Name: La inducción de la mesenquimales-epitelial Transitions en células de sarcoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende a inducir transiciones mesenquimales-epiteliales en células de sarcoma usando microRNA-200 y GRHL2. Este método reproducible permite estudiar redes regulatorias génicas y fenotipos asociados a la plasticidad celular en cáncer.

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JAS reconoce el apoyo del Instituto del Cáncer de Duke, El Laboratorio de Oncología genitourinario Universidad de Duke, y el Departamento de Ortopedia de la Universidad de Duke. HL fue apoyada por la National Science Foundation (NSF) Centro de Física Biológica Teórica (NSF PHY-1427654) y NSF DMS-1361411, y como CPRIT Académico (Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Texas) en la Investigación del Cáncer del Estado de Texas en la Universidad Rice. KEW fue apoyado por el NIH F32 CA192630 MKJ y HL benefició de discusiones útiles con Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta, y Donald S. Coffey.

1. Preparación de los reactivos <ol><li> Preparar DMEM para el cultivo celular mediante la adición de 50 ml de suero fetal bovino (FBS) y 5 ml de penicilina-estreptomicina (5000 U / ml) a 500 ml de DMEM. Este medio se puede almacenar a 4 ° C durante hasta seis meses. </li><li> Resuspender cebadores liofilizado en agua libre de nucleasa a una concentración final de 10? M. cebadores de las tiendas re-suspendieron a -20 ° C. </li><li> Preparar tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio al 0,5%, 0,1% SDS, Tris 50 mM, pH 8,0). Suplemento con cóctel inhibidor de proteasa antes de usar y mantener tampón en hielo cuando está en uso. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar 10 mg / ml de polibreno (bromuro de hexadimetrina) en el filtro de agua y la jeringa para esterilizar utilizando un filtro de polietersulfona 0,45 m. Solution se puede almacenar a 4 ° C durante hasta seis meses. </li><li> Preparar una solución de 1 mg / mL de trabajo de cloruro de tetrazolio azul nitro disolviendo 10 mg en 10 ml de PBS. Almacenar a 4 ° C.</li></ol> 2. Lentiviral Transducción de GRHL2 Día 1 <ol><li> Placa 3 x 10 5 células HEK293T por pocillo de una placa de 6 pocillos en 2 ml de DMEM suplementado. Cuantificar las células utilizando un contador de células automatizado. Las células deben ser 40 - 60% confluentes después de cultivo durante la noche a 37 ° C con 5% de CO2. </li></ol> Dia 2 <ol start="2"><li> Diluir 2 g de vector vacío (pCMV-UBC-EGFP) o 2 g de pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24, 25 en 200 l de medio libre de suero junto con 1,8 g de pΔ8.9 y 0,2 g de pCMV-VSV plásmidos auxiliares -G. En un tubo separado, se diluye 4 l de un reactivo de transfección basado en lípidos en 200 l de medio libre de suero por transfección (8 l en 400! L para dos muestras). Añadir 200? L de mezcla de reactivo de transfección a cada solución de plásmido y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Durante el Incubadorasción, lavar las células HEK293T retirando el medio por aspiración al vacío y aclarado células con 1 ml de PBS. Sustituir el PBS con 800 l de medio libre de suero. Después de 20 min, añadir 200 l de reactivo de transfección: mezcla de plásmido de la etapa 2.2 gota a gota a cada pocillo e incubar las células durante 2 horas a 37 ° C en 5% de CO2. </li><li> Retire cuidadosamente medio de transfección por aspiración al vacío y reemplazar con 2 ml de DMEM suplementado. Devolver las células a la incubadora para cultivo de una noche. NOTA: Las células HEK293T son poco adheridos. reemplazo de los medios de comunicación debe ser realizado con precaución para limitar la eliminación de las células de la parte inferior del plato o frasco. </li></ol> Día 3 <ol start="5"><li> Actualizar los medios de comunicación en las células HEK293T transfectadas y la placa 3 x 10 5 células RD por pocillo de una placa de 6 pocillos en 2 ml de DMEM suplementado. células de cultivo durante la noche. células RD son una línea celular de rabdomiosarcoma humano comercialmente disponible. </li></ol> Día 4 </p&gt; <ol start="6"><li> Recoger los medios de comunicación viral a partir de células HEK293T. Pipetear los medios DMEM de las células HEK293T y lugar en un nuevo 15 ml cónico. Vuelva a colocar cuidadosamente con los nuevos medios DMEM y las células HEK293T lugar atrás en la incubadora para el día siguiente. </li><li> Añadir 2 l de 10 mg / ml de polibreno por ml de medios de comunicación virales en dos nuevos tubos cónicos de 50 ml (una para la transfección del vector vacío y otro para la transfección GRHL2). filtro de jeringa de medios de comunicación viral mediante la eliminación del émbolo de una jeringa de 3 ml y adjuntar un filtro de 0,45 micras polietersulfona a la punta. <ol><li> Añadir los medios de comunicación virales recogidos en el paso 2.6 en el barril de la jeringa, y hundir los medios de comunicación en los nuevos tubos cónicos de 50 ml que contenían polibreno. Retire el medio de las células RD por aspiración al vacío y añadir medios viral se filtró a células RD. </li></ol></li></ol> día 5 <ol start="8"><li> Día 4. células HEK293T repetidas pueden ser desechados después de los medios de comunicación viral que se ha recogido. </li></ol> día 7 </strong&gt; <ol start="9"><li> Lavar las células RD con 1 ml de PBS y añadir 200? l de tripsina al 0,05% por pocillo. Incubar a 37 ° C durante 5 min, añadir 2 ml de medio suplementado, y mover suspensión celular a un nuevo 15 ml cónico. Centrifugar las células a 250 xg durante 5 min a temperatura ambiente y los medios de aspiración. Resuspender en 1 ml de DMEM (suplementado con 5% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina). NOTA: El uso de un mayor porcentaje de FBS puede causar la obstrucción durante la citometría de flujo <ol><li> células de filtro para citometría de flujo. Utilizar una pipeta para aplicar la suspensión de células ml RD 1 a través de un filtro de 30 micras en citometría de flujo tubos y Colocar los tubos en hielo. </li><li> Ordenar EGFP + células 26 en 1,5 tubos de microcentrífuga ml que contenían 0,5 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y lugar en hielo. Plate EGFP + células en total de 1 ml de DMEM suplementado ordenadas en un solo pocillo de una placa de 12 pocillos y el lugar en la incubadora para cultivo. ; NOTA: El rendimiento de las células eGFP + de citometría de flujo después de este transducción es por lo general bajas (50.000-100.000 células). Las células pueden necesitar ser cultivado durante 10 - 14 días antes de proceder al paso 3. </li></ol></li></ol> 3. La transfección inversa de miR-200 <ol><li> Preparar 50 M existencias de miR-200 imita utilizando libre de nucleasa H 2 poblaciones de O. alícuotas y almacenar a -20 ° C para evitar ciclos de congelación / descongelación repetidos. </li><li> Añadir 3 l de cada 50? M miR-200 imitador (miR-200a, miR-200b, y miR-200c) a 300 l de medio libre de suero o 9 l de 50! M miARN de control negativo a medio libre de suero 300 mL. </li><li> Añadir 6 l de reactivo de transfección-siRNA a 600 l de medio libre de suero y dividir 300! L de esta mezcla en dos tubos, uno para cada una de las dos mezclas de miR de la etapa 3.2. Combinar los 300! L de cada mezcla de miR de la etapa 3.2 con una mezcla de 300 l de reactivo de transfección. Incubar durante 20 min a te habitaciónmperatura. </li><li> Mientras que la incubación, preparar una suspensión celular de 600.000 células EGFP + RD que expresan EV o GRHL2 creado en la Sección 2 en 2,4 ml (250 células / ml) de medio libre de suero por tratamiento. </li><li> En una placa de 24 pocillos, añadir 100 l por pocillo de miR-200 de mezcla o mezcla de control negativo de la etapa 3.3 en seis pozos, y a continuación, añadir 400 l de cada suspensión de células en tres pocillos de cada mezcla de MIR. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la noche y cambiar los medios de comunicación a suplementado totalmente DMEM al día siguiente. Recoger las células 2 días más tarde para el análisis utilizando el tampón apropiado (véase más adelante). Time-lapse de las células del sarcoma RD sometidos a MET está disponible como material suplementario. Imagen cada pocillo cada 2 h con un objetivo de 10X utilizando un generador de imágenes en vivo de células automatizado 27. </li></ol> extracción 4. ARN, la transcripción inversa, y qPCR <ol><li> Extraer ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando un estándar de ARNkit de extracción 24. ARN extraído se puede almacenar a -80 ° C. </li><li> Cuantificar la concentración de ARN. Descongelar y trabajar con ARN en hielo. Para cuantificar las concentraciones de ARN, medir la absorbancia UV a 260 nm con un espectrofotómetro lector de placas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Diluir todas las muestras a la concentración más baja con agua libre de nucleasa. </li><li> Realizar la transcripción inversa del ARN total en ADN complementario (ADNc). Combinar no menos de 100 ng de ARN total con tampón de PCR, mezcla de dNTP (100 mM), cebadores hexámeros aleatorios, la transcriptasa inversa y agua libre de nucleasa en un volumen de reacción de 20! L 24. Ejecutar ciclos de RT de acuerdo con el protocolo del fabricante. cDNA se puede almacenar a largo plazo a -20 ° C. </li><li> Diluir 20 reacciones mu l a 100 l con 80 l de nucleasa libre de H 2 O. </li><li> Mezclar 5 l de un colorante intercalante basado en la fluorescencia 2x qPCR mezcla maestra, 0,06 l de cada cebador 10? M, unand 2 l de reacción RT diluida por muestra. </li><li> Ejecutar qPCR de acuerdo con el protocolo del fabricante para la mezcla maestra basada en fluorescencia. </li><li> Cuantificar cantidades relativas de mRNA por el método CT delta y normalizar a GAPDH. Trazar la expresión de ARNm de media de réplicas biológicas ± desviación estándar para cada grupo de tratamiento. NOTA: precauciones especiales deben tomarse cuando se trabaja con RNA para evitar el contacto con RNasas, tales como el uso de plásticos y reactivos libres de RNasa. equipo no desechable debe ser tratada antes de su uso para eliminar RNasas. </li></ol> 5. La tinción de inmunofluorescencia <ol><li> Después de la etapa 3.6, los medios de aspirado por la aspiración por vacío a partir de las células RD en el formato de 24 pocillos. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 500 l de paraformaldehído al 4% (PFA) por pocillo e incubar durante 15 min a temperatura ambiente (RT). Después de la fijación, las células de lugar en tampón fosfato salino (PBS) y se almacena a 4 ° C durante la noche si es necesario. </li><li> permeabilizarcélulas mediante la adición de 500 l de PBS + 0,2% de Triton-X100 e incubar 30 min a TA. Por la aspiración al vacío, eliminar el tampón de permeabilización y lavar tres veces con PBS. </li><li> Bloque en 500 l de 5% de albúmina de suero bovino (BSA) / PBS y se incuban las células durante 30 min a RT. Las células se pueden almacenar a 4 ° C durante la noche si es necesario. </li><li> Prepare la dilución de anticuerpo primario. Pipetear 200 l de 5% de BSA / PBS por pocillo en una cónica 15 ml (12 pozos = 2,4 ml) y añadir 1 l de anticuerpo primario por ml de 5% BSA / PBS necesario. Eliminar el tampón de bloqueo por aspiración al vacío y dispensar 200 l de anticuerpo primario diluido a cada pocillo. <ol><li> Se incuban las células en 1: 1.000 diluidas anticuerpos primarios en 5% de BSA / PBS durante 1 h a RT o durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación, lavar las células dos veces con PBS. </li></ol></li><li> Preparar la dilución de anticuerpo secundario en el mismo volumen de 5% BSA / PBS como anteriormente. Añadir el anticuerpo secundario conjugado con colorante rojo lejano usando una dilución 1: 2000. Además añadir1 mg / ml de Hoechst colorante a la mezcla. Retire el PBS y añadir 200? L de la mezcla a cada pocillo. <ol><li> Incubar a TA durante 1 h en la oscuridad. Lavar 3 veces con PBS, dejar las células en PBS, y proteger las células de la luz usando papel de aluminio. Las células se pueden almacenar a 4 ° C si es necesario. </li></ol></li><li> células de imagen a la ampliación total de 400X en un microscopio de epifluorescencia invertido con longitud de onda de excitación de 594 a 650 nm. </li></ol> 6. Transferencia Western <ol><li> Lavar las células de 3,6 dos veces con PBS enfriado en hielo. En hielo, las células se lisan con 50 l de 1x tampón RIPA suplementado con 1x cóctel inhibidor de proteasa. </li><li> lisados ​​de roca en 4 ° C durante 15 min, recogen los lisados ​​en tubos de 1,5 ml, y se centrífuga a alta velocidad (20.000 xg) durante 5 min para aclarar las muestras. Los lisados ​​celulares se pueden almacenar a largo plazo a -80 ° C si es necesario. </li><li> Cuantificar la proteína total usando un ensayo de Bradford y alícuota una cantidad igual de proteína en nuevos 1,5 tubos de microcentrífuga ml. Bring de muestras a igual volumen usando tampón RIPA y tampón de carga 3x Laemmli suplementado con 2-mercaptoetanol. </li><li> Incubar las muestras en tampón de carga de muestra 1x Laemmli durante 5 min a 95 ° C y ejecutar SDS-PAGE usando un 4-12% de gel de Tris-glicina a 200 V durante 45 min. La cantidad de rangos cargadas de proteína, dependiendo de la línea celular. En algunos casos, se necesita 50-100 g de proteína total para detectar E-cadherina en líneas de células mesenquimales. </li><li> proteínas de transferencia a una membrana de nitrocelulosa durante 2 horas a 50 V en tampón de transferencia 1x Tris-glicina. </li><li> membrana Bloquear durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C en un tampón de bloqueo a base de BSA. </li><li> Diluir los anticuerpos primarios a 1: 1000 de concentración en 5 ml de tampón de bloqueo, añadir la dilución a la membrana, y se incuba con agitación suave durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. membrana Lavar 3 veces en PBS con 0,05% de Tween-20. </li><li> Incubar las membranas durante 1 h a TA con secondar fluorescente acoplado infrarrojosy anticuerpo a 1: 20.000 de dilución en tampón de bloqueo como anteriormente. </li><li> Lavar la membrana dos veces en PBS con 0,05% de Tween-20 y, a continuación una vez en PBS. </li><li> membrana de imágenes con detección de fluorescencia de infrarrojos estándar. </li></ol> 7. Ensayos de crecimiento independiente de anclaje NOTA: Para un protocolo de ensayo de agar blando detallada, consulte 28. <ol><li> Warm medios 2x DMEM estéril a 42 ° C en baño de agua caliente. Durante este tiempo, el calor pre-autoclave 1% de agarosa en el microondas durante 3 min. Microondas durante 30 s en un momento en que sea necesario o hasta que esté completamente derretido. Mueva de agarosa para un baño de agua C 42 °. </li><li> Colocar un tubo cónico de 50 ml en un vaso de precipitados con 42 ° C de agua en una campana estéril y mezclar 1% de agarosa y los medios 2x DMEM en una relación 1: 1 de contabilidad para 1,5 ml de mezcla por pocillo en una placa de 6 pocillos. Siempre prepare adicional DMEM / agarosa para dar cuenta de error de pipeteado y para evitar burbujas. </li><li> Añadir a la mezcla deparedes del pozo, asegurando que no se formen burbujas y dejar reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Mientras que la capa inferior está solidificando, preparar cada grupo de células RD transfectadas en el paso 3 mediante la aspiración de los medios y lavar una vez con 1 ml de PBS. Aspirar PBS y añadir 0,2 ml de tripsina al 0,05% y se incuba a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Neutralizar la tripsina en 0,8 ml de medio y células de triturado para formar una suspensión de una sola célula. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Contar las células y calcular el volumen de la suspensión celular requerida para 10.000 células por pocillo. </li><li> Calentar 0,6% de agarosa en el microondas durante 3 min, seguido de 30 s en un momento hasta que esté completamente fundido. Mueva de agarosa a 42 ° C baño de agua. </li><li> Colocar un tubo cónico de 50 ml en un vaso de precipitados con 42 ° C de agua en una campana estéril. Mezclar 0,6% de agarosa y la suspensión celular diluida en una proporción de 1: 1 para preparar 1,5 ml de mezcla por pocillo en una placa de 6 pocillos. Siempre prepare suspensión celular extra / agarosa mezclar para dar cuenta de error de pipeteado ypara evitar burbujas. NOTA: Es importante trabajar a 42ºC aquí. Si la temperatura es demasiado baja, la mezcla se solidifique antes de chapado, y temperaturas superiores a 42 ° C afectará a la viabilidad celular. </li><li> Mezclar bien por trituración células varias veces y añadir mezcla de células a los pocillos, asegurándose de no formar burbujas, y dejar solidificar durante 20 min a TA. </li><li> Añadir 2 ml de medio suplementado a cada pocillo y mover las placas a la incubadora. <ol><li> Cambiar los medios de comunicación una vez por semana durante 3-4 semanas o hasta que las colonias multicelulares forman. Tenga cuidado de no tocar el agar al retirar los medios por aspiración al vacío. Alternativamente, utilizar un P1000 para eliminar la capa superior de medios líquidos. </li><li> Teñir placas de agar suave mediante la adición de solución de cloruro de 200 l de Nitro azul tetrazolio (1 mg / ml en PBS) e incubar la placa durante la noche a 37 ° C. Reemplazar los medios de comunicación al día siguiente con PBS para la imagen. </li><li> pozos de imagen a 40X aumento total en un microscopio invertido. </li><li> Realizar análisis de ImageJ para el área de la colonia y el número. Parcela número medio de colonias de réplicas biológicas ± desviación estándar. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los sarcomas son cánceres raros, pero altamente agresivas de un linaje mesenquimal. A pesar de su linaje mesenquimal, un subconjunto de sarcomas parece experimentar una transición fenotípica a un estado más epitelial-similares. Este interruptor MET-como tiene relevancia pronóstica, ya que los pacientes con más tumores epiteliales como son menos agresivos 24. A pesar de su importancia clínica, hay pocos estudios sobre los mecanismos moleculares de conducción estas transiciones fenotípicas en sarco...

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Shenghan Xu
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Shengnan Xu

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Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

plasticidad fenotípica se refiere a una transición reversible entre fenotipos celulares, y es comúnmente dividido en dos tipos, epitelial-a-mesenquimal (EMT) transiciones y transiciones-mesenquimal-a epitelial (MET). Esta plasticidad fenotípica juega un papel importante en los procesos normales de los organismos multicelulares, como el desarrollo y la cicatrización de la herida 1; sin embargo, estas mismas vías y programas de expresión génica también pueden conducir a la enfermedad, tales como fibrosis (revisado en 2, 3, 4) y metástasis de carcinoma (revisado en las referencias 5, 6, 7, 8). Durante la metástasis, por ejemplo, EMT interrumpe la polaridad celular, interacciones célula-célula, y promueve la invasión 9, 10. En conjunto, contribuyen EMTs de un estado fenotípico que facilitan la divulgación de las células cancerosas. Además, EMT también conduce a una serie de otras alteraciones fenotípicas que impulsan un fenotipo agresivo, incluyendo la desregulación del metabolismo de la célula de cáncer 6, el desarrollo de resistencia a los medicamentos 11, 12, mayor capacidad tumor-iniciación 13, 14 y el anfitrión de la evasión inmune 15. plasticidad fenotípica se ha estudiado bien en la progresión del carcinoma; sin embargo, sarcomas también exhiben plasticidad fenotípica. Curiosamente, parece como si algunos de los mismos controladores de plasticidad fenotípica en los carcinomas también contribuyen a la plasticidad del sarcoma y agresividad. Por ejemplo, se ha demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) de pacientes con sarcoma de expresar EpCAM, una proteína de superficie celular que se encuentra típicamente en las células epiteliales 16. Addicionalmente, 250 muestras de sarcoma de tejido blando se clasificaron como de tipo epitelial o mesenquimal-como basado en la expresión génica. Los pacientes de la firma biomarcador epitelial tuvieron un mejor pronóstico que los pacientes con la firma biomarcador mesenquimal 17. Esto es coherente con muchos carcinomas, en los que los pacientes con más carcinomas epiteliales-como tienen mejores resultados en comparación con los pacientes con más tumores mesenquimales-como 18. Mientras que algunos sarcomas muestran biomarcadores y vías de expresión génica consistentes con MET, las bases moleculares de esta plasticidad fenotípica siguen siendo poco conocidos. Para estudiar los mecanismos y los conductores de MET en el sarcoma hemos desarrollado un modelo de inducción MET utilizando dos factores-epiteliales específica, el microRNA (MIR) -200 familia y Grainyhead-como 2 (GRHL2). El MIR-200 son una familia de pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión génica mediante la unión a los 3&#39; UTRs de messenger ARN y la prevención de traducción en proteína. La familia miR-200 se compone de dos subgrupos - uno que contiene miR-141 y miR-200a, y el otro incluyendo miR-200b, miR-200c, y miR-429. Los miembros de la familia miR-200 se enriquecen en tejidos epiteliales, y la pérdida de miR-200 se asocia con metástasis en carcinomas 19. La familia miR-200 también es downregulated en sarcomas de tejidos blandos en comparación con el tejido normal 20. Al igual que en los miR-200, GRHL2 es un regulador clave que es importante para el desarrollo del epitelio 21. El factor de transcripción GRHL2 actúa de dos formas de regular por incremento genes epiteliales, tales como E-cadherina: 1) en las células epiteliales, GRHL2 directamente reprime el regulador maestro EMT, ZEB1 22; y 2) GRHL2 activa directamente la transcripción de genes epiteliales 23. Nuestras investigaciones anteriores han demostrado que la expresión combinada de miR-200 y GRHL2 en las células del sarcomainduce un fenotipo MET-como 24. A continuación, presentamos un protocolo detallado para crear un modelo in vitro de la inducción de MET en células de sarcoma usando la expresión ectópica de miR-200 y GRHL2.

<table><tbody><tr><td>Contador automatizado Countess</td><td>Life technologies AMQAX1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Termociclador</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR microplaca</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Kit de qPCR universal rápido</td><td>KAPA Biosystems TAMPÓN</td> de bloqueo de bloque de arranque (PBS) <td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>Tampón de bloqueo basado en BSA</td></tr><tr><td>Agarosa de uso general LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón Tris/Glicina/SDS</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0732</td><td>Tampón de funcionamiento</td></tr><tr><td>10x Tampón Tris/Glycine</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>Tampón</td></tr><tr><td>de transferencia TAMPÓN RIPA Tampón</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 &mu; m nitrocelulosa</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep Kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías DPBS</td><td>Life</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA</td><td>Tecnologías de vida</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Tecnologías</td><td>de vida 11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina ARNi Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA mimic control negativo #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life technologies</td><td>11088-021</td><td>medios sin suero</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Ecadherina</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta actina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>anti-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>anti-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>anti-conejo AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa y los fosfatos</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color</td><td>Bio-Rad Laboratorios Inc</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>30 &mu; m filtro para flujo</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>Ecadherin-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr><tr><td>Ecadherin-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCTCCGAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>tetrazolio azul nitro&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>bromuro de hexadimetrina</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>polibrene</td></tr><tr><td>3 mL Jeringa</td><td>BD Bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa estéril</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno de 5 ml de fondo redondo</td><td>352063</td><td></td><td>tubos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td><td>Thermo Fisher</td><td>4368814</td><td>kit de transcripción inversa</td></tr><tr><td>4% paraformaldyhído</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

la inducción de la mesenquimales-epitelial transitions en células de sarcoma

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

plasticidad fenotípica se refiere a un fenómeno en el que las células transitoriamente adquieren rasgos de otro linaje. Durante la progresión de carcinoma, la plasticidad fenotípica impulsa la invasión, la difusión y la metástasis. De hecho, mientras que la mayoría de los estudios de plasticidad fenotípica han sido en el contexto de los carcinomas epiteliales derivadas, resulta que los sarcomas, que son de origen mesenquimal, también exhiben plasticidad fenotípica, con un subconjunto de los sarcomas de someterse a un fenómeno que se asemeja a un mesenchymal- transición epitelial (MET). Aquí, hemos desarrollado un método que comprende la familia miR-200 y Grainyhead-como 2 (GRHL2) para imitar este fenómeno MET-como observados en paciente sarcoma samples.We expresan secuencialmente GRHL2 y la familia miR-200 usando la transducción de células y transfección, respectivamente , para entender mejor las bases moleculares de estas transiciones fenotípicas en células de sarcoma. células de sarcoma que expresan de miR-200 y GRHL2 demostraron mejorada, ambie epitelialics en la morfología celular y la alteración de epiteliales y mesenquimales biomarcadores. Futuros estudios utilizando estos métodos se pueden utilizar para comprender mejor las consecuencias fenotípicas de procesos MET-como en células de sarcoma, como la migración, invasión, la propensión metastásica, y resistencia a la terapia.

Esquema para la inducción de MET en células de sarcoma Una línea de tiempo general para la inducción de cambios MET-como en células de sarcoma se muestra en la Figura 1. El protocolo comienza por transducción de GRHL2 (Figura 1A), seguido de transfección de la familia miR-200 (Figura 1B). miembros de la familia GRHL2 o miR-200 no fueron capaces de afectar la apariencia de las cél...

Presentamos aquí un método de cultivo celular para inducir transiciones mesenquimales-epitelial (MET) en células de sarcoma en base a la expresión ectópica combinado de miembros de la familia microRNA-200 y Grainyhead-como 2 (GRHL2). Este método es adecuado para una mejor comprensión del impacto biológico de la plasticidad fenotípica de la agresividad del cáncer y los tratamientos.

La inducción de la mesenquimales-epitelial Transitions en células de sarcoma

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las consecuencias fenotípicas de las transiciones mesénquima-epitelio en los sarcomas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre por qué los sarcomas con características epiteliales tienen resultados superiores en comparación con aquellos sarcomas que son más similares al mesénquima. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un medio sencillo y reproducible para estudiar las redes reguladoras génicas descendentes y los fenotipos asociados con las transiciones mesénquima-epitelio en los sarcomas.Al comprender mejor la plasticidad fenotípica en los sarcomas, esperamos identificar intervenciones terapéuticas que nos permitan desplazar a los sarcomas hacia un estado epitelial más indolente. Realizarán el procedimiento dos estudiantes universitarios de nuestro laboratorio, Jackson Xu y Shivee Gilja. En el primer día de la transducción, siembre tres veces diez a la quinta células HEK293T en cada uno de dos pozos de una placa de seis pozos, en dos mililitros de DMEM suplementado.Incube la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Después de cultivar durante la noche, examine las células bajo un microscopio. Deben estar entre un 40 y un 60% confluentes.A continuación, en tubos separados que contienen 200 microlitros de medio sin suero con 1,8 microgramos de p delta 8.9 y 0,2 microgramos de plásmidos auxiliares pCMV-VSV-G, diluir dos microgramos del vector vacío y dos microgramos del vector que contiene GRHL2. En otro tubo, diluir cuatro microlitros de un reactivo de transfección basado en lípidos en 200 microlitros de medio sin suero por transfección. Esto será ocho microlitros y 400 microlitros para dos muestras.Añada 200 microlitros de la mezcla del reactivo de transfección a cada solución de plásmido y luego incube las muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, utilice un aspirador al vacío para eliminar el medio de las células HEK293T. Lave las células una vez con un mililitro de PBS y luego sustituya el PBS con 800 microlitros de medio sin suero.Después de 20 minutos, agregue 400 microlitros de la mezcla de plásmido con reactivo de transfección gota a gota a cada pocillo de las células sembradas. Incube el recipiente durante dos horas a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono. Tras la incubación, retire cuidadosamente el medio de transfección mediante aspiración al vacío.Las células HEK293T son débilmente adherentes, por lo que al aspirar el medio, tenga cuidado de no remover las células del fondo del plato o frasco. Reemplace el medio aspirado con dos mililitros de DMEM suplementado. Devuelva las células al incubador para un cultivo nocturno.Al día siguiente, renueve el medio en las células HEK293T transfectadas y siembre tres veces diez a la quinta células RD de rabdomiosarcoma humano en cada pocillo de una placa de seis pocillos que contenga dos mililitros por pocillo de DMEM suplementado. Incube ambas placas durante la noche. Al cuarto día, utilice una pipeta para recoger el medio viral de las células HEK293T y transfiéralo a dos nuevos tubos cónicos de 15 mililitros, uno para el lentivirus que contiene un vector vacío y otro para el lentivirus que contiene el plásmido GRHL2.Cambie cuidadosamente el medio por DMEM nuevo y coloque las células HEK293T de vuelta en el incubador durante la noche. A continuación, agregue dos microlitros de polibreno al 10 miligramos por mililitro por cada mililitro de medio vírico en dos tubos cónicos nuevos de 50 mililitros, uno para la transfección con vector vacío y otro para la transfección con GRHL2. Retire el émbolo de una jeringa de tres mililitros y conecte un filtro de poliéter sulfona de 0,45 micrómetros a la punta de la jeringa.Agregue el medio vírico recolectado previamente al interior del cilindro de la jeringa e insértila en uno de los nuevos tubos cónicos de 50 mililitros que contienen polibreno. Repita este paso con la otra muestra. Luego, retire el medio de las células RD mediante aspiración al vacío y agregue dos mililitros de cada una de las muestras de medio vírico filtrado a pozos separados de la placa de células RD.Incubar las células RD a 37 grados Celsius en un incubador humedecido. Al día siguiente, repetir la recogida del medio vírico y añadir el medio de infección a los mismos pocillos que contienen las células RD previamente infectadas. Las células HEK293T pueden descartarse después de haber recogido el medio vírico.Incube las células durante dos días más. En el séptimo día, lave las células RD con un mililitro de PBS y luego agregue 200 microlitros de tripsina al 0,05% a cada pocillo. Incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos.Agregue dos mililitros de medio suplementado y luego transfiera la suspensión celular a nuevos tubos cónicos de 15 mililitros. Centrifugue las células a 250 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspire el medio y re-suspenda las células en un mililitro de DMEM suplementado con 5% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.Para filtrar las células en preparación para citometría de flujo, utilice una pipeta para aplicar la suspensión de células RD de un mililitro a través de un filtro estéril de 30 micrómetros en tubos para citometría de flujo. Coloque los tubos en hielo. Mediante un citómetro de flujo, separe las células positivas para EGFP en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros que contengan 0,5 mililitros de DMEM suplementado con 10 % de FBS y 1 % de penicilina-estreptomicina.Coloque las células ordenadas nuevamente en hielo. Siembre las células positivas para EGFP provenientes de las transducciones con vector vacío y con GRHL2 en un volumen total de un mililitro de DMEM suplementado en pozos separados de una placa de 12 pozos. A continuación, coloque las células en el incubador para su cultivo.El rendimiento de células positivas para EGFP tras la citometría de flujo suele ser bastante bajo, en el rango de 50.000 a 100.000 células. Debido a esto, puede ser necesario cultivar las células durante un período adicional de 10 a 14 días antes de pasar al siguiente paso. En un tubo de microcentrífuga, añada tres microlitros de cada mimético de miR-200 de 50 micromolar a 300 microlitros de medio sin suero.En un tubo aparte, agregue nueve microlitros de microARN de control negativo de 50 micromolar a 300 microlitros de medio libre de suero. A continuación, en otro tubo de microcentrifugado, agregue seis microlitros de reactivo de transfección específico para siARN a 600 microlitros de medio libre de suero. Divida 300 microlitros de esta mezcla en dos tubos, uno para cada una de las dos mezclas de miR.Combine 300 microlitros de cada mezcla de miR con una mezcla de 300 microlitros de reactivo de transfección. Incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, prepare una suspensión celular de 600.000 células RD positivas para EGFP que expresen el vector MD o GRHL2 en 2,4 mililitros con 250 células por microlitro de medio sin suero por tratamiento.En una placa de 24 pocillos, agregue 100 microlitros por pocillo de la mezcla de miR-200 o de la mezcla control negativo en seis pocillos. Luego, agregue 400 microlitros de cada suspensión celular en tres pocillos de cada mezcla de miR. Incube la placa a 37 grados Celsius en un ambiente con 5% de dióxido de carbono durante la noche.Al día siguiente, cambie el medio a DMEM completamente suplementado. Recolecte las células dos días después para su análisis utilizando el tampón adecuado. Imagine cada pocillo cada dos horas con un objetivo de 10X utilizando un sistema automatizado de imagen en tiempo real para células vivas.Estas imágenes de lapso de tiempo muestran la transición mesenquimal-epitelial, o MET, en células RD que expresan GRHL2, EGFP y miARNs miR-200. Las células cambian de una forma alargada a una apariencia tipo adoquín, con aumento de las adhesiones célula a célula y una morfología más redondeada. No se observa MET en otras condiciones de tratamiento.En cambio, las células presentan una morfología alargada con forma de huso y pocas uniones célula a célula. Durante la inducción de la MET, el cambio morfológico en las células RD tras la sobreexpresión de GRHL2 y miR-200 se acompañó de una regulación positiva del marcador epitelial E-cadherina, medida mediante qPCR e inmunotransferencia. La adición de miR-200 reguló positivamente la E-cadherina por sí sola, pero la sobreexpresión combinada de miR-200 y GRHL2 potenció sinérgicamente la expresión de E-cadherina.Como se demostró mediante microscopía de inmunofluorescencia, hubo un aumento en las uniones entre célula y célula de las moléculas de adhesión epitelial, EpCAM y TJP-1, indicado por las flechas blancas. La sobreexpresión de proteínas epiteliales fue acompañada por la subexpresión de los genes mesenquimales ZEB1 y Notch1 mediante qRT-PCR. La inducción del MET redujo el crecimiento independiente del anclaje de las células RD, medido mediante ensayos de crecimiento en agar blando.La inhibición del crecimiento en agar blando fue impulsada únicamente por los miR-200, ya que la sobreexpresión de GRHL2 provocó un aumento en el crecimiento independiente del anclaje. Esto es consistente con informes previos que muestran que la expresión de GRHL2 induce crecimiento independiente del anclaje. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, incluyendo ensayos para medir cambios en la migración celular, invasión, metástasis y respuesta a la terapia, con el fin de elucidar las consecuencias fenotípicas del MET en los sarcomas.

induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un método directo se describe para la inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en una variedad de tipos de células. Se incluyen métodos para el análisis de células en estados EMT por inmunocitoquímica.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

De ingeniería tisular matriz nativa derivado de fibroblastos es un nuevo instrumento para generar un sustrato del estroma que apoya la proliferación de células epiteliales y la diferenciación. Aquí se presenta un protocolo de aplicación de esta metodología para evaluar el impacto de los diferentes tipos de células del estroma en la biología de las células tumorales.

Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

Se ha demostrado que la regulación alternativa del empalme contribuye a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Aquí describimos un método que utiliza un modelo de EMT inducible para la detección de empalme alternativo durante EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Aquí, describimos el desarrollo y la aplicación de un ensayo de contracción en gel para evaluar la función contráctil en células mesenquimales que experimentaron una transición epitelio-mesenquimatosa.

Desarrollo de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la función contráctil de las células mesenquimales que la transición epitelio-mesenquimal Sufrió

La transición epitelial a mesenquimal (EMT) permite que los cánceres se vuelvan invasivos. Para investigar la EMT, se describe un modelo in vitro basado en células madre neurales (NSC) desprovisto de suero y enzimas. Este sistema estandarizado permite la evaluación cuantitativa y cualitativa de la migración celular, la expresión génica y proteica. El modelo es adecuado para el descubrimiento de fármacos.

Un modelo enzima y Cultura Neural Stem Cell libre de suero para la EMT Investigación Adecuado para el descubrimiento de fármacos

Inyección directa de vesículas extracelulares derivadas de cáncer (EVs) conduce a la reprogramación de la médula ósea apoyando la progresión del tumor; sin embargo, está claro que las células median este efecto. Adjunto, describimos un protocolo paso a paso para investigar EV-mediada de células madre tumorales mesenquimales (MSC) interacciones en vivo, revelando un papel crucial para MSCs EV-educado en metástasis.

Un modelo de ratón preclínica de Osteosarcoma a definir la comunicación mediada por vesículas extracelular entre Tumor y las células madre mesenquimales

Describimos un protocolo detallado para el aislamiento de células que inician tumores de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma humano mediante la clasificación celular activada por fluorescencia, utilizando el antígeno leucocito humano-1 (HLA-1) como marcador negativo, y para la validación y caracterización de estas células que inician tumores HLA-1 negativos.

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

Se describe un protocolo para la inducción en vitro de transición endotelio-mesénquima (EndMT), que es útil para la investigación de vías de señalización celulares involucradas en EndMT. En este modelo experimental, EndMT es inducida por el tratamiento con TGF-β en las células endoteliales MS-1.

Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β

El modelo de la matriz extracelular (BEM) de hueso para el osteosarcoma (OS) está bien establecida y se muestra aquí. Puede utilizarse como un andamio adecuado para mímico el tumor primario crecimiento en vitro y proporcionando un modelo ideal para el estudio de la heterogeneidad histologic y cytogenic de OS.

Modelo de matriz extracelular ósea tridimensional para el Osteosarcoma

Describimos un flujo de trabajo sistemático para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β mediante el estudio de la proteína y la expresión génica implicadas en esta vía de señalización. Los métodos incluyen hinchazón occidental, un ensayo de reportero luciferasa, qPCR y tinción de inmunofluorescencia.

Estudio de la señalización β TGF y la transición epitelial a mesenquimal inducida por TGF-β en cáncer de mama y células normales

El presente protocolo describe la creación de cultivos 3D "en la parte superior " de una línea celular epitelial de mama no transformada, MCF10A, que se ha modificado para estudiar la transformación inducida por el factor activador plaquetario (PAF). La inmunofluorescencia se ha utilizado para evaluar la transformación y se discute en detalle.

Transformación inducida por mediadores fosfolípidos en cultivos tridimensionales

Aprende a inducir transiciones mesenquimales-epiteliales en células de sarcoma usando microRNA-200 y GRHL2. Este método reproducible permite estudiar redes regulatorias génicas y fenotipos asociados a la plasticidad celular en cáncer.

La inducción de la mesenquimales-epitelial Transitions en células de sarcoma

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