Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

La flexibilidad conformacional desempeña un papel fundamental en la función de las proteínas y el objetivo general de la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio por ionización por electropulverización resuelta en el tiempo es investigar los cambios estructurales rápidos que impulsan la función en proteínas ordenadas y desordenadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología estructural, como la cráterización de confirmaciones de proteínas transitorias, que no es mínima para las técnicas clásicas de alta resolución como la electrocistografía y la RMN. La principal ventaja de esta técnica es que las reacciones se pueden monitorear en una escala de tiempo de milisegundos, lo cual es importante para caracterizar crestas de bucles, Moltinglobyales y proteínas intrínsecamente desordenadas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de los trastornos neurodegenerativos. Ya que a menudo implican el plegamiento incorrecto o la agregación de regiones proteicas intrínsecamente desordenadas. Aunque este método puede proporcionar información sobre las proteínas estructuradas semanalmente, también se puede aplicar a otros sistemas, como las enzimas que experimentan un recambio catalítico o la caracterización de interacciones entre proteínas, proteínas y proteínas, liganos.

Para iniciar este procedimiento, se debe aplicar un láser a una placa a través de un canal de entrada para introducir los reactivos, una cámara de pro diálisis y un canal de salida, en un bloque PMM8 estándar, utilizando un grabador láser. Después de esto, corte un capilar de metal de acero inoxidable de calibre 30 en dos piezas de 10 centímetros con una herramienta rotativa para el disco de corte de 164 pulgadas de grosor. Use papel de lija para alisar el extremo de los capilares, lo que se puede facilitar al observar bajo un microscopio óptico.

Ahora, derrita esos capilares en el bloque PMM8 grabado con una plancha para pasear. Para construir un mezclador cinético de flujo continuo y resolución en el tiempo, inserte un capilar de vidrio cilicio fundido de 40 centímetros en un capilar metálico de acero de calibre 28 de aproximadamente 15 centímetros. A continuación, produzca una muesca de dos milímetros, utilizando configuraciones de grabador láser de baja potencia en un extremo del capilar de vidrio interno y selle este extremo del capilar de vidrio interno.

Este es un paso crítico que asegura una mezcla ortogonal y eficiente de la proteína, que sale a través de la muesca que es un deterior común. El espacio intercapilar de dos milímetros entre la muesca y el extremo del capilar es la mezcla y el volumen. Conecte los accesorios y manguitos de tubería del tamaño adecuado e incorpore un conector en T, que se utilizará para administrar deterio.

A continuación, alinee el capilar de vidrio interno con el extremo del capilar de metal, lo que se puede facilitar mediante la observación bajo un microscopio óptico. Márquela como la posición de cero milímetros. Conecte este mezclador cinético a un extremo de la T de mezcla. Luego conecte un capilar de vidrio de sílice fundida de 40 centímetros al extremo opuesto del mezclador cinético en la T de mezcla. Para la activación de la pepsina, suspenda 20 miligramos de pepsina de la mucosa gaseosa de Porsena en un mililitro de tampón de acoplamiento.

Agregue 50 miligramos de agro speeds activados por NHS a los productos resuspendidos y gire suavemente durante la noche, a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, centrifuga la mezcla a mil veces G durante dos minutos a temperatura ambiente para recoger la resina. A continuación, aspire los productos no unidos.

Después de esto, incube los agros en un mililitro de tampón de bloqueo y gírelos suavemente a temperatura ambiente durante una hora. Después de recoger la resina y aspirar el tampón de bloqueo, incubar la pepsina agguros con un mililitro de ácido acático al cinco por ciento durante cinco minutos. Girar la mezcla a 1.000 veces G, durante dos minutos a temperatura ambiente, para recoger la resina, luego aspirar la súper natent.

Después de repetir los pasos anteriores, durante un total de tres lavados, almacene las perlas en un mililitro de ácido acádico a cuatro grados centígrados para su uso a largo plazo. Para ensamblar el dispositivo, llene una cámara de protiálisis con una suspensión de perlas de pepsina agguros activadas en ácido acético al cinco por ciento usando una espátula estéril. Coloque la plataforma micro falítica de PMMA entre dos bloques de PMMA en blanco como cubierta para sellar el dispositivo, forrada con caucho de silicona para crear un sello hermético a los líquidos.

Utilice placas de sujeción metálicas para sellar a presión el dispositivo. A continuación, fije la T mezcladora a la entrada del dispositivo utilizando los accesorios adecuados. Ahora fluye un cinco por ciento de ácido acético a través de la línea de ácido a una velocidad de diez microlitros por minuto.

A continuación, fluya un tampón de ácido amoniaco de 50 milímetros a través de la línea de proteínas a una velocidad de un microlitro por minuto. Acople el dispositivo al extremo delantero de un espectrómetro de masas Qtof modificado con tiempo de vuelo cuadrapolar o Qtof, utilizando una etapa aislada ajustable para lograr condiciones óptimas de electropulverización. Después de establecer las condiciones ESI-MS, adquiera un espectro de pepsina solamente.

A continuación, introduzca de 50 a 100 micromoler de proteína tau o fosfo-tau a una velocidad de un microlitro por minuto, donde previamente fluía el tampón de acitato de amonio de 50 milímetros. Después de permitir que el sistema se equilibre durante al menos 10 minutos, antes de la adquisición, adquiera solo el espectro de proteínas. Mientras fluye el Tao, o proteína phospho tao, introduzca óxido de duterio a una velocidad de tres microlitros por minuto, a través del conector T, y permita que reaccione en el mezclador cinético.

Para aumentar el tiempo de etiquetado, retire manualmente la posición del capilar de vidrio interno para lograr tiempos de mezcla de 42 milisegundos a ocho segundos, lo que permite que el sistema se equilibre durante al menos 10 segundos entre cada retroceso. Esta animación muestra el flujo de trabajo de un experimento típico. La proteína sale a través de la muesca y se mezcla con el duterio que se aproxima.

Los hidrógenos M8 de la columna vertebral se intercambian durante el tiempo de reacción asignado, que se puede variar tirando hacia atrás del capilar de proteínas. A continuación, la reacción se apaga y se digiere en una plataforma microfluídica que contiene una aguja ESI de salida. El espectro resultante contiene proteínas digeridas.

El porcentaje de absorción de deuterio se calcula para péptidos individuales y luego se mapea en la estructura de la proteína 3D. Los perfiles de digestión de phospho-tau nativos fueron similares, produciendo una cobertura de secuencia de 77.1 y 71.7 por ciento, respectivamente, aquí se muestran las distribuciones isotópicas mejor ajustadas y los valores de absorción de deuterio asociados para cuatro péptidos simples. Para extraer la tasa experimental observada se utiliza el gráfico cinético observado del porcentaje de absorción de deuterio, en función del tiempo, para cada péptido.

Los perfiles aleatorios de quale calculados se muestran para la comparación y se utilizan para extraer el grado intrínseco teórico. Como era de esperar, no se observaron factores de protección en el rango, normalmente asociados con elementos de estructura secundarios, lo que confirma que la tau nativa exhibe enlaces de hidrógeno internos débiles. Se observa una protección significativa en los extremos N y C, el dominio central y las regiones propensas a la agregación.

En la tau hiperrelacionada con el fósforo, se observó un aumento general en la absorción de deuterio a través de la proteína. Hay aumentos significativos en los extremos N y C y en la región del hexapéptido dos. Los factores de grado de protección se colorean como un esquema de arco iris, como se muestra aquí.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas pocas horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar regiones de grado HPC, o superior, para minimizar los contaminantes, ya que pueden interferir con el análisis. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el marcaje covalente, la reticulación química, el modelado computacional y los docuestudios para hacer coincidir las estructuras tridimensionales de las proteínas, o confirmar las áreas de interacción entre las proteínas y las leginas.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural exploraran proteínas y dominios intrínsecamente desordenados, más comunes en las enfermedades nuerodegenerativas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la ionización por electrospray resuelta en el tiempo, el intercambio de hidrógeno y deuterio, la espectrometría de masas, para el estudio de la estructura y la dinámica de las proteínas.