3: Análisis sobre la metilación del ADN

La metilación del ADN es una modificación química del ADN que afecta a la expresión génica en diferentes contextos celulares. Muchos investigadores están interesados en el mecanismo y las funciones de este proceso, ya que la metilación aberrante del ADN se ha asociado con enfermedades como el cáncer.

En este video, cubriremos los principios detrás de la metilación del ADN y los métodos para detectarla. A continuación, exploraremos un protocolo general para uno de estos métodos, el análisis de bisulfito, y algunas aplicaciones de esta técnica.

Primero, echemos un vistazo a qué es la metilación del ADN y cómo se puede detectar.

Durante este proceso bioquímico, una célula agrega una etiqueta química conocida como grupo metilo a las bases de citosina en su ADN. La mayoría de las citosinas metiladas se encuentran junto a las bases de guanina en la misma cadena de ADN, y estos nucleótidos adyacentes, y el enlace fosfodiéster que los une, se denominan "CpGs". Aunque la mayoría de los CpG de los vertebrados están metilados, los que no están metilados tienden a ocurrir juntos en las "islas" de CpG. cerca de los promotores de los genes expresados activamente, y varios otros elementos de la secuencia reguladora.

La forma en que los cambios en la metilación del ADN contribuyen a la regulación génica sigue siendo un tema de intensa investigación. La metilación de las islas CpG parece ser importante para el silenciamiento génico estable y a largo plazo que se observa en procesos epigenéticos como la impronta genómica, que es la expresión específica del progenitor de origen de ciertos genes, así como la inactivación del cromosoma X, el silenciamiento de uno de los dos cromosomas X en cada célula de mamíferos hembra. También se ha demostrado que la represión de genes críticos debido a la metilación aberrante de las islas CpG contribuye al crecimiento celular descontrolado, lo que puede conducir al cáncer. Desde el punto de vista mecánico, la metilación del ADN puede contribuir al silenciamiento de genes, ya sea evitando que los factores de transcripción se asocien con los promotores o reclutando proteínas que modifican las histonas y remodelan la cromatina en un estado transcripcionalmente no permisivo.

Existen varios métodos para detectar el estado de metilación del ADN.

Una técnica, el ensayo HELP, involucra dos endonucleasas de restricción llamadas HpaII y MspI, que escinden respectivamente solo secuencias CCGG no metiladas, o ambas metiladas y no metiladas. Al comparar los patrones de digestión producidos por estas dos enzimas, se puede deducir el estado de metilación del ADN.

Otro método, llamado inmunoprecipitación de ADN metilado o ? MeDIP,? utiliza anticuerpos que se unen a las citosinas metiladas para enriquecer las secuencias de ADN metiladas.

Por último, el análisis de bisulfito se utiliza para distinguir la citosina metilada de la no metilada en el ADN, mediante la realización de una reacción química que convierte la citosina no metilada en uracilo. Después de esta conversión, el ADN tratado con bisulfito puede someterse a PCR, secuenciarse y compararse con un genoma de referencia. Las citosinas no metiladas son las que están presentes en la referencia, pero reemplazadas por timinas después del análisis de bisulfito y la PCR. Al someter el ADN tratado con bisulfito a espectrometría de masas, los investigadores también pueden crear "epigramas de metilación". que representan linealmente diferentes CpG en el genoma y representan el grado de metilación en cada una de ellas. Tales epigramas son particularmente útiles si los investigadores desean comparar los patrones de metilación entre diferentes tipos de células.

Echemos ahora un vistazo en profundidad al protocolo para el análisis de bisulfito.

Para empezar, se añade hidróxido de sodio a las preparaciones de ADN genómico, que luego se incuban a 95 °C. Esto desnaturaliza el ADN y hace que sus bases sean accesibles a las reacciones químicas posteriores. A continuación, se introduce metabisulfito de sodio en la mezcla de ADN desnaturalizado y se producen dos pasos de reacción química. Durante el primer paso, la sulfonación, se agrega un grupo sulfito a una citosina no metilada para formar sulfonato de citosina. Luego, durante la desaminación hidrólica, se elimina un grupo amino del sulfonato de citosina para generar sulfonato de uracilo.

Para facilitar estas primeras etapas de la reacción química, la preparación del ADN se recubre con aceite mineral, que evita la evaporación y ayuda a mantener la concentración de metabisulfito de sodio. Luego, la reacción se incuba a los 55? C en la oscuridad. Durante este paso, también se agrega a la mezcla un agente para evitar la oxidación, como el quinol.

Para recolectar ADN modificado que contiene sulfonato de uracilo y no aceite mineral, la mezcla se centrifuga y se recupera la capa líquida más baja. A continuación, se purifica el ADN de esta solución.

A continuación, se añade hidróxido de sodio a la mezcla de ADN, que luego se incuba a 37 °C. Esto se hace para inducir la desulfonación, que, como habrás adivinado, elimina el grupo sulfito del sulfonato de uracilo, formando uracilo y completando la reacción química.

Finalmente, la mezcla se neutraliza con la adición de acetato de amonio y el ADN se recoge por precipitación de etanol. Una vez que el ADN convertido en bisulfito se ha purificado, se somete a PCR y secuenciación.

Ahora que hemos discutido la técnica básica para el análisis de bisulfito, veamos algunas aplicaciones experimentales.

Algunos investigadores utilizan el análisis de bisulfito para investigar la impronta genómica. Aquí, los investigadores cruzaron dos cepas de Arabidopsis con diferencias genéticas, de modo que se pudo distinguir el ADN materno y paterno. A continuación, se compararon los patrones de metilación en los embriones resultantes y el endospermo asociado, o el tejido que sostiene el embrión. Usando este método, los científicos encontraron que las CpG en el alelo materno de un gen que codifica proteínas, MEA, tendían a ser metiladas en los embriones pero no metiladas en el endospermo, lo que indica una impronta específica del tejido.

Otros investigadores están utilizando esta técnica para comprender cómo los factores ambientales o sociales pueden alterar los patrones de metilación. Aquí, las crías de ratón fueron separadas de sus madres para inducir estrés, y sus tejidos cerebrales fueron posteriormente aislados. Tras la secuenciación del ADN tratado con bisulfito, los científicos determinaron que los patrones de metilación en un gen que codifica hormonas, AVP, cambiaban en una región específica del cerebro en ?separados? pupos, lo que sugiere un posible mecanismo molecular para los efectos biológicos a largo plazo de la experiencia de vida temprana.

Finalmente, muchos investigadores están tratando de optimizar el análisis de bisulfito para facilitar la comparación de los patrones de metilación entre células individuales y únicas. Aquí, los investigadores modificaron el método de análisis de bisulfito para que todos los pasos se realizaran en ovocitos de ratón individuales incrustados en agarosa, lo que ayudó a proteger contra la pérdida de ADN. Con este método, los investigadores pudieron identificar fácilmente muestras de un solo ovocito que habían sido contaminadas con otras células mediante la búsqueda de aquellas que daban múltiples patrones de metilación.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre análisis sensibles a la metilación. Aquí, hemos discutido el papel que juega la metilación del ADN en la regulación de genes, los métodos que los investigadores utilizan para identificar regiones metiladas en el genoma, un protocolo generalizado para el análisis de bisulfito y, finalmente, algunas aplicaciones de esta técnica. Como siempre, ¡gracias por mirar!