Perfiles de expresión con microarreglos

Microarrays de DNA son utilizados para medir simultáneamente la expresión de muchos genes diferentes. Consisten en miles de puntas de prueba, cada uno representa un gen distinto, inmovilizada en "chips" o diapositivas y dependen de hibridación complementario para evaluar la expresión de genes en diferentes condiciones biológicas.

Este video cubre los principios básicos de la tecnología de microarrays, un protocolo de expresión génica utilizando microarrays y algunas aplicaciones actuales de perfiles.

Vamos a empezar por discutir los principios de la tecnología de perfilado y microarrays de expresión genética.

Uno de los primeros métodos desarrollados para evaluar la expresión del gen en muestras biológicas es Northern Blot, que consiste en "sondeo" para las moléculas específicas de ARN inmovilizada en las membranas. Sondas "Flotante" reconocen secuencias complementarias del RNA de la muestra y por lo general están marcadas con moléculas fluorescentes o radiactivas que pueden ser visualizados.

Avances en microfabricación, secuenciación del genoma y otras tecnologías han conducido al desarrollo de los biochips de microarrays. Como borrones norte, microarrays se basan en el principio de la Unión complementaria entre la sonda y la muestra secuencias de ácidos nucleicos. A diferencia de múltiples, sin embargo, en microarrays es las sondas de oligonucleótidos que se inmovilizan en un portaobjetos de vidrio o chip. Las muestras "flotante" se generan de RNA aislado de las células o los organismos de interés, que es revertir transcrito complementaria o "c"-ADN. Esto tampoco puede ser etiquetado directamente con moléculas fluorescentes o sus cantidades pueden amplificarse aún más por en vitro de la transcripción en cRNA. La muestra entonces cruzado por hibridación al chip. Porque las sondas en microarrays diseñados para diferentes aplicaciones pueden ser "sentido", que significa que sus secuencias son en la misma dirección de un organismo expresada ARN o "antisentido", los investigadores deben garantizar que la direccionalidad de la cadena de la muestra complementaria a la de las sondas.

Los datos de intensidad de fluorescencia "raw" para cada punto gene-específico en la viruta se pueden cuantificar y procesados. Los datos pueden ser sometidos a otras pruebas estadísticas, como la prueba t de estudiante, para determinar si las señales de la fluorescencia y así los niveles de expresión — para un gen de interés son significativamente diferentes entre los dos tipos de células o condiciones experimentales.

Los investigadores también pueden utilizar estos datos para "cluster" o grupo de genes basados en patrones similares de expresión. Por ejemplo, al comparar los patrones de expresión entre dos poblaciones celulares, ciertos genes pueden encontrarse para demostrar cambios de expresión de cantidades más o menos equivalentes en la misma dirección y así ser agrupados juntos. Los investigadores pueden representar estas relaciones en un diagrama de árbol o "dendrograma" donde se indican alturas y los arreglos de «ramas» cómo similares — o disímiles — patrones de expresión génica son. Este tipo de análisis puede proporcionar la penetración en redes de genes, como genes "agrupados" podrán participar en el mismo caminos biológicos.

Ahora que hemos analizado los principios de la metodología de microarrays, echemos un vistazo a un experimento de microarray típico.

Para asegurar la calidad del RNA aislado, espacios de trabajo y equipo deben ser tratados con productos químicos que inactivan RNasas, enzimas que de lo contrario destruiría RNA. El ARN es entonces aislado de muestras de interés y purificado, y su concentración y su integridad se determinan por espectrofotometría.

Este RNA de la muestra se convierte a cDNA y cRNA. A continuación, marcados con moléculas fluorescentes y fragmentado, y su calidad y cantidad puede otra vez comprobarse, momento en el cual la medida de las etiquetas fluorescentes también puede ser evaluada.

El cRNA etiqueta entonces se mezcla con "solución de hibridación" antes de cargar en un microarray. Para facilitar la hibridación exitoso, una "mezcla" se coloca sobre el chip para formar "cámaras de hibridación". La mezcla de hibridación se añade lentamente en la matriz. Debe tenerse cuidado para evitar burbujas de aire, ya que pueden interferir con el enlace de la muestra a regiones específicas en el microarray y resultar en una señal negativa falsa. Una vez que la muestra se añade, chips se incuban a la temperatura adecuada para un máximo de 24 horas.

Después de la hibridación, el mezclador se retira de la viruta, muestra se lava y la matriz se seca completamente por centrifugación en una centrifugadora especializada, diapositivas-explotación. La viruta seca se introduce en un scanner de microarrays y la máquina se ajusta de modo que las señales más brillantes observadas en un chip no están demasiado saturadas. El microarray entonces se escanea, y produce una imagen de la viruta entera.

Una vez que el chip ha sido analizado, el archivo de imagen es cargado en el software de extracción de datos y evaluaron las irregularidades de la señal. Datos extraídos de la imagen de microarray se somete a una serie de manipulaciones estadísticas, incluida la transformación de₂ log, que permite a los investigadores representar numéricamente datos en términos de plegado aumenta o disminuye en la expresión génica; así como la normalización, que explica las diferencias de señal entre los chips de microarray. Este procesa datos pueden luego ser analizado más.

Ahora que hemos demostrado cómo se realiza el perfil de expresión con microarrays, echemos un vistazo a cómo microarrays puede utilizarse en experimentos específicos.

Los investigadores a menudo emplean micromatrices para evaluar cómo cambia de expresión génica a través de un proceso biológico, como la diferenciación celular. Aquí, los científicos evaluaron los niveles de microRNAs, que son 22-nucleotide que RNAs pequeño involucrados en afinar la expresión génica, en tres tipos de células humanas que representan diferentes etapas de desarrollo de la retina. Comparando la expresión de microRNA entre estas células, los investigadores fueron capaces de identificar genes potencialmente implicados en el desarrollo y diferenciación del tejido retiniano.

Microarrays puede utilizarse también para evaluar las diferencias de expresión entre las diferentes células o tipos de tejidos. En este experimento, se estableció un modelo roedor de trastorno de estrés postraumático, o TEPT, al exponer a ratas a descargas eléctricas. Se recolectaron las neuronas de regiones cerebrales diferentes y RNA fue aislado. Microarrays de entonces fueron utilizados para identificar la expresión diferencial de genes asociados a las mitocondrias en las neuronas, proporcionando la penetración en los complejos mecanismos moleculares detrás de PTSD.

Finalmente, los investigadores son también aplicando microarrays para estudios de cáncer, con la esperanza de esa nueva enfermedad biomarcadores pueden ser identificados. Como resultado de infecciones por los virus a lo largo de nuestra evolución, genomas humanos contienen secuencias genéticas virales denominadas "retrovirus endógenos" o ERV, algunas de las cuales sigue activamente se expresan. Aquí, la expresión de ERV en los tejidos de próstata normales y cancerosas se compararon mediante microarrays. Este método permitió a los investigadores a identificar varios ERV que se alza en el cáncer de próstata, haciéndolos potenciales biomarcadores que pueden utilizarse para diagnosticar la enfermedad.

Sólo has visto video de Zeus sobre la expresión génica mediante microarrays de perfiles. Este video cubre los principios básicos de la tecnología de microarrays, un protocolo para la expresión de perfiles y aplicaciones de esta técnica. ¡Como siempre, gracias por ver!