Name: 3D空間の細胞培養のための細胞骨格などの生体適合性液晶エラストマー発泡体の合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: 学ぶ生体適合性液晶エラストマー発泡体の合成法。ニッケルフォームテンプレートを用いた3Dスカフォールド調製と細胞接着・増殖評価により、空間的細胞相互作用の研究に応用可能です。

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このプロジェクトの財政支援のために - 著者はケント州立大学（ReMedIKSケント州での再生医療・イニシアティブのための共同研究助成金や支援を）感謝したいと思います。

<ol><li>Khor, E., Lim, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantable+applications+of+chitin+and+chitosan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Implantable applications of chitin and chitosan.</a> Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).</li>
<li>Chung, H. J., Park, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+engineered+and+drug+releasing+pre-fabricated+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).</li>
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<li>Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape-responsive+liquid+crystal+elastomer+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers.</a> Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+and+Porous+Liquid+Crystal+Elastomer+Scaffolds+for+Spatial+Cell+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures.</a> Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).</li>
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<li>Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+liquid-crystal+elastomer+swims+into+the+dark%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark.</a> Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).</li>
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<li>Fleischmann, E. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-piece+micropumps+from+liquid+crystalline+core-shell+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles.</a> Nat. Commun. 3, (2012).</li>
<li>Herzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printable+Optical+Sensors+Based+on+H-Bonded+Supramolecular+Cholesteric+Liquid+Crystal+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).</li>
<li>Lockwood, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.200500768/abstract">Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells.</a> Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+structural+variations+on+the+cellular+response+and+mechanical+properties+of+biocompatible%2C+biodegradable%2C+and+porous+smectic+liquid+crystal+elastomers%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers.</a> Macromol. Biosci. , In press (2016).</li>
<li>Bera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Crystal+Elastomer+Microspheres+as+Three-Dimensional+Cell+Scaffolds+Supporting+the+Attachment+and+Proliferation+of+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).</li>
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<li>McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentation+Versus+Tensile+Measurements+of+Young%27s+Modulus+for+Soft+Biological+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).</li>
<li>Kung, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+three+dimensional+graphene+foam+supported+platinum-ruthenium+bimetallic+nanocatalysts+for+hydrogen+peroxide+based+electrochemical+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors.</a> Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).</li>
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<li>Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma400735a">Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films.</a> Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).</li>
<li>Riboldi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myogenesis+on+highly+orientated+microfibrous+polyesterurethane+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).</li>
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<li>Lenoir, S., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma035003l">Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes.</a> Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).</li>
<li>Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization+and+in+vitro+degradation+of+a+biodegradable+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer.</a> Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).</li>
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<li>Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)1099-0518(19970715)35:9%3C1635::AID-POLA5%3E3.0.CO;2-Q/abstract">Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type.</a> J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).</li>
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 <a target="_blank" href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> (2015).</li>
</ol>

著者は、開示することは何もありません。

液晶エラストマーは、最近、それらの刺激応答性、生体適合性細胞の足場として研究されてきました。彼らは、細胞の足場として理想的なプラットフォームであることが証明されています。しかし、新しいLCE足場を準備して設計する際に心に留めておくべき重要な要因は、多孔性です。浸出性固形物23またはガスの取り込みは、常に均質な多孔性または完全に相互接続された孔にはなりません。だけではなくてエッチングすることができる金属テンプレートの使用は、より組織的かつ定期的な内部構造を持ってする機会を提供していますが、また、細孔サイズおよび密度を選択することができます。これは、以前グラフェンフォーム22の調製のために使用される金属のテンプレートに直接関係します。金属テンプレートは、通常の多孔性のデと洗練された複雑なアーキテクチャを作成するために、可能性の広大な配列を許可する、LCEの架橋前に形状を形成する機会を提供します密接に内因性の環境に似せて署名しました。発泡種の保存法は、この方法論を用いて調製された細胞材料の改良された研究と、より重要なことを可能にする、空間的な細胞 ...

細胞研究において、細胞の付着および増殖を1、2、3、4、5を目指し組織再生のためのアプリケーションのために設計された生物学的および生体適合性合成材料のいくつかの例があります。 図6、 図7を注文分子異方性の外部刺激に応答することができ、液晶エラストマー（種の保存法）として知られている生体適合性材料のいくつかの例、、がありました。種の保存法は、光学機能と液晶8,9の分子秩序を有するエラストマーの機械的および弾性特性を組み合わせた刺激応答性物質です。種の保存法外部STIMに応じて形状、機械的変形、弾性挙動、および光学的性質の変化を体験することができULI（ すなわち 、熱、応力、光、 等 ）10、11、12、13、14、15、16。以前の研究では、液晶（LCS）がセル4、17の成長と配向を感知することができることを示しています。これは種の保存法が細胞の足場とアラインメントを含む、生物学的および医学的に関連する用途に好適であり得ると仮定することが可能です。我々は以前、「スイスチーズの種類」、多孔質の形態6、18を搭載スメクティック生体適合性、生分解性、キャスト成形、および薄い種の保存法フィルムの作製を報告しています。我々はまた、細胞増殖19 &lt;ための足場として球状形態を有するネマチック生体適合性種の保存法調製しますSUP&gt;、20。私たちの仕事は、関心21の組織のものと一致する材料の機械的特性を調整することを目的としています。また、これらの研究は、エラストマー - 細胞相互作用、ならびにエラストマーは外部刺激の対象となる細胞応答を理解することに焦点を当てます。 主な課題は、エラストマーマトリックスを介してより良い大量輸送のための細胞の付着および浸透を可能にするために、種の保存法の気孔率を調整する部分でした。これらの薄膜6の気孔率は、マトリックスのバルクを通って細胞透過性のために許可され、すべてではない孔が完全に相互接続されたまたは孔（均質）よりレギュラーサイズを有していました。私たちは、その後、球状の形態を有する生体適合性ネマチックLCEエラストマーについて報告しました。これらネマチックエラストマーは、付着および細胞の増殖を許容するが、細孔サイズが防止10-30ミクロンからのみ範囲又はこれらの使用を制限し細胞株19,20の広い様々なエラストマー。 クンらの前の仕事。 「犠牲」金属テンプレートを使用してグラフェン発泡体の形成に関連して得られたグラフェンフォームが選択された金属テンプレート22によって決定非常に規則的な多孔性の形態を有することを示しました。この方法では、気孔率及び気孔サイズの完全な制御を提供しています。同時に、金属テンプレートの可鍛性と柔軟性は、前のフォームの準備に異なるテンプレート形状の形成を可能にします。いくつかのケースでは、細孔サイズは、限定され、そのような材料の浸出23、ガステンプレート24、または電気紡糸繊維25、26のような他の技術は、また、多孔性材料の調製のための可能性を提供するが、それらはより多くの時間がかかるとされていますわずか数メートル。フォーム3D種の保存法様金属テンプレートは、より高いセル負荷を可能に用いて調製。改善された増殖速度。共培養;そして、、少なくとも最後のではなく、より良い大量輸送管理（ すなわち 、栄養素、ガス、及び廃棄物）の完全な組織開発27を確保します。泡状3D種の保存法は、細胞整列を改善するように見えます。これは、細胞増殖と細胞の向きを検知するLCのペンダントとの関係で最も可能性が高いです。 LCE内のLC部分の存在は、LCE足場内の細胞の位置に対する細胞配向性を高めるように見えます。支柱は、一緒に（接合部）27の参加ここでは明確な配向が観察されないながら細胞は、LCEの支柱内に整列させます。 全体として、細胞支持体としてのLCE細胞足場プラットフォームを調整するために、エラストマーの形態と弾性特性、特にO順序付けられた、空間的配置を作成する（個々の）細胞型の位置合わせを指示するの機会を提供します生体系に似てF細胞。別に維持および長期細胞成長および増殖を指示することができる足場を提供することから、種の保存法はまた、細胞の配向との相互作用をオンザフライで修正することができる動的な実験を可能にします。

<table><tbody><tr><td>1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチルトリエトキシシラン</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16606</td><td>シラン化剤</td></tr><tr><td>2-ビス(4-ヒドロキシ-シクロヘキシル)プロパン</td><td>TCI</td><td><a href="http://www.tcichemicals.com/eshop/en/us/commodity/B0928/">B0928</a></td><td>試薬</td></tr><tr><td>2-クロロヘキサノン&nbsp;</td><td>アルファ Aesar</td><td>A18613</td><td>試薬</td></tr><tr><td>2-ヘプタノン&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>W254401</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>2-プロパノール&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>278475</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>3-クロロペル安息香酸、m-CPBA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>273031</td><td></td></tr>試薬 <tr><td>4-ジメチルアミノピリジン</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13016</td><td>試薬</td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Nuclear Stain</td></tr><tr><td>5-ヘキシノ酸&nbsp;</td><td>アルファAesar</td><td>B25132-06</td><td>試薬</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>VWR</td><td>36289</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>シグマAldrich</td><td>34850</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>アルコール200プルーフACSグレード&nbsp;</td><td>VWR</td><td>71001-866</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ベンゼン</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA33290</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>&epsilon;-caprolactone&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10299-0E</td><td>試薬</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>VWR</td><td>BDH1109</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8503</td><td>試薬</td></tr><tr><td>酸化クロム(VI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>232653</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ヨウ化銅(I)</td><td>Strem Chemicals</td><td>100211-060</td><td>試薬</td></tr><tr><td>D,L-Lactide&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>L09026</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320269</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>ジエチルエーテル&nbsp;</td><td>EMD ミリポア</td><td>EX0190</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270547</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>ダルベッコ」s 修正イーグル ミディアム、DEME&nbsp;</td><td>CORNING Cellgo</td><td>10-013</td><td>細胞培地</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Alfa Aesar</td><td>33361</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>F8775</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 FBS&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>濾紙、グレード 415、定性的、クレープ</td><td>VWR</td><td>28320</td><td>ろ過</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>中央ノード (3 アーム)</td></tr> <tr><td>ヘキサメチレンジイソシアネート、HDI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52649</td><td>架橋剤</td></tr><tr><td>塩化鉄 (III) &nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>12357</td><td>エッチング剤</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>VWR</td><td>BDH1133</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13255</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド</td><td>Aldrich</td><td>D80002</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270547</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>ニッケル金属テンプレート</td><td>アメリカンエレメント</td><td>Ni-860</td><td>フォームテンプレート</td></tr><tr><td>神経芽細胞腫細胞 (SH-SY5Y)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td>抗生物質</td></tr>ポリエチレン<tr><td>グリコール 2000、PEG</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22181</td><td>試薬</td></tr>ア<tr><td>ジ化ナトリウム&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>試薬</td></tr>重<tr><td>炭酸</td>ナトリウム<td>AMRESCO</td><td>865</td><td>乾燥塩</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td>乾燥塩</td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム二塩基性七水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S-374</td>乾燥<td>塩</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性一水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td>乾燥<td>塩硫酸</td></tr><tr><td>ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>239313</td><td>乾燥塩</td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン</td><td>アルファ エーザー</td><td>41819</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>チオ硫酸</td>塩 <td>アムレスコ</td><td>393</td><td>乾燥塩</td></tr><tr><td>錫(II) 2-エチルヘキサン酸</td><td>アルドリッチ</td><td>S3252</td><td>試薬</td></tr><tr><td>トルエン</td><td>アルファ エーザー</td><td>22903</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>471283</td><td>試薬</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>細胞剥離</td></tr><tr><td>Olympus FV1000</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3d空間の細胞培養のための細胞骨格などの生体適合性液晶エラストマー発泡体の合成

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

ここでは、3D、生分解性、泡様細胞足場のステップバイステップの準備を提示します。これらの足場は、スメクチックA（SMA）、液晶エラストマー（種の保存法）で得られた、側鎖のペンダント基としてコレステロールユニットを搭載星型ブロックコポリマーを架橋することによって調製しました。泡のような足場は、3D細胞培養足場、それらに適したものに、金属テンプレートを用いて調製し、相互接続さマイクロチャネルを備えています。従来の多孔質テンプレートフィルムと比較するだけでなく、より高い細胞増殖を促進する三次元細胞骨格における金属発泡体の規則的な構造のエラストマー結果の組み合わせの特性だけでなく、大量輸送のより良い管理（ すなわち、栄養物、ガス、廃棄物、 など ）。金属テンプレートの性質は、泡の形状（ すなわち、ロールまたはフィルム）の容易な操作を可能にし、異なる細胞研究のための異なる孔径の足場の調製のためのinterconnecを維持しながら、テンプレートのテッド多孔性の性質。エッチングプロセスは、その生体適合性および生分解性を維持したまま、エラストマーの化学的性質に影響を与えることはありません。私たちは、細胞の成長と増殖を促進しながら、これらのスメクティック種の保存法は、広範囲の期間のために増殖させた場合、臨床的に関連して、複雑な組織構築物の研究を可能にすることを示しています。

このレポートは、ニッケル金属テンプレートを使用して、細胞培養のための足場としての多孔質の3D LCEの調製方法を示します。得られた3D LCEは容易細胞浸潤を可能にする複雑な相互接続チャネルネットワーク、ならびにより適切な物質移動27を示しています。これは、細胞が完全に相互接続チャネルネットワークに侵入することができ、また、LCE内に整列させることが可能であることが見出されました。ここで、金属ニッケル発泡体（99％のNi、860グラム/ cm 2の密度）は、以前のKung らによって報告されたグラフェンの発泡調製と同様の手法に従って選択しました。 22。金属発泡体は完全にカバーされ、すべての金属支柱と、キャストポリマーでした。それはLCEの最終形態を付与し、目的の組織環境を模倣するのに役立ちますように、金属泡の大きさと密度の選択は、重要です。 <p class="jove_content" fo:keep-tog...

この研究は、3D、生体適合性の側鎖型液晶エラストマー（種の保存法）に基づいて、生分解性、泡様細胞の足場を調製するための方法論を提示します。共焦点顕微鏡実験は泡状種の保存法は、細胞の付着、増殖、およびC2C12s筋芽細胞の自発的なアライメントを可能にすることを示しています。

3D空間の細胞培養のための細胞骨格などの生体適合性液晶エラストマー発泡体の合成

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

本手順の目的は、生体適合性側鎖液晶エラストマーに基づいた生分解性の三次元フォーム状細胞足場を作製することです。この手法は、液晶エラストマーの特性が細胞の増殖や配向に与える影響など、液晶および生物医学分野における重要な課題の解明に寄与します。この三次元細胞足場法の主な利点は、二次元のマクロ環境では困難な、細胞間における空間的な相互作用の研究が可能になることです。一般的に、この手法を初めて行う方は、触覚圧縮試験に苦労されることでしょう。私たちは、数百枚ものペトリ皿の培地を交換しなければならなかった経験から、この手法を考案しました。膨大な数のペトリ皿の使用をなくすため、液晶エラストマーを用いて3Dネットワーク上で筋細胞を支持させることができないかと考えたのです。いくつかの工程で化学薬品の慎重な取り扱いが必要となるため、本手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。さらに、金属フォームテンプレートの成形が困難な場合があります。まず、20 milliliterのアンプルに、トルエンで調製した2%by volumeのPFOTES溶液を満たします。アンプルの内部をシラン化するため、溶液を24時間撹拌します。シラン化されたアンプルをイソプロピルアルコールで洗浄し、140 degrees celsiusで30分間乾燥させます。乾燥させたアンプルに、蒸留したepsilon-caprolactone 3.64 grams、alpha-chloro-epsilon-caprolactone 0.5 grams、およびグリセロール 0.25 millilitersを入れます。混合物を1分間ボルテックスします。次に、4.90 gramsのDL-lactideを混合物に加え、アンプルの雰囲気を窒素ガスで1分間置換します。アンプルの開口部をアルミホイルで覆い、混合物を120 °Cで約2時間加熱してDL-lactideを融解させます。混合物をボルテックスして未溶解の固形物を分散させ、次に10-2-ethylhexanoateを66 µLアンプルに加え、再度ボルテックスします。アンプルをアルミホイルで密閉し、DL-lactideを再融解させるため、混合物を120 °Cで10分間加熱します。DL-lactideが再び融解したら、混合物を激しくボルテックスし、アンプルの内部雰囲気を窒素ガスで置換します。アンプルをゴムセプタムで密閉します。真空ラインに接続した針をセプタムに刺し、真空引きを開始します。ゴム栓を溶かさないように注意しながら、アンプルのネック部分を火炎封止します。ネックを封じた後、反応混合物を140 °Cで48時間加熱します。その後、混合物を室温まで冷却します。アンプルを開封し、粘性の反応混合物を10 mLのジクロロメタンに溶解させます。混合物を分液漏斗に移します。100 millilitersのメタノールを入れたフラスコをドライアイス・アセトンバスに設置し、メタノールを約minus 78 degrees Celsiusまで冷却します。メタノールの冷却が完了したら、分液漏斗をフラスコに固定します。反応混合物を、1秒間に2滴の速度で冷メタノールに加えます。生成した白色沈殿をフィルターペーパーで回収します。沈殿物を50〜60 °Cの真空乾燥機で乾燥させ、3アームα-クロロSBC生成物を得ます。α-コレステリル3アームSBCを調製するために、ペンダントの塩素原子をアジドに置換します。コレステリル5-ヘキシン酸とのクリック反応により、液晶部位としてペンダントコレステリルが得られます。液晶エラストマー骨格の調製を開始するには、0.75 gのα-コレステリル3アームSBCに、0.25 mLのHDIと0.24 mLの蒸留ε-カプロラクトンを混合します。これに10-2-ethylhexanoateを60 µL加え、混合物をボルテックスします。次に、1 cm × 4 cmのニッケルメタルフォームを切り出します。このニッケルフォームを直径1 cm、高さ1 cmの円柱状に丸め、液晶エラストマーフォームスキャフォールドのテンプレートを作成します。テンプレートをガラスバイアルまたはアルミホイルの容器に入れ、テンプレートが完全に覆われるまで液晶エラストマー混合液を注ぎます。テンプレートを液晶エラストマー混合液に2分間浸した後、ピペットで余分な液を取り除きます。混合液とテンプレートを80 °Cで一晩加熱します。次に、アルミホイルを剥がすか、ガラスを割ります。カミソリの刃を使用して、余分な液晶エラストマーを取り除き、ニッケル金属テンプレートを露出させます。フォームをフラスコに入れ、飽和塩化鉄(III)水溶液 70 milliliters を加えます。室温で3日間、溶液中でフォームを攪拌し、ニッケルテンプレートを溶解させます。24時間ごとに、脱イオン水中でフォームを30分間攪拌し、その後、新しい塩化鉄(III)溶液での攪拌を再開します。攪拌開始から2日後に、液晶エラストマーフォームの触覚圧縮試験を行います。触覚的な圧縮に対する抵抗感がある場合は、フォーム内にニッケルテンプレートがまだ残っていることを示しています。3日後には、すべてのニッケルテンプレートが除去され、得られたフォームは非常に柔らかくなり、完全に圧縮しやすい状態になります。ニッケルテンプレートは完全に除去されなければなりません。触覚圧縮試験を行った際に、触った感じが柔らかくなるまで、塩化鉄で液晶エラストマーフォームを十分にすすぐことが重要です。これで、液晶エラストマーフォームスキャフォールドの特性評価および使用が可能になります。液晶エラストマーフォームが柔らかくなったら、70% ethanolで洗浄して滅菌します。播種手順を開始するために、エラストマー表面を滅菌させるため、液晶エラストマーフォームスキャホールドを1 mLの70%エタノールで再度2回洗浄します。次に、スキャホールドにUV光を10分間照射します。その後、さらに1 mLの70%エタノールでスキャホールドを洗浄します。滅菌水およびリン酸緩衝生理食塩水で、スキャフォールドをそれぞれ1 mLずつ洗浄します。滅菌した液晶エラストマー・スキャフォールドを24ウェル培養プレートに配置します。ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む適切な細胞増殖培地を用いて、目的とする細胞の懸濁液を調製し、細胞数を計測します。増殖培地を用いて、細胞懸濁液を100 µLあたり1.5×10⁵個に希釈します。希釈した細胞懸濁液を、各液晶エラストマー足場の上に一滴ずつ滴下します。播種した液晶エラストマー足場を、5% CO2雰囲気下、37 °Cで2時間インキュベートします。各スキャフォールドに成長培地をさらに0.5 milliliters加え、インキュベーションを継続します。48時間ごとに、播種したスキャフォールドを1 milliliterのPBSで洗浄し、新鮮な成長培地を加えます。細胞が顕微鏡観察に適した状態になるまで、スキャフォールドのインキュベーションを継続してください。これらのsmetic LCは、細胞の成長と増殖を促進しながら、複雑な組織構築の研究を可能にします。細胞生存率を維持するためには、フォームを滅菌し、常に培養の清潔さを保つ必要があります。顕微鏡観察の準備として、PBSで調製した4%パラホルムアルデヒド溶液を用いて、スキャフォールド上の細胞を15分間固定してください。サンプルを3 mLのPBSで5分間、3回浸漬します。スキャフォールドサンプルを1つエッペンドルフチューブに入れます。500 µLのPBSに0.1% DAPIを溶解させた溶液を用いて、サンプルを10分間染色します。サンプルを1 mLのPBSで5分間、2回洗浄します。その後、直ちに共焦点顕微鏡でサンプルの撮像を行います。サンプル全体にわたる画像スタックを取得し、画像処理プログラムでデータを解析します。HDIを架橋剤として、液晶部位を有する3アームSBCをニッケルフォームテンプレート上にキャストした。エッチングによりニッケルテンプレートを除去し、液晶エラストマーフォームを得た。エッチングプロセスのモニタリングのため、圧縮変形試験を定期的に実施した。ニッケルが完全に溶解した後、圧縮変形試験を行ったところ、圧縮時にサイズが70%減少することが示されました。圧縮を解除すると、液晶エラストマーフォームは一貫して元のサイズと形状に回復しました。この挙動は液晶部位に起因すると考えられます。なぜなら、コレステロールε-カプロラクトン部位を欠いた同様のエラストマーフォームでは、圧縮からの回復が見られなかったためです。内部フォーム形態のSCMでは、中空のフォームストラットが相互に連結したネットワーク構造が示された。この規則的な形態はニッケルフォームの構造に起因しており、適切な金属テンプレートを選択することで、細孔径と全体の形状を制御できることが示唆された。このフォームに神経芽細胞腫細胞を播種したところ、2日以内にネットワークの壁面に細胞が付着した。播種から30日後、共焦点顕微鏡観察により、細胞が液晶エラストマーネットワーク上に伸展し、エラストマーフォーム全体に分散して多層構造を形成していることが明らかになりました。また、細胞核の伸長が観察され、それが細胞の配向性と相関していました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで3〜4週間以内に完了させることができます。このビデオを視聴することで、特定の孔径と形態を持つ液晶エラストマー細胞スキャフォールドの設計および作製方法について十分に理解することができます。この手順を試みる際は、各産物を完全に特性評価し、細胞の生存率と増殖をモニタリングすることが重要です。さらに、共焦点顕微鏡画像を容易に取得するためには、適切な染色技術が重要となります。本手順に従い、液晶エラストマーにストレスや磁場、電場などの外部刺激を加えることで、液晶エラストマーの異方的な分子配向が細胞応答にどのように影響するかというさらなる疑問を検討することも可能です。この手法の意義は疾患プロセスの研究にも適用でき、模擬的な疾患活性に対する外部因子の影響およびその後の修復プロセスを動的に研究するためのプラットフォームを提供します。このスメクチック液晶エラストマーフォームは細胞間相互作用に関する知見を提供しますが、半導体や金属ナノ構造などの他の材料と併用することも可能です。この技術の開発により、生物医学分野の研究者が生体システムを模倣した長期的な実験プラットフォームを設計するための道が開かれました。

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