféricos como el hígado y aorta4. Tal interrupción de la homeostasis metabólica resulta en una inflamación sistémica crónica de bajo grado del5.
Activación clásica del residente a la aorta y el hígado, así como su contratación al tejido adiposo blanco (WAT) de macrófagos ha demostrado no sólo iniciar el dysregulation de señales metabólicas sino también sostener la inflamación6,7. La heterogeneidad fenotípica y funcional de los macrófagos está fuertemente asociada con la patogénesis de la obesidad relacionada con comorbilidades7. La plasticidad dinámica de polarización macrófagos permite para que estas células exhiben una variedad de fenotipos activados que coordinan la progresión y resolución de8de la inflamación. Mientras que clásico activados macrófagos (M1) están implicados en la propagación de la inflamación, macrófagos alternativamente activados (M2) se han asociado con resolución y el tejido de reparación9,10.
Como el cuerpo somete a estrés metabólico, tejido adiposo blanco se acumula anormalmente. El tejido adiposo ampliado atrae y retiene las células inflamatorias que alteran profundamente la función del adipocito normal para promover la resistencia a la insulina, hiperglucemia y diabetes mellitus tipo 2 en última instancia, resistencia a la insulina o hiperglucemia11, 12. En paralelo, remodelaciones de tejido adiposo blanco en respuesta a señales inflamatorias por infiltran clásico activado macrófagos (cajeros automáticos) de tejido adiposo (M1) de13,14. Este órgano multicelular ejerce una cascada de señales que hace descarrilar la función normal de otros órganos del cuerpo tales como la aorta y el hígado4.
El hígado es una potencia metabólica que se adapta en respuesta a estímulos procedentes de cerca dysregulated WAT15. Macrófagos hepáticos o células de Kupffer, en respuesta a cambios metabólicos, secretan citoquinas inflamatorias que transforman tanto parénquima y fenotipo de la célula no parenquimales y promoción la remodelación tisular. Acumulación de lípidos hepáticos, inflamación, depósitos de matriz extracelular excesivo, necrosis y función eventual pérdida sigue los insultos inflamatorios contribuyendo a la amplia gama de daño hepático asociados con enfermedad del hígado graso no alcohólico 1617,de,18.
En paralelo a WAT comprometido y función hepática, arterias grandes acumulan lípidos dentro de la pared arterial como el cuerpo somete a estrés metabólico crónico19. Acumulación lipídica arterial desencadena la secreción de quimioquinas por las células endoteliales activadas y posterior reclutamiento de monocitos20. Una vez reclutados, monocitos proliferan, diferencian, ingieren las lipoproteínas y se convierten en células espumosas. Aterogénesis es iniciada y sostenida por la actividad proinflamatoria de reclutados y macrófagos cargados de lípidos residente de tejido. Sucumbir a las señales de estrés extracelular e intracelular transmitidas en este microambiente aterogénico, estos macrófagos participan luego en una cascada de señalización de apoptosis. Como estas células espumosas mueren, contribuyen a su contenido de lípidos que llena a la base necrótica de la lesión, que entonces conduce a ruptura de placa, infarto de miocardio y accidente cerebrovascular.
Colectivamente, la heterogeneidad de los fenotipos de macrófagos organiza en parte la obesidad inducida por cambios inflamatorios en los tejidos normales como WAT, hígado y aorta8,21. Caracterización de reclutados y macrófagos residentes pueden proporcionar la penetración en posibles dianas moleculares que manipulan macrófago fenotipo1. Para caracterizar eficazmente los macrófagos de los tejidos inflamados inducida por la obesidad, una suspensión unicelular se puede obtener a través de la digestión enzimática. Tales protocolos de disociación deben ser eficaces en degradar suficientemente tejido conectivo mientras que minimiza la muerte celular inmune y proporciona rendimiento óptimo de la célula. La mezcla de la enzima es dependiente en el tipo de tejido y su maquillaje estructural. Tejidos resistentes como la aorta requiere mayor actividad enzimática, en comparación con el hígado y el WAT, para lograr la disociación del tejido. De la suspensión de la célula, macrófagos residentes pueden ser inequívocamente caracterizados o aislados para mayores análisis aguas abajo como perfilamiento transcripcional.
Aquí se describe un protocolo específico de tejido que utiliza tejido dependiente de colagenasa digestión y citometría de flujo policromáticos efectivamente aislar y caracterizar macrófagos residentes de tejido obtenidos de la dieta tradicional inducida por obesidad, ateroesclerosis, esteatosis simple y esteatohepatitis modelos de ratón. Simultánea de marcadores de superficie celular con anticuerpos contra leucocitos (CD45 o CD11b) y macrófagos - antígenos específicos (F4/80) es de uso frecuente para identificar a las poblaciones de macrófagos22. Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación es una estrategia poderosa que se utiliza para ordenar estas poblaciones identificadas en alta pureza. La población clasificada puede evaluarse entonces perfiles de gen específico fenotipo mediante análisis molecular aguas abajo (por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa cuantitativo en tiempo real)23. Aunque citometría de flujo estándar y clasificación de celda basados en citometría de flujo son herramientas poderosas en la distinción de macrófagos dentro de una suspensión sumamente heterogéneos, los protocolos anteriores deben optimizarse para asegurar la salida exitosa. En este estudio, se describen los protocolos que efectivamente aislaran y caracterizan los macrófagos específicos de tejido viable; más importante aún, este estudio proporciona penetración crucial en cuestiones técnicas que a menudo se presentan, así como de estrategias proactivas y solución de problemas para evitar o resolver.

<table><tbody><tr><td>26 G x 5/8 pulgadas Agujas</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 0,75 pulgadas aguja x 12 pulgadas Tubo Set de extracción de sangre</td><td>BD 367297</td><td></td><td>Se utiliza para la canulación de la VCI subhepática durante la perfusión hepática</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 pulg. Agujas</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL con topes de goma</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Bloque antiratón CD16/32 Fc&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Azul Pacífico</td><td>Biolegend</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>Rata PE IgG2a</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Hámster Armenio IgG</td><td>Biolegend</td><td>400922</td><td></td></tr><tr><td>Rata PE/Cy5 IgG2b Biolegend</td><td></td><td>400610</td><td></td></tr><tr><td>Rata Azul del Pacífico IgG2c</td><td>Biolegend</td><td>400717</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio de águila modificado (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtros de células m</td><td>Corning, Inc.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL&nbsp;</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Solución acuosa de paraformaldehído -16x</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>CAS #30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección, 3,5 pulgadas, rectas, 23 mm, afiladas&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>52132-10P</td><td>Se utiliza para fines de disección general</td></tr><tr><td>Micro Pinzas, 4 pulgadas, curva completa, 0,8 mm</td><td>Stoelting</td><td>52102-37P&nbsp;</td><td>Se utiliza con fines generales de disección</td></tr><tr><td>Tijeras de disección de resorte &ndash; 3 mm Filo de corte&nbsp;</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-10</td><td>Se utiliza para la disección de aorta Pasos 1.3.3.17 a 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Curvado 0,07 mm x 0,04&nbsp; mm Pinzas de punta</td><td>Fine Science Tool</td><td>11297-10</td><td>Se utiliza para la disección de la aorta Pasos 1.3.3.17 a 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Pinzas hemostáticas (curvas)</td><td>Fine Science Tool</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sal de Sodio</td><td>Fischer Scientific</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Placas de Petri de Cultivo Celular/Fischer</td><td>Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de Poliestireno (10 cm) con tapa</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL (polipropileno)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 50 mL&nbsp;( Polipropileno)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubos de poliestireno de fondo redondo&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (stock de alcohol etílico desnaturalizado, anyhidro)</td><td>Millipore</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Colgenasa Tipo XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>ADNasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de 500 ml <>2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>4 cm Pinza hemostática</td><td>Stoelting</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas dentadas</td><td>Stoelting</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m Filtros desechables</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo IV</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Amonio Potasio (ACK)</td><td>ThermoFischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>Maquinillas de afeitar (0,22 mm (0,009")VWR</td> <td>International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Mancha</td><td></td><td></td> de vivo/muerto <td>Tinción roja de viabilidad (en <fuerte>Figura 1A</fuerte>)</td></tr></tbody></table>

aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

La obesidad promueve un estado inflamatorio crónico que es en gran parte mediado por los macrófagos residentes de tejido como macrófagos derivados de monocitos. Obesidad inducida por dieta (DIO) es un modelo valioso en el estudio del papel de la heterogeneidad del macrófago; sin embargo, aislamientos adecuados macrófago son difíciles de adquirir los tejidos inflamados. En este protocolo, describiremos los pasos de aislamiento y pautas necesarias de solución de problemas derivadas de nuestros estudios para la obtención de una adecuada población de macrófagos residentes de tejido de los ratones tras 18 semanas de alto contenido de grasa (HFD) o () alta-grasa/colesterol Intervención de la dieta HFHCD). Este protocolo se centra en tres tejidos de sello estudiados en obesidad y aterosclerosis, incluyendo la aorta, el hígado y tejido adiposo blanco (WAT). Destacamos cómo dualista uso del flujo cytometry puede alcanzar una nueva dimensión de aislamiento y caracterización de los macrófagos residentes de tejido. Una parte fundamental de este protocolo aborda las complejidades subyacentes a digestiones enzimáticas específicas de tejido y macrófagos aislamiento y subsecuente anticuerpo de superficie de la célula de tinción para análisis cytometric del flujo. Este protocolo de direcciones existentes complejidades subyacentes célula fluorescente activada (FACS) de clasificación y presenta aclaraciones a estas complejidades con el fin de obtener la caracterización amplia gama de poblaciones celulares adecuadamente ordenados. Métodos de enriquecimiento alternativo se incluyen para la clasificación de las células, como el hígado denso, lo que permite flexibilidad y manejo de tiempos cuando se trabaja con FACS. En Resumen, este protocolo ayuda al investigador para evaluar la heterogeneidad de macrófago de una multitud de los tejidos inflamados en un determinado estudio y proporciona interesantes consejos para solucionar problemas que han tenido éxito para la caracterización y aislamiento celular favorable de células inmunes en la inflamación mediada por DIO.

Cuando se utiliza la apolipoproteína E deficiente (KO ApoE) C57BL/6 (BL6) ratones mantenidas en una dieta de alta grasa colesterol alto (HCHFD o HCD) para 18 semanas, 1 x 104 - 2 x 104 CD45++ de F4/80 macrófagos aórticos pueden ser aislados cuando las dos muestras son agrupados. Hígado disecado de los ratones alimentados con HFHCD KO ApoE, produjo mayor que 5 x 105 clasificado las células de Kupffer (que depende del tiempo disponible ...

Este protocolo permite un investigador aislar y caracterizar tejido residente macrófagos en varios sello inflamado los tejidos extraídos de modelos inducida por la dieta de los trastornos metabólicos.

Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y caracterizar eficazmente macrófagos de tejidos comúnmente afectados por inflamación inducida por la dieta, como el hígado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología y la inflamación sobre cómo el fenotipo de los macrófagos residentes en el tejido puede determinar la progresión de enfermedades inflamatorias crónicas. La principal ventaja de este enfoque es que el procedimiento optimiza los pasos de aislamiento necesarios para obtener suspensiones de células individuales derivadas de tejidos afectados por inflamación crónica de bajo grado mediada por la obesidad.La procedura será demostrada por Joselyn Allen, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para aislar el hígado, primero coloque un ratón empapado en etanol en posición supina sobre una tabla de disección de espuma de poliestireno y sujete las patas delanteras y traseras. A continuación, use una pinza de punta mediana para agarrar la piel abdominal cerca de la abertura de la uretra y utilice tijeras de disección afiladas para hacer una pequeña incisión en la piel levantada.Introduzca la hoja inferior de las tijeras en la incisión entre la piel y el peritoneo y realice una incisión lateral desde la ingle hasta el mentón. Tire suavemente de la piel hacia atrás para exponer la cavidad peritoneal intacta y la pared torácica, y haga una incisión lateral a través del peritoneo. Levante el esternón y corte cuidadosamente el diafragma.Luego mueva los órganos gastrointestinales hacia un lado y localice la vena cava inferior subhepática o VCI. Utilizando pinzas hemostáticas, ocluya la VCI suprahepática para mantener una perfusión localizada y conecte una jeringa llena de tampón de perfusión precalentado a un conjunto de recolección e infusión sanguínea de calibre 23. Presione suavemente el émbolo hasta que la tubería y la aguja se llenen con el tampón de perfusión e inserte la aguja en paralelo a la vena cava inferior subhepática.La canulación adecuada de la vena cava inferior garantiza que el tampón de disociación se distribuya localmente a través del hígado y los tejidos periféricos, optimizando la digestión del tejido. Utilice una pinza hemostática de cuatro centímetros para asegurar la aguja en su lugar y presione suavemente el émbolo para comenzar la perfusión. Si la aguja está correctamente posicionada, el color desaparecerá rápidamente del hígado y los lóbulos se agrandarán. Corte inmediatamente la vena porta para permitir que el tampón de perfusión fluya libremente a través del hígado, masajeando ocasionalmente los lóbulos suavemente entre el pulgar y el índice para facilitar la eliminación de la sangre. Cuando queden solo cinco mililitros de tampón de perfusión, sustituya la jeringa de tampón de perfusión por una jeringa llena de tampón de disociación precalentado, continuando con el suave masaje de los lóbulos y la perfusión del hígado hasta que esté completamente digerido. Confirme una digestión exitosa presionando suavemente el borde romo de un par de pinzas en el lóbulo lateral izquierdo.Debe aparecer una indentación en la superficie que se llenará lentamente una vez que se retire la pinza. Luego, retire la aguja y use una hoja recta corta de un par de tijeras de disección para cortar cuidadosamente los ligamentos conectores y extirpar todo el hígado y la vesícula biliar. Transfiera el hígado a una placa de 10 centímetros que contenga 10 mililitros de DMEM frío con hielo y use pinzas dentadas para sujetar la VCI suprahepática seccionada.Utilizando pinzas de punta mediana, aplique un movimiento rápido de frotación a cada lóbulo para liberar las células de la cápsula de Glisson y pase el DMEM saturado a través de un filtro celular de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Solo se pueden obtener altos rendimientos de células viables disociando adecuadamente las células hepáticas de la cápsula de Glisson. Una vez recolectadas todas las células, invierta el tubo para mezclar suavemente la suspensión celular y pelete las células mediante centrifugación.Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros para tres centrifugaciones adicionales de baja velocidad. Después de la última centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros y centrifugue las células una vez más a mayor velocidad. Luego, resuspenda el sedimento de células no parenquimatosas en tampón FACS para su conteo y diluya las células hepáticas a la concentración adecuada según su aplicación posterior en tubos de poliestireno redondos etiquetados de cinco mililitros.Los ratones alimentados con una dieta alta en grasas o con una dieta alta en grasas y colesterol muestran una infiltración aumentada de macrófagos M1 clásicamente activados en tejidos afectados, como la aorta. Los macrófagos aórticos positivos para CD45 y F4/80 que expresan el receptor RON, los cuales presentan un fenotipo antiinflamatorio, se reducen en ratones alimentados con una dieta alta en grasas y colesterol, mientras que los macrófagos proinflamatorios positivos para CD45, F4/80 y CD11c se encuentran en números aumentados en aortas aisladas de estos animales. Además, los macrófagos expresantes del receptor RON, aislados mediante clasificación a partir de aortas digeridas, muestran una expresión aumentada del gen Arginasa 1, un marcador bien establecido de macrófagos M2.De hecho, la caracterización de los macrófagos residentes en el hígado revela el fenotipo predominante de subpoblaciones que expresan el receptor RON, con poblaciones de macrófagos proinflamatorios positivos para CD11c que muestran una expresión disminuida de genes fuertemente asociados con el fenotipo antiinflamatorio M2. Se observan tendencias similares en las poblaciones de macrófagos aisladas del tejido adiposo blanco digerido, donde las poblaciones de macrófagos con fenotipo proinflamatorio exhiben una expresión superficial reducida del receptor RON. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en 20 a 30 minutos por animal si se realiza adecuadamente.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como citometría de flujo, clasificación fluorescente de células activadas y/o PCR cuantitativa para caracterizar más a fondo el fenotipo de los macrófagos residentes en el tejido hepático aislados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar adecuadamente macrófagos residentes en el tejido a partir de hígados enfermos. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un nuevo método para obtener los macrófagos de los cultivos primarios de células de hígado de rata se describe. Este método utiliza la proliferación de los macrófagos en la cultura, seguida de temblor en frascos de cultivo y la purificación por el apego selectivo para platos de plástico. Esta técnica proporciona de manera eficiente los macrófagos del hígado sin necesidad de equipo y habilidades complejas.

Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

El artículo describe una adaptación fácil...

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

El tejido adiposo (AT) es un sitio de activación de células inmunes y la interacción intensa. Casi todas las células del sistema inmune están presentes en AT y sus proporciones se alteran por la obesidad. Aislamiento adecuado, cuantificación y caracterización de las poblaciones de células inmunes son fundamentales para la comprensión de su papel en la enfermedad immunometabolic.

Aislamiento de tejido adiposo células inmunes

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Los macrófagos son las células clave implicadas en la patogenicidad del huésped. Los macrófagos muestran una diversidad fenotípica y funcional que puede ser analizada y detectada mediante análisis proteómico. Este artículo describe cómo realizar electroforesis 2D de cultivos primarios de macrófagos humanos diferenciados en fenotipo M1 o M2.

Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D

Describimos aquí un protocolo sencillo para aislar macrófagos peritoneales murinos. A este procedimiento le sigue la extracción de ARN para llevar a cabo el análisis de la expresión génica tras la estimulación de los receptores tipo Toll.

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

Este artículo describe un método para analizar el contenido de la célula inmune del tejido adiposo por el aislamiento de las células inmunes del tejido adiposo y posterior análisis mediante citometría de flujo.

Caracterización de células inmunes en el tejido adiposo humano mediante el uso de citometría de flujo

Presentamos un protocolo para obtener firmas de Proteómica de macrófagos humanos y aplicar esto a la determinación del impacto de un ambiente de poco oxígeno en polarización de macrófagos.

Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno

Este protocolo proporciona un método eficiente de digestión de colagenasas para el aislamiento de adipocitos viables y células de la fracción vascular estromal-SVF de grasa visceral humana en un solo proceso, incluida la metodología para obtener ARN de alta calidad de los adipocitos y la fenotipificación de los macrófagos SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su análisis por citometría de flujo.

Aislamiento de adipocitos viables y fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo visceral humano adecuado para análisis de ARN y fenotipado de macrófagos

El tamaño y la fragilidad de los adipocitos maduros han limitado las técnicas y herramientas disponibles para su estudio y aislamiento. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de adipocitos murinos maduros, que puede adaptarse fácilmente a diferentes depósitos de adiposo y dietas de ratones.

Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

Aprende a aislar y caracterizar macrófagos residentes en tejidos afectados por inflamación relacionada con la obesidad. Este protocolo optimiza la obtención de suspensiones unicelulares del hígado para estudiar fenotipos inmunológicos.

Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad (Video) | JoVE Journal

Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

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