Name: Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a utilizar la espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio con ionización por electrospray resuelta en el tiempo para estudiar cambios estructurales rápidos en proteínas ordenadas e intrínsecamente desordenadas.

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Agradecemos al Dr. Markus Zweckstetter por proporcionar el archivo de coordenadas pdb para el conjunto tau 'nativo' predicho a partir de su trabajo de RMN, con herramientas de análisis aportadas por el Dr. Adnan Sljoka. El financiamiento para este trabajo fue proporcionado por el programa de becas ENGAGE del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC).

NOTA: Por favor, consultar a todas las hojas de datos de seguridad (MSDS) antes de usar. Los humos producidos por ablación con láser de poli (metacrilato de metilo) (PMMA) pueden ser tóxicos. Asegúrese de que el grabador láser está conectado a un sistema de ventilación de trabajo. Utilice todas las prácticas de seguridad adecuadas en la construcción del dispositivo microfluídico incluyendo el uso de los controles de ingeniería (campana de humos, contenedor de objetos punzantes) y el equipo de protección personal (gafas de seguridad, mascarilla, guantes, ropa de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados). Es de suma importancia para usar cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) los reactivos de grado cuando sea posible, con todo ser de grado ACS o superior para disminuir los contaminantes que interfieren durante el análisis. 1. Preparación del dispositivo de microfluidos <ol><li> La construcción de la plataforma de microfluidos PMMA <ol><li> Obtener un bloque PMMA estándar (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) y láser de ablación de un canal de entrada para la introducción de los reactivos, un proteolisis de cámara, y un canal de salida utilizando un grabador láser 17, 18. NOTA: Etch la cámara de la proteolisis en una forma oval alargada (30 x 5 x 0,05 mm). El canal de entrada y de salida debe extenderse hasta el extremo del bloque de PMMA y ser mayor de 75 m de anchura y profundidad con el fin de acomodar un capilar de 30 ga. </li><li> Cortar un acero inoxidable capilar de metal 30 ga en dos piezas de aproximadamente 10 cm cada uno utilizando una herramienta rotativa con un disco de corte 1/64&quot; de espesor. Utilice papel de lija para suavizar los extremos de los capilares (esto puede facilitarse mediante la visualización bajo una microscopio de luz). </li><li> Fundir los capilares en el poli grabado al agua fuerte (metacrilato de metilo) de bloque utilizando un soldador. El canal de entrada se conectará a bombas de jeringa automatizados, y el canal de salida se utiliza para el acoplamiento en la MS. </li></ol></li><li> La construcción del mezclador Kinetic Resuelta en tiempo Flujo Continuo <ol><li> Obtener una fusionadocapilar de sílice de vidrio (ID: 75! m, OD: 150 m) de aproximadamente 40 cm, y la inserta en un acero inoxidable capilar de metal 28 ga de aproximadamente 15 cm. Dependiendo del tiempo de reacción requerido, usar un capilar de metal exterior más largo o uno con un ID más grande. NOTA: Determinar el diámetro interior &#39;verdadero&#39; del capilar de metal es crítico para la obtención de tiempos de reacción precisas. Esto se puede hacer conectando el capilar de metal a una HPLC, que fluye disolvente aunque el capilar, y el registro de la presión de retorno. Una contrapresión para el cálculo del diámetro interior se puede hacer, y el verdadero diámetro interior del capilar de metal determinado. Esto se puede calcular usando el software Molecular Weight Calculator (para Windows Versión 6.49). </li><li> Producir una muesca 2 mm utilizando la configuración grabador láser de baja potencia en un extremo del capilar de vidrio interior y sellar este extremo del capilar de vidrio interior (Figura 2). Alternativamente, hacer la muesca usando un capilar de vidrio cerámicoherramienta de corte Y o un molino rotatorio con una cuchilla de corte fino. </li><li> Line-up el capilar de vidrio interior con el extremo del capilar de metal (esto se puede facilitar mediante la visualización bajo un microscopio de luz). </li><li> Fije este mezclador cinética a un extremo de la te de mezcla (Figura 2). </li><li> Adjuntar un capilar fundido de vidrio de sílice (ID: 75! M, OD: 150 m) de aproximadamente 40 cm hasta el extremo opuesto de la mezcladora cinética en la te de mezcla. Esto se utiliza para entregar ácido (ácido acético al 5%, pH 2,4) para extinguir la reacción. NOTA: Los reactivos se suministran al dispositivo con jeringas de gas hermética a través de un tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) usando bombas de infusión automatizadas. </li></ol></li><li> La activación de la pepsina <ol><li> Pesar 20 mg de pepsina de mucosa gástrica porcina y suspenderlo en 1 ml de tampón de acoplamiento (fosfato sódico 0,1 M, 0,15 M NaCl, pH 6,0). </li><li> Pesar 50 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) perlas de agarosa activados por, añadir a la re-sproteasa uspended y gire suavemente durante la noche a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a 1.000 xg durante 2 min a temperatura ambiente para recoger la resina. </li><li> Aspirar la proteasa no unido. </li><li> Incubar la agarosa en 1 ml de tampón de bloqueo (1 M Tris-HCl, pH 6,0) y gire suavemente a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Centrifugar a 1.000 xg durante 2 min a temperatura ambiente para recoger la resina. </li><li> Aspirar el tampón de bloqueo. </li><li> Incubar la pepsina-agarosa con ácido acético 1 ml de 5%, pH 2,4 durante 5 min. </li><li> Centrifugar a 1.000 xg durante 2 min para recoger la resina. </li><li> Aspirar el sobrenadante. </li><li> Repita los pasos 1.3.8 - 1.3.10 para un total de tres lavados. </li><li> Almacenar las perlas en 1 ml de ácido acético a 4 ° C para su uso a largo plazo. </li></ol></li><li> Asamblea dispositivo <ol><li> Llene la cámara de la proteolisis con la suspensión de perlas de pepsina-agarosa activadas en ácido acético al 5% usando una espátula estéril. </li><li> Coloque el platfor microfluidos PMMAm en entre dos bloques de PMMA en blanco como una cubierta para sellar el dispositivo, revestido con caucho de silicona para crear un sello estanco a los líquidos. </li><li> Usar placas de sujeción metálico a la presión de sellado en el dispositivo. NOTA: La abrazadera fue hecho a medida con el fin de adaptarse a la plataforma de microfluidos y se compone de dos placas de medición 10.1 cm x 7.4 cm x 1.2 cm. </li><li> El flujo de ácido acético al 5%, pH 2,4 a una velocidad de 10 l / min. El flujo mM de tampón de acetato de amonio 50 (pH 6,9), aunque la línea de proteína a una velocidad de 1 l / min. NOTA: Es muy importante que el ácido acético fluye continuamente a través del dispositivo a lo largo de la totalidad del experimento. Asegúrese de que no hay fugas y que el fluido está saliendo sólo desde el canal de salida, que servirá como la fuente ESI. </li><li> Acoplar el dispositivo al extremo frontal de un espectrómetro modificado cuadrupolo tiempo de vuelo (Q-TOF) de masas usando una fase aislamiento ajustable para conseguir condiciones de electrospray óptimos. NOTA: Un interruptor de derivaciónse introduce con el fin de simular la presencia de una fuente ESI comercial. 17 </li></ol></li></ol> 2. Intercambio de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio resuelta en el tiempo <ol><li> Adquisición de pepsina y Proteína Sólo Spectra NOTA: adquisición ESI-MS se lleva a cabo en el modo de ion positivo con un voltaje de 4.500 hasta 5.000, 60-V potencial desagrupación, y 250-V potencial de enfoque. Los espectros se adquirieron en un intervalo de 350-1,500 m / z con una velocidad de barrido de 1 s -1. <ol><li> Adquirir una única espectro de pepsina. Cualquier picos que aparecen en este espectro se restan una vez que se añade la proteína. </li><li> Introducir 50-100 M tau / proteína fosfo-tau (purificar y preparar como se ha descrito previamente 13, 19) a una velocidad de 1 l / min en el que el tampón de acetato de amonio 50 mM fluía anteriormente. </li><li> Adquirir una proteína única espectro. </li></ol></li><li> adquisición oPuntos f Tiempo <ol><li> Mientras que la proteína 100 M tau / fosfo-tau está fluyendo a 1 l / min, introducir D 2 O a una velocidad de 3 l / min a través de un conector tee y dejar reaccionar en el mezclador cinética. Permitir que el sistema se equilibre durante al menos 10 min antes de la adquisición del espectro. NOTA: Después del intercambio, la reacción de marcaje se inactiva por el flujo de pH ácido acético 2,4 a 10 l / min y la digestión de la proteína marcada se produce en la cámara proteolítica. </li><li> Con el fin de aumentar el tiempo de etiquetado, manualmente tire hacia atrás de la posición del capilar de vidrio interior para lograr tiempos de 42 ms de mezcla a 8 s. Permitir que el sistema se equilibre durante al menos 10 min entre cada pull-back. </li></ol></li></ol> 3. Los datos y análisis estadístico <ol><li> La identificación de péptidos y calculando el porcentaje de deuterio intercambio <ol><li> Realizar análisis de espectros de MS utilizando el software mMass, versión 5.5.0 20 </sup&gt;. </li><li> Identificar péptidos utilizando el servidor de proteómica ExPASy FindPept y confirmar por disociación inducida por colisión (CID) cuando se requiera 21. NOTA: Aquí, la incorporación de deuterio absorción se midió utilizando un software FORTRAN en-casa desarrollado para el análisis de distribución isotópica 22, 23. </li><li> Calcular las tasas intrínsecas teóricos basados en la secuencia primaria mediante la herramienta web SPHERE 22, 24. </li><li> Ajustar los datos usando regresión no lineal exponencial único y normalizar usando una gráfica y software estadístico (por ejemplo, SigmaPlot). NOTA: La relación de k int / k obs produce el Factor de Protección (PF), una medida semi-cuantitativa del grado de que una región particular, está estructurado dentro del conjunto conformacional. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sapienza, P. J., Lee, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+NMR+to+study+fast+dynamics+in+proteins%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).</li>
<li>Neira, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+as+a+tool+to+identify+and+characterize+protein+folding+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).</li>
<li>Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+protein+conformers+be+fractionated+by+crystallization%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Can protein conformers be fractionated by crystallization?</a> Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).</li>
<li>Keedy, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+conformational+landscape+of+a+dynamic+enzyme+by+multitemperature+and+XFEL+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography.</a> eLife. 4, e07574(2015).</li>
<li>Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+uses+of+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and uses of hydrogen exchange.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).</li>
<li>Engen, J. R., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+protein+structure+and+dynamics+by+hydrogen+exchange+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS.</a> Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).</li>
<li>Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).</li>
<li>Wilson, D. J., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Capillary+Mixer+with+Adjustable+Reaction+Chamber+Volume+for+Millisecond+Time-Resolved+Studies+by+Electrospray+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).</li>
<li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).</li>
<li>Morgan, C. R., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+solution-phase+protein+structure+and+dynamics+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom.+RCM%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+of+intrinsically+disordered+tau+protein+induces+an+amyloidogenic+shift+in+its+conformational+ensemble%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble.</a> PloS One. 10, e0120416(2015).</li>
<li>Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDX-MS+and+deletion+analysis+of+the+type+4+secretion+system+protein+TraF+from+the+Escherichia+coli+F+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid.</a> FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).</li>
<li>Hilser, V. J., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+calculation+of+the+equilibrium+folding+pathway+of+proteins.+Correlation+with+hydrogen+exchange+protection+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors.</a> J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+Protein+Structural+Models+by+Comparison+of+H%2FD+Exchange+MS+Data+with+Exchange+Behavior+Accurately+Predicted+by+DXCOREX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).</li>
<li>Rob, T., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+microfluidic+chip+for+millisecond+time-scale+kinetic+studies+by+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).</li>
<li>Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+reactor+for+rapid%2C+low-pressure+proteolysis+with+on-chip+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).</li>
<li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol.+Clifton+NJ%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).</li>
<li>Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mMass+3%3A+a+cross-platform+software+environment+for+precise+analysis+of+mass+spectrometric+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data.</a> Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).</li>
<li>Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FindPept%2C+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).</li>
<li>Rob, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Dynamics+in+Weakly+Structured+Regions+of+Proteins+Using+Microfluidics-Enabled+Subsecond+H%2FD+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).</li>
<li>Ferguson, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen%2FDeuterium+Scrambling+during+Quadrupole+Time-of-Flight+MS%2FMS+Analysis+of+a+Zinc-Binding+Protein+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain.</a> Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).</li>
<li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17, 75-86 (1993).</li>
<li>Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+isoforms%2C+phosphorylation+and+role+in+neurodegenerative+disorders1%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1.</a> Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).</li>
<li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19551977">Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).</li>
<li>Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+discovery+and+development+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review.</a> Anal. Chim. Acta. , (2016).</li>
<li>Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+and+dynamics+of+interchain+cysteine-linked+antibody-drug+conjugates+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+a+95+kDa+antigen+in+complex+with+antibody+by+solution-phase+amide+backbone+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+monitored+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).</li>
<li>Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+complexes+with+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> The Analyst. 128, 623-628 (2003).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+epitope+mapping+using+site-directed+mutagenesis+and+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis.</a> Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).</li>
<li>Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+and+Type+2+scenarios+in+hydrogen+exchange+mass+spectrometry+studies+on+protein-ligand+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes.</a> The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).</li>
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No tenemos nada que revelar.

Mientras que los métodos de biología estructural, tales como cristalografía de rayos X y RMN son ventajosos porque proporcionan estructuras extremadamente detalladas de proteínas, estas imágenes son a menudo estática. La caracterización de las especies transitorias y dominios débilmente estructurados sigue siendo difícil de alcanzar cuando se estudió por estos métodos convencionales. Por lo tanto, con el fin de obtener una visión dinámica de este tipo de sistemas es importante trabajar a escalas de tiempo rápido. Hemos ...

Durante las últimas décadas, los avances se han hecho importantes en el desarrollo de técnicas analíticas diseñadas para medir la estructura de la proteína y la dinámica de 1, 2, 3, 4. Mientras que la cristalografía de rayos X sigue siendo la herramienta principio para la determinación de la estructura de proteínas, se necesitan altas concentraciones de proteína y se requiere una amplia optimización para producir cristales de calidad de difracción. Las proteínas que son difíciles de cristalizar, tales como proteínas asociadas a la membrana y intrínsecamente desordenadas clásicamente se han estudiado por intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX) RMN 5. Sin embargo, en las últimas décadas, el acoplamiento de ionización por electrospray espectrometría de masas (ESI-MS) para HDX ha ganado rápidamente popularidad 6, 7. Espectrometría de masas ofrece una solucióna muchas de las restricciones planteados por cristalografía de rayos X y RMN. En particular, MS es altamente sensible (nM a concentraciones mu M se requiere), y prácticamente no hay límite en el tamaño de la proteína. Además, el ciclo de trabajo alto de análisis MS permite la posibilidad de estudiar proteínas que sean sometidos a rotación enzimática, mal plegamiento, formación de complejos y otros procesos biológicamente relevantes. Estos procesos ocurren a menudo en el milisegundo a segunda escala de tiempo y requieren un mezclado rápido de los reactivos antes del análisis. El desarrollo de resuelta en el tiempo de ionización por electrospray (tresi) por Wilson y Konermann en 2003 reacciones se permite monitorizar en tiempo real mediante la pseudo-ESI-MS. Su configuración incorpora un mezclador capilar con un volumen de cámara de reacción continuamente ajustable 8. El dispositivo consta de dos capilares concéntricos, con el capilar interior sellado y una muesca cortada en su lado para permitir la mezcla dentro de la estrecha inter-capillary el espacio de la muesca en el extremo del capilar interior (típicamente 2 mm). Cuando se aplica a experimentos HDX, el capilar interior lleva la proteína de interés, el capilar exterior lleva el etiquetado D2O solución, que sufre a continuación la mezcla con la proteína antes de entrar en la cámara de reacción ajustable que permite para el etiquetado HDX antes de la transferencia directa en el ESI fuente. Brevemente, HDX se basa en hidrógenos amida de cadena principal sometidos a intercambio con átomos de deuterio en solución 9, 10. El intercambio es catalizada por bases a pH fisiológico, con ácido-catálisis convertirse en predominante a pH por debajo de aproximadamente 2,6. La tasa de cambio se basa en cuatro factores principales: pH, temperatura, disolvente accesibilidad y de enlace de hidrógeno intramolecular. Como los dos primeros factores se mantienen constantes durante todo el experimento, la tasa de cambio, en particular en las posiciones de amida del esqueleto peptídico, es principalmente dependent en la estructura de proteínas 11. Bien doblado regiones con extensas redes de enlaces de hidrógeno, estables en alfa-hélices y láminas beta se llevará hasta deuterio a velocidades sustancialmente más lento en comparación con los bucles y las regiones desordenadas (y, a veces no en todos) 12. Esto permite el análisis de proteína global, donde las perturbaciones en la estructura (por ejemplo., Sobre la agregación o de unión al sustrato) conducen a diferentes captación de deuterio (Figura 1). El mezclador capilar cinética puede ser incorporado en una plataforma de microfluidos que contiene una cámara proteolítica para la localización de la captación de deuterio. Esta cámara proteolítica se lleva a cabo a pH bajo con el fin de apagar efectivamente la reacción de intercambio, y requiere una proteasa ácida inmovilizada con el fin de digerir la proteína en péptidos localizados (Figura 2). Supervisión de Exchange columna vertebral en milisegundos a escalas segunda vez es especialmente importante para lacaracterización de cambios conformacionales dentro de difícil caracterizar regiones de bucle, glóbulos fundidos, y proteínas intrínsecamente desordenadas (PDI) 13, 14. Alternativamente, tresi-HDX también se puede utilizar para caracterizar las proteínas que actualmente no tienen una estructura atómica resuelto a través de los métodos de cristalografía de rayos X y RMN, usando intercambio de deuterio acoplado al algoritmo de COREX (DX-COREX) enfoque 15, 16. Este protocolo detallado se aplicará tresi-HDX para estudiar tau, un desplazado interno, tanto en su forma nativa, así como su estado hiperfosforilada patógeno. Mientras que la TAU nativa es una de las PDI más bien estudiado, se sabe poco sobre su contraparte amiloidogénica 13.

<table><tbody><tr><td>Poli(metacrilato de metilo) o PMMA</td><td>Plásticos profesionales</td><td>SACR.250CCP</td><td>8,9 cm x 3,8 cm x 0,6 cm</td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de sílice fundido</td><td>Polymicro Technologies</td><td>106815-0018</td><td>ID: 75 &micro; m, OD: 150 y micro; m</td></tr><tr><td>Capilares metálicos</td><td>McMaster-Carr</td><td>28 ga &ndash; 89875K97 30 ga&nbsp; - 89875K99</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de etileno propileno fluorado (FEP)</td><td>IDEX</td><td>1477 1548</td><td>ID: 0.007", OD: 1/16" ID: 0.020", OD: 1/16"</td></tr><tr><td>Cortador de tubos de polímero estándar</td><td>IDEX</td><td>A-327</td><td>para 1/16" y 1/8" Tubo de diámetro exterior</td></tr><tr><td>T de mezcla microestática</td><td>IDEX</td><td>M-540</td><td>para 1/16" Tubo de diámetro exterior</td></tr><tr><td>o</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T de acero inoxidable, 0.25 &nbsp; mm Diámetro</td><td>Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td><td>ZT1C</td><td>para 1/16" T de PEEK de tubo de diámetro exterior</td></tr><tr><td>para 1/16" Tubo OD</td><td>IDEX</td><td>P-727</td><td></td></tr><tr><td>10-32 Hembra a Hembra Luer</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td></td></tr><tr><td>10-32 PEEK Tuerca de doble ala</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td></td></tr><tr><td>Casquillo para 1/16" Tubo de diámetro exterior</td><td>IDEX</td><td>F-142</td><td></td></tr><tr><td>Serie 100 Herramienta rotativa</td><td>Dremel</td><td>F013010001</td><td></td></tr><tr><td>Discos de corte</td><td>Jobmate</td><td></td><td>1/64" de espesor</td></tr><tr><td>Microscopio con zoom digital Stereomaster</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-411</td><td></td></tr><tr><td>Soldador</td><td>Mastercraft</td><td>58-6301-2</td><td></td></tr><tr><td>VersaLaser</td><td>Láser universal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringas</td><td>Hamilton</td><td>81220</td><td>500&nbsp; y micro; </td></tr><tr><td>Bombas de jeringa</td> de capacidad L <td>Aparato de Harvard</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte</td><td>><fuerte>Compañía</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa activada por el NHS Fisher</td><td>Scientific</td><td>26196</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina de la mucosa gástrica porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deuterio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-10X0.6ML</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7330-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Software/Herramientas en línea</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDraw X3</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calculadora</td><td></td> de Peso Molecular <td>versión 6.49</td><td>Herramienta MS de código abierto mMass</td></tr><tr><td></td><td></td><td>versión 5.5.0</td><td>Herramienta MS de código abierto</td></tr><tr><td>ExPASy FindPept</td><td>Instituto Suizo de Bioinformática</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software</td><td>versión 11.0</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; Versión</td><td>1.5.0.4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QStar Elite Hybrid Q-TOF Espectrómetro de masas</td><td>AB SCIEX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio espectrometría de masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y dinámica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

proteínas intrínsecamente desordenados (PDI) han sido durante mucho tiempo un reto para los biólogos estructurales debido a su falta de elementos de estructura secundaria estables. El hidrógeno-deuterio Exchange (HDX) medida en escalas de tiempo rápidas es especialmente adecuado para detectar estructuras y redes de enlaces de hidrógeno que están pobladas brevemente, lo que permite la caracterización de confórmeros transitorios en conjuntos nativos. El acoplamiento de HDX a espectrometría de masas ofrece varias ventajas clave, incluyendo una alta sensibilidad, bajo consumo de muestra y sin restricción en el tamaño de la proteína. Esta técnica ha avanzado mucho en las últimas décadas, incluyendo la capacidad de supervisar HDX tiempos de etiquetado en la escala de tiempo de milisegundos. Además, mediante la incorporación del flujo de trabajo HDX en una plataforma de microfluidos que aloja un microreactor proteasa ácida, somos capaces de localizar propiedades dinámicas en el nivel de péptido. En este estudio, resuelta en el tiempo de ionización por electrospray espectrometría de masas (tresi-MS) acoplado a HDX was utiliza para proporcionar una imagen detallada de la estructura residual en la proteína tau, así como los cambios conformacionales inducidos en la hiperfosforilación.

perfiles de digestión de nativo y fosfo-tau fueron similares, produciendo una secuencia de cobertura de 77,1 y 71,7%, respectivamente. valores de captación de deuterio de cada péptido se determinó mediante el ajuste de las distribuciones isotópicas observadas con las distribuciones teóricas generadas usando un software FORTRAN de desarrollo propio. Las mejores distribuciones de ajuste se muestran (Figura 3a), junto con los valores de captación de deuterio asociados. perf...

flexibilidad conformacional desempeña un papel crítico en la función de la proteína. En este documento, se describe el uso de la espectrometría de masas de ionización por electrospray resuelta en el tiempo junto con el intercambio de hidrógeno-deuterio para sondear los rápidos cambios estructurales que impulsan función en proteínas ordenadas y desordenadas.

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

La flexibilidad conformacional desempeña un papel fundamental en la función de las proteínas, y el objetivo general de la Espectrometría de Masas con Intercambio de Hidrógeno por Deuterio y Electroaspersión Resuelta en el Tiempo es investigar los cambios estructurales rápidos que impulsan la función en proteínas ordenadas y desordenadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología estructural, como la caracterización de conformaciones proteicas transitorias, algo que no es accesible para técnicas clásicas de alta resolución como la cristalografía de rayos X y la RMN. La principal ventaja de esta técnica es que permite monitorear reacciones a escala de tiempo de milisegundos, lo cual es importante para caracterizar bucles, molten globules y proteínas intrínsecamente desordenadas.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de trastornos neurodegenerativos, ya que estos frecuentemente implican el plegamiento incorrecto o la agregación de regiones de proteínas intrínsecamente desordenadas. Aunque este método puede proporcionar información sobre proteínas con estructuras débiles, también puede aplicarse a otros sistemas, como enzim

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Biochemistry

Bioquímica

Conformación de la proteína y la dinámica son claves para entender la relación entre estructura y función de proteínas. Intercambio de hidrógeno acoplada a espectrometría de masas de alta resolución es un método versátil para estudiar la dinámica conformacionales de proteínas, así como la caracterización de la proteína-ligando y proteína-proteína interacciones, incluidas las interfaces de contacto y los efectos alostéricos.

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

Aquí, presentamos protocolos detallados para la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio amida de estado sólido (ssHDX-MS) y la espectrometría de masas de marcado fotolítico de estado sólido (ssPL-MS) para proteínas en polvos sólidos. Los métodos proporcionan información de alta resolución sobre la conformación de proteínas y las interacciones en el estado sólido amorfo, que puede ser útil en el diseño de formulaciones.

Espectrometría de masas enfoque para estudiar la estructura de la proteína y las interacciones en liofilizadas Polvos

La arquitectura de complejos de la proteína es esencial para su función. Combinando varias técnicas de espectrometría de masa probado poderoso para el estudio de su montaje. Ofrecemos protocolos de reticulación química y espectrometría de masas nativa y mostrar cómo estas técnicas complementarias ayudan a dilucidar la arquitectura de los conjuntos de multi-subunidades de proteína.

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Espectrometría de masas (MS) se ha convertido en una herramienta importante para la investigación de la estructura y la dinámica de asambleas macromoleculares. Aquí, integramos los enfoques basados en la MS para interrogar la formación de complejos de proteína y de ligando.

Análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo

Las síntesis de lanthipeptide catalizan las reacciones multipaso durante la biosíntesis de productos naturales péptidos. Aquí, describimos un flujo de trabajo continuo, ascendente, de intercambio de hidrógeno-deuterio de espectrometría de masas (HDX-MS) que se puede emplear para estudiar la dinámica de conformación de las sintesis de lanthipeptide, así como otras enzimas similares implicadas en la biosíntesis de productos naturales péptidos.

Una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para investigar enzimas biosintéticas péptidos

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de intercambio de hidrógeno / deuterio (HDX) basado en electroforesis capilar junto con espectrometría de masas de arriba hacia abajo. Este enfoque caracteriza la diferencia en las estructuras de orden superior entre diferentes especies de proteínas, incluidas proteínas en diferentes estados y diferentes proteoformas, mediante la realización de HDX diferencial concurrente y separación electroforética.

Intercambio de hidrógeno/deuterio basado en electroforesis capilar para la caracterización conformacional de proteínas con espectrometría de masas de arriba hacia abajo

La espectroscopia de retrodispersión de neutrones ofrece un acceso no destructivo y sin etiquetas a la dinámica ps-ns de las proteínas y su agua de hidratación. El flujo de trabajo se presenta con dos estudios sobre proteínas amiloides: sobre la dinámica resuelta en el tiempo de la lisozima durante la agregación y sobre la dinámica del agua de hidratación de tau en la formación de fibra.

Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación

El conjunto estructural de la alfa-sinucleína monomérica afecta su función fisiológica y sus propiedades fisicoquímicas. El presente protocolo describe cómo realizar espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos y análisis de datos posteriores para determinar información conformacional sobre el monómero de esta proteína intrínsecamente desordenada en condiciones fisiológicas.

Espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos para el estudio de la dinámica estructural de la alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Aprenda a utilizar la espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio con ionización por electrospray resuelta en el tiempo para estudiar cambios estructurales rápidos en proteínas ordenadas e intrínsecamente desordenadas.

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