Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes
22 de mayo de 2017
La investigación del tráfico de membranas es crucial para entender las funciones neuronales. Aquí, se introduce un método para la cuantificación de la motilidad vesicular en las neuronas. Este es un método conveniente que puede adaptarse a la cuantificación del tráfico de membranas en el sistema nervioso.
El objetivo general de este análisis de imagen es observar la motilidad de las vesículas en las neuronas y cuantificarla fácilmente. Este enfoque permite analizar el tráfico de membranas en las neuronas de una manera sencilla y eficaz en el tiempo. Para comenzar este procedimiento, transfiera el útero a una nueva placa de Petri con 70% de etanol.
A continuación, transfiera el útero a otra placa de Petri con HBSS. A continuación, extraiga los fetos del útero con pinzas de disección esterilizadas y tijeras quirúrgicas. Después de eso, colóquelos en una nueva placa de Petri con HBSS.
Bajo un microscopio estereoscópico, extraiga la piel y los cráneos y extraiga los cerebros con las pinzas de disección esterilizadas. Luego, transfiéralos a otra placa de Petri con HBSS. Retire las meninges con pinzas de disección esterilizadas.
A continuación, recorta las regiones adicionales. A continuación, transfiera las cortezas a una nueva placa de Petri con HBSS. Recoja todas las cortezas con un gotero desechable o una pipeta de 25 mililitros y colóquelas en un tubo de 15 mililitros.
A continuación, retire el HBSS pipeteando. A continuación, añade tres mililitros de solución de enzimas corticales cerebrales al tubo que contiene las cortezas. Coloque el tubo en un baño de agua e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Después de eso, agregue otros tres mililitros de solución de enzimas corticales cerebrales en el tubo que contiene las cortezas e incube a 37 grados centígrados en un baño de agua durante cinco minutos adicionales. Después de cinco minutos, retire la solución de enzimas corticales cerebrales y agregue cinco mililitros de DMEM que contenga un 10% de suero bovino fetal. Disocie las cortezas pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de cinco mililitros con una punta P1000 estéril.
A continuación, vuelva a pipetear las cortezas con una pipeta de cinco mililitros con punta P200. Coloque un colador de celdas de nailon de 40 micrómetros en un tubo de 50 mililitros y filtre la suspensión para eliminar los desechos. A continuación, centrifugar la suspensión a 420 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente y, a continuación, retirar el medio DMEM.
A continuación, añada cinco mililitros de medio de cultivo cortical cerebral y vuelva a suspender suavemente el pellet celular. A continuación, se cuentan las células con un hemocitómetro y se ajusta la concentración celular con el medio de cultivo cortical cerebral. A continuación, coloque tres veces 10 a las seis neuronas corticales en dos mililitros de suspensión celular para cada placa con fondo de vidrio codificada de 35 mililitros.
En este procedimiento, mezcle cuatro microgramos de plásmido con 200 microlitros de medio libre de suero. En un tubo separado, diluya ocho microlitros del reactivo de transfección en 200 microlitros de medio libre de suero. Luego, incube la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de cinco minutos, mezcle la solución de plásmido y la solución de reactivo de transfección e incube la mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, agregue la mezcla a los platos con fondo de vidrio codificado. Incuba las neuronas a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Después, reemplace el medio con dos mililitros de medio de cultivo cortical cerebral e incube las neuronas a 37 grados centígrados durante uno o dos días. Para la obtención de imágenes, utilice un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD con lentes de objetivo de 40X. Mantenga la temperatura a 37 grados centígrados utilizando un sistema de incubación.
Adquiera imágenes neuronales en un fotograma cada cinco segundos durante un período de 100 segundos controlado por el software de adquisición de imágenes. Para analizar las imágenes, abra todas las imágenes secuenciales en el software ImageJ con seguimiento manual. Para combinar las imágenes secuenciales, elija Imagen, luego Pilas, seguido de Imágenes para apilar y, a continuación, haga clic en Aceptar. Después de eso, elija Complementos y luego Seguimiento manual.
Aparecerá una ventana de seguimiento. Haga clic en la casilla de verificación de Mostrar parámetros y defina los parámetros de seguimiento en la sección Parámetros. A continuación, haga clic en Añadir pista para iniciar una nueva pista.
Después de determinar las vesículas de interés, haga clic en el centro de las señales en las imágenes secuenciales para registrar las coordenadas xy. Repita este procedimiento para recopilar las coordenadas xy de las vesículas de todas las imágenes secuenciales, cada imagen avanza automáticamente a la imagen sucesiva después de seleccionar el punto de referencia. Esta imagen muestra la motilidad de las vesículas que contienen LAMP-EGFP en las dendritas de las neuronas corticales del ratón después de dos días de transfección, iniciada a las cuatro DIV.
El recuadro muestra la imagen de lapso de tiempo de las vesículas positivas para LAMP-EGFP. La punta de flecha roja indica una vesícula en movimiento y la punta de flecha azul indica una vesícula en reposo. Las puntas de flecha naranjas indican señales fluorescentes más altas.
Esta es la posición del eje X dependiente del tiempo de las vesículas positivas de LAMP-EGFP. La vesícula en el círculo rojo, etiquetada como b, se está moviendo y la vesícula en el círculo azul, etiquetada como a, está en reposo. Este gráfico de barras indica la distancia total del movimiento de LAMP-EGFP.
Y este gráfico de barras indica la distancia de motilidad promedio de un LAMP-EGFP que contiene vesículas.
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Resumen
Este estudio presenta un método para cuantificar la motilidad de vesículas en neuronas, lo cual es esencial para comprender las funciones neuronales. El enfoque permite un análisis sencillo del tráfico de membranas en el sistema nervioso.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Tráfico de membranas
Antecedentes
- El tráfico de membranas es fundamental para la función neuronal.
- La motilidad de las vesículas desempeña un papel clave en este proceso.
- Comprender estos mecanismos puede proporcionar información sobre la salud neuronal.
- Los métodos actuales para cuantificar el movimiento de vesículas suelen ser complejos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método práctico para cuantificar la motilidad de vesículas.
- Facilitar el análisis del tráfico de membranas en neuronas.
- Mejorar la comprensión de las funciones neuronales mediante metodologías mejoradas.
Métodos Utilizados
- Análisis de imágenes para observar la motilidad de las vesículas.
- Transferencia de muestras biológicas a medios adecuados para su análisis.
- Uso de herramientas esterilizadas para el manejo de muestras.
- Procedimientos eficientes en el tiempo para la cuantificación.
Resultados principales
- El método permite una cuantificación sencilla de la motilidad de vesículas.
- Proporciona un enfoque directo para analizar el tráfico de membranas.
- Los resultados pueden contribuir a una mejor comprensión de las funciones neuronales.
- Aplicaciones potenciales en diversas áreas de investigación en neurociencia.
Conclusiones
- Este método simplifica el estudio de la motilidad de vesículas en neuronas.
- Puede adaptarse para diversas aplicaciones en neurociencia.
- Investigaciones futuras pueden basarse en este enfoque para explorar la salud neuronal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación de la motilidad de vesículas proporciona información fundamental sobre los mecanismos de tráfico de membranas que influyen en la salud neuronal y en los fenotipos de enfermedades. Este método permite la validación temprana de objetivos al vincular la dinámica subcelular con resultados funcionales en modelos de neurodegeneración. El enfoque respalda la confianza predictiva en cribados preclínicos al ofrecer lecturas cuantitativas y reproducibles del transporte vesicular en sistemas neuronales relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición de la motilidad de endosomas y lisosomas como indicadores funcionales de la salud neuronal.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la cuantificación estandarizada del movimiento de vesículas en modelos celulares relevantes para la enfermedad.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al correlacionar defectos de motilidad con vías mecanicistas en trastornos neuronales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona mediciones cuantitativas de la distancia y la velocidad de la motilidad para el cribado de compuestos en neuritas y soma.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad del ensayo mediante el seguimiento basado en ImageJ con parámetros definidos e imágenes de lapso de tiempo.
- Escalabilidad: Compatible con múltiples tipos celulares, incluidos fibroblastos y células endoteliales, lo que permite su reutilización en distintas plataformas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con estrategias traslacionales de biomarcadores al vincular la dinámica de vesículas con la supervivencia neuronal y la función sináptica.
- Valor operativo: Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante lecturas consistentes de la motilidad en diferentes modelos.
- Reducción de riesgos: Orienta decisiones de avance ajustadas al riesgo al identificar compuestos que corrigen los defectos de tráfico intracelular.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar datos cuantitativos de motilidad que informan sobre la interacción con el blanco y la modulación de vías en sistemas neuronales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación del movimiento de vesículas como indicador funcional de la integridad del tráfico de membranas.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante protocolos estandarizados de imagen y seguimiento para el análisis de vesículas dependiente del tiempo.
- Análisis: Genera métricas de distancia de movilidad y movimiento promedio que permiten análisis comparativos entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al vincular los defectos en el transporte vesicular con los mecanismos de enfermedades neurodegenerativas.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma de imagen reutilizable aplicable a diversas líneas celulares neuronales y no neuronales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad en los vínculos mecanicistas entre defectos de tráfico y fenotipos neuronales.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante análisis basado en complementos y parámetros de seguimiento definidos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos objetivos y cuantitativos sobre la interacción con el objetivo en las vías de motilidad de vesículas.
- Impacto en la cartera: Permite una priorización ajustada al riesgo mediante la identificación de compuestos que modulan la dinámica endosoma-lisosoma en modelos de enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo neuronal, transfección y microscopía de fluorescencia para la marcación e imagen precisa de vesículas.
- Depende de la plataforma ImageJ con el complemento Manual Tracking y capacidades de procesamiento secuencial de imágenes.
- Necesita la estandarización de la eficiencia de transfección, los intervalos de adquisición de imágenes y los parámetros de seguimiento entre experimentos.
- La adaptación a diferentes líneas celulares puede requerir la optimización de la expresión del marcador y de las mediciones basales de motilidad.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de la eficiencia de transfección y la posible fototoxicidad durante la adquisición prolongada de imágenes de lapso de tiempo.
