Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes
22 de mayo de 2017
La investigación del tráfico de membranas es crucial para entender las funciones neuronales. Aquí, se introduce un método para la cuantificación de la motilidad vesicular en las neuronas. Este es un método conveniente que puede adaptarse a la cuantificación del tráfico de membranas en el sistema nervioso.
El objetivo general de este análisis de imágenes es observar la motilidad de las vesículas en neuronas y cuantificarla de manera sencilla. Este enfoque permite analizar el tráfico de membranas en neuronas de forma directa y eficiente en cuanto al tiempo. Para comenzar este procedimiento, transfiera el útero a una nueva placa de Petri con etanol al 70 %.
A continuación, transfiera el útero a otra placa de Petri con HBSS. Luego retire los fetos del útero utilizando pinzas de disección y tijeras quirúrgicas esterilizadas. Después, colóquelos en una nueva placa de Petri con HBSS.
Bajo un microscopio estereoscópico, retire la piel y los cráneos y extraiga los cerebros utilizando pinzas de disección esterilizadas. Luego, transfiera los cerebros a otra placa de Petri con HBSS. Retire las meninges utilizando pinzas de disección esterilizadas.
Luego recorte las regiones adicionales. A continuación, transfiera las cortezas a una nueva placa de Petri con HBSS. Recoja todas las cortezas utilizando un gotero desechable o una pipeta de 25 mililitros y colóquelas en un tubo de 15 mililitros.
A continuación, retire el HBSS mediante pipeteo. Luego, agregue tres mililitros de solución enzimática del cortex cerebral al tubo que contiene los córtices. Coloque el tubo en un baño de agua e incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos.
A continuación, agregue otros tres mililitros de solución enzimática del cortex cerebral al tubo que contiene los cortex y incúbelos a 37 grados Celsius en un baño de agua durante cinco minutos adicionales. Pasados cinco minutos, retire la solución enzimática del cortex cerebral y agregue cinco mililitros de DMEM que contenga 10% de suero bovino fetal. Disocie los cortex pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de cinco mililitros con una punta estéril P1000.
Luego, aspire nuevamente las cortezas utilizando una pipeta de cinco mililitros con una punta P200. Coloque un filtro de células de nailon de 40 micrómetros sobre un tubo de 50 mililitros y filtre la suspensión para eliminar los restos. Posteriormente, centrifugue la suspensión a 420 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente y luego retire el medio DMEM.
A continuación, agregue cinco mililitros de medio de cultivo del cortex cerebral y resuspenda suavemente el pellet celular. Luego, cuente las células utilizando un hemocitómetro y ajuste la concentración celular utilizando el medio de cultivo del cortex cerebral. A continuación, siembre tres veces 10 a la seis neuronas corticales en dos mililitros de suspensión celular para cada placa de vidrio de fondo plano de 35 mililitros codificada.
En este procedimiento, mezcle cuatro microgramos de plásmido con 200 microlitros de medio sin suero. En un tubo aparte, diluya ocho microlitros del reactivo de transfección en 200 microlitros de medio sin suero. Luego, incube la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de cinco minutos, mezcle la solución de plásmido y la solución del reactivo de transfección e incube la mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue la mezcla a las placas codificadas con fondo de vidrio. Incube las neuronas a 37 grados Celsius durante 30 minutos.
A continuación, sustituya el medio por dos mililitros de medio de cultivo de corteza cerebral e incube las neuronas a 37 grados Celsius durante uno o dos días. Para la obtención de imágenes, utilice un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD y objetivos de 40X. Mantenga la temperatura a 37 grados Celsius utilizando un sistema de incubación.
Adquiera imágenes de neuronas a razón de un cuadro cada cinco segundos durante un período de 100 segundos controlado por el software de adquisición de imágenes. Para analizar las imágenes, abra todas las imágenes secuenciales en el software ImageJ con Seguimiento Manual. Para combinar las imágenes secuenciales, seleccione Imagen, luego Pilas, seguido de Imágenes a Pila y luego haga clic en Aceptar. Después de eso, seleccione Complementos y luego Seguimiento Manual.
Aparecerá una ventana de seguimiento. Haga clic en la casilla de verificación Mostrar parámetros y defina los parámetros de seguimiento en la sección Parámetros. Luego, haga clic en Agregar seguimiento para iniciar un nuevo seguimiento.
Después de determinar las vesículas de interés, haga clic en el centro de las señales en las imágenes secuenciales para registrar las coordenadas xy. Repita este procedimiento para recopilar las coordenadas xy de las vesículas en todas las imágenes secuenciales; cada imagen avanza automáticamente a la siguiente tras seleccionar el punto de referencia. Esta imagen muestra la movilidad de las vesículas que contienen LAMP-EGFP en las dendritas de neuronas corticales de ratón después de dos días de transfección, iniciada a los cuatro días in vitro (DIV).
El recuadro muestra la imagen de lapso de tiempo de las vesículas positivas para LAMP-EGFP. La punta de flecha roja indica una vesícula en movimiento y la punta de flecha azul indica una vesícula en reposo. Las puntas de flecha naranjas indican señales fluorescentes más intensas.
Aquí se muestra la posición en el eje X dependiente del tiempo de las vesículas positivas para LAMP-EGFP. La vesícula en el círculo rojo, etiquetada como b, se está moviendo, y la vesícula en el círculo azul, etiquetada como a, está en reposo. Este gráfico de barras indica la distancia total del movimiento de LAMP-EGFP.
Y este gráfico de barras indica la distancia media de movilidad de las vesículas que contienen LAMP-EGFP.
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Resumen
Este estudio presenta un método para cuantificar la motilidad de vesículas en neuronas, lo cual es esencial para comprender las funciones neuronales. El enfoque permite un análisis sencillo del tráfico de membranas en el sistema nervioso.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Tráfico de membranas
Antecedentes
- El tráfico de membranas es fundamental para la función neuronal.
- La motilidad de las vesículas desempeña un papel clave en este proceso.
- Comprender estos mecanismos puede proporcionar información sobre la salud neuronal.
- Los métodos actuales para cuantificar el movimiento de vesículas suelen ser complejos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método práctico para cuantificar la motilidad de vesículas.
- Facilitar el análisis del tráfico de membranas en neuronas.
- Mejorar la comprensión de las funciones neuronales mediante metodologías mejoradas.
Métodos Utilizados
- Análisis de imágenes para observar la motilidad de las vesículas.
- Transferencia de muestras biológicas a medios adecuados para su análisis.
- Uso de herramientas esterilizadas para el manejo de muestras.
- Procedimientos eficientes en el tiempo para la cuantificación.
Resultados principales
- El método permite una cuantificación sencilla de la motilidad de vesículas.
- Proporciona un enfoque directo para analizar el tráfico de membranas.
- Los resultados pueden contribuir a una mejor comprensión de las funciones neuronales.
- Aplicaciones potenciales en diversas áreas de investigación en neurociencia.
Conclusiones
- Este método simplifica el estudio de la motilidad de vesículas en neuronas.
- Puede adaptarse para diversas aplicaciones en neurociencia.
- Investigaciones futuras pueden basarse en este enfoque para explorar la salud neuronal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación de la motilidad de vesículas proporciona información fundamental sobre los mecanismos de tráfico de membranas que influyen en la salud neuronal y en los fenotipos de enfermedades. Este método permite la validación temprana de objetivos al vincular la dinámica subcelular con resultados funcionales en modelos de neurodegeneración. El enfoque respalda la confianza predictiva en cribados preclínicos al ofrecer lecturas cuantitativas y reproducibles del transporte vesicular en sistemas neuronales relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición de la motilidad de endosomas y lisosomas como indicadores funcionales de la salud neuronal.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la cuantificación estandarizada del movimiento de vesículas en modelos celulares relevantes para la enfermedad.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al correlacionar defectos de motilidad con vías mecanicistas en trastornos neuronales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona mediciones cuantitativas de la distancia y la velocidad de la motilidad para el cribado de compuestos en neuritas y soma.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad del ensayo mediante el seguimiento basado en ImageJ con parámetros definidos e imágenes de lapso de tiempo.
- Escalabilidad: Compatible con múltiples tipos celulares, incluidos fibroblastos y células endoteliales, lo que permite su reutilización en distintas plataformas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con estrategias traslacionales de biomarcadores al vincular la dinámica de vesículas con la supervivencia neuronal y la función sináptica.
- Valor operativo: Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante lecturas consistentes de la motilidad en diferentes modelos.
- Reducción de riesgos: Orienta decisiones de avance ajustadas al riesgo al identificar compuestos que corrigen los defectos de tráfico intracelular.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar datos cuantitativos de motilidad que informan sobre la interacción con el blanco y la modulación de vías en sistemas neuronales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación del movimiento de vesículas como indicador funcional de la integridad del tráfico de membranas.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante protocolos estandarizados de imagen y seguimiento para el análisis de vesículas dependiente del tiempo.
- Análisis: Genera métricas de distancia de movilidad y movimiento promedio que permiten análisis comparativos entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al vincular los defectos en el transporte vesicular con los mecanismos de enfermedades neurodegenerativas.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma de imagen reutilizable aplicable a diversas líneas celulares neuronales y no neuronales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad en los vínculos mecanicistas entre defectos de tráfico y fenotipos neuronales.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante análisis basado en complementos y parámetros de seguimiento definidos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos objetivos y cuantitativos sobre la interacción con el objetivo en las vías de motilidad de vesículas.
- Impacto en la cartera: Permite una priorización ajustada al riesgo mediante la identificación de compuestos que modulan la dinámica endosoma-lisosoma en modelos de enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo neuronal, transfección y microscopía de fluorescencia para la marcación e imagen precisa de vesículas.
- Depende de la plataforma ImageJ con el complemento Manual Tracking y capacidades de procesamiento secuencial de imágenes.
- Necesita la estandarización de la eficiencia de transfección, los intervalos de adquisición de imágenes y los parámetros de seguimiento entre experimentos.
- La adaptación a diferentes líneas celulares puede requerir la optimización de la expresión del marcador y de las mediciones basales de motilidad.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de la eficiencia de transfección y la posible fototoxicidad durante la adquisición prolongada de imágenes de lapso de tiempo.
