La inducción de la mesenquimales-epitelial Transitions en células de sarcoma

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las consecuencias fenotípicas de las transiciones mesenquimato-epiteliales en los sarcomas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre por qué los sarcomas epiteliales tienen mejores resultados en comparación con los sarcomas más mesenquimales. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un medio fácil y reproducible para estudiar las redes reguladoras de genes posteriores y los fenotipos asociados con las transiciones mesenquimato-epiteliales en los sarcomas.

Al comprender mejor la plasticidad fenotípica en los sarcomas, esperamos identificar intervenciones terapéuticas que nos permitan cambiar los sarcomas hacia un estado epitelial más indolente. Para demostrar el procedimiento estarán dos estudiantes de nuestro laboratorio, Jackson Xu y Shivee Gilja. En el primer día de la transducción, placa tres veces 10 la quinta HEK293T células en cada uno de los dos pocillos de una placa de seis pocillos en dos mililitros de DMEM suplementado.

Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Después de cultivar durante la noche, examine las células bajo un microscopio. Deben tener entre un 40 y un 60% de confluentes.

A continuación, en tubos separados que contengan 200 microlitros de medio libre de suero con 1,8 microgramos de p delta 8,9 y 0,2 microgramos de plásmidos auxiliares pCMV-VSV-G, diluya dos microgramos del vector vacío y dos microgramos del vector que contiene GRHL2. En otro tubo, diluir cuatro microlitros de un reactivo de transfección a base de lípidos en 200 microlitros de medio libre de suero por transfección. Esto será de ocho microlitros y 400 microlitros para dos muestras.

Agregue 200 microlitros de mezcla de reactivos de transfección a cada solución de plásmido y luego incube las muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, use un aspirador de vacío para eliminar el medio de las células HEK293T. Enjuague las células una vez con un mililitro de PBS y luego reemplace el PBS con 800 microlitros de medio libre de suero.

Una vez transcurridos 20 minutos, añada 400 microlitros de mezcla de plásmidos de reactivos de transfección gota a gota en cada pocillo de las células plateadas. Incubar la placa durante dos horas a 37 grados centígrados en 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, retire con cuidado el medio de transfección mediante aspiración endouterina.

HEK293T células son poco adherentes, por lo que al aspirar el medio, tenga cuidado de no quitar las células del fondo del plato o matraz. Sustituya el medio aspirado por dos mililitros de DMEM suplementado. Regrese las células a la incubadora para el cultivo durante la noche.

Al día siguiente, refresque el medio en las células de HEK293T transfectadas, luego coloque tres veces 10 a la quinta células de rabdomiosarcoma humano RD en cada pocillo de una placa de seis pocillos que contiene dos mililitros por pocillo de DMEM suplementado. Cultive ambas placas durante la noche. Al cuarto día, utilice una pipeta para recoger el medio viral de las células HEK293T y transferirlo a dos nuevos tubos cónicos de 15 mililitros, uno para lentivirus que contiene un vector vacío y otro para lentivirus que contiene el plásmido GRHL2.

Reemplace con cuidado el medio con DMEM nuevo y vuelva a colocar las células HEK293T en la incubadora durante la noche. A continuación, agregue dos microlitros de 10 miligramos por mililitro de polibreno por mililitro de medio viral en dos nuevos tubos cónicos de 50 mililitros, uno para la transfección de vectores vacíos y otro para la transfección GRHL2. Retire el émbolo de una jeringa de tres mililitros y coloque un filtro de polietersulfona de 0,45 micrómetros en la punta de la jeringa.

Agregue el medio viral recolectado anteriormente en el cilindro de la jeringa y sumérjalo en uno de los nuevos tubos cónicos de 50 mililitros que contienen polibreno. Repita este paso con la otra muestra. A continuación, extraiga el medio de las células RD por aspiración endouterina y añada los dos mililitros de cada una de las muestras de medio viral filtrado a los pocillos separados de la placa RD.

Incubar las células RD a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada. Al día siguiente, repita la recolección del medio viral y agregue el medio de infección a los mismos pocillos que contienen las células RD previamente infectadas. Las células HEK293T se pueden descartar después de que se haya recolectado el medio viral.

Incuba las células durante dos días más. Al séptimo día, lavar las células RD con un mililitro de PBS, luego agregar 200 microlitros de tripsina al 0,05% a cada pocillo. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

Agregue dos mililitros de medio suplementado y luego transfiera la suspensión celular a nuevos tubos cónicos de 15 mililitros. Centrifugar las células a 250 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después del centrifugado, aspire el medio y vuelva a suspender las células en un mililitro de DMEM suplementado con 5% de FBS y 1% de estreptomicina de penicilina.

Para filtrar las células en preparación para la citometría de flujo, utilice una pipeta para aplicar la suspensión de células RD de un mililitro a través de un filtro superior de tubo estéril de 30 micrómetros en los tubos de citometría de flujo. Coloque los tubos sobre hielo. Con un citómetro de flujo, clasifique las células positivas para EGFP en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan 0,5 mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de estreptomicina de penicilina.

Vuelva a colocar las celdas ordenadas en hielo. Coloque las células positivas para EGFP a partir de transducciones de vector vacío y GRHL2 en un total de un mililitro de DMEM suplementado en pocillos separados de una placa de 12 pocillos. A continuación, coloque las células en la incubadora para su cultivo.

El rendimiento de células positivas para EGFP después de la citometría de flujo suele ser bastante bajo, en el rango de 50.000 a 100.000 células. Debido a esto, es posible que sea necesario cultivar las células durante 10 a 14 días adicionales antes de continuar con el siguiente paso. En un tubo de microcentrífuga, agregue tres microlitros de cada 50 micromolares miR-200 mimic a 300 microlitros de medio libre de suero.

En un tubo separado, agregue nueve microlitros de micro ARN de control negativo de 50 micromolares a 300 microlitros de medio libre de suero. A continuación, en otro tubo de microcentrífuga, agregue seis microlitros de reactivo de transfección específico de siRNA a 600 microlitros de medio libre de suero. Divida 300 microlitros de esta mezcla en dos tubos, uno para cada una de las dos mezclas miR.

Combine los 300 microlitros de cada mezcla miR con una mezcla de 300 microlitros de reactivo de transfección. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, prepare una suspensión celular de 600.000 células RD positivas para EGFP que expresen el vector MD o GRHL2 en 2,4 mililitros con 250 células por microlitro de medio libre de suero por tratamiento.

En una placa de 24 pocillos, agregue 100 microlitros por pocillo del miR-200 o la mezcla de control negativo en seis pocillos. A continuación, añada 400 microlitros de cada suspensión celular en tres pocillos de cada mezcla miR. Incubar la placa a 37 grados centígrados en 5% de dióxido de carbono durante la noche.

Al día siguiente, cambie el medio a DMEM completamente suplementado. Recoja las células dos días después para analizarlas con el tampón adecuado. Obtenga imágenes de cada pocillo cada dos horas con un objetivo 10X utilizando un generador de imágenes de células vivas automatizado.

Estas imágenes de lapso de tiempo muestran la transición mesenquimal-epitelial, o MET, en células RD que expresan miRNAs GRHL2, EGFP y miR-200. Las células cambian de forma de huso a adoquín en apariencia, con un aumento de las adherencias de célula a célula y una morfología más redondeada. El MET no se observa en otras condiciones de tratamiento.

En cambio, las células exhiben una morfología alargada en forma de huso con pocas uniones de célula a célula. Durante la inducción de MET, el cambio morfológico en las células RD tras la sobreexpresión de GRHL2 y miR-200 se acompañó de una regulación al alza del marcador epitelial, E-cadherina, medido por qPCR y western blot. La adición de miR-200s reguló la E-cadherina sola, pero la sobreexpresión combinada de miR-200s y GRHL2 mejoró sinérgicamente la expresión de E-cadherina.

Como se demostró mediante microscopía de inmunofluorescencia, hubo un aumento en las uniones célula a célula de las moléculas de adhesión epitelial, EpCAM y TJP-1, indicado por las flechas blancas. La regulación ascendente de las proteínas epiteliales se acompañó de una regulación descendente de los genes mesenquimales ZEB1 y Notch1 mediante QRT-PCR. La inducción de MET redujo el crecimiento independiente del anclaje de las células RD, medido por ensayos de crecimiento en agar blando.

La inhibición del crecimiento en agar blando fue impulsada solo por miR-200, ya que la sobreexpresión de GRHL2 condujo a un aumento en el crecimiento independiente del anclaje. Esto es consistente con informes anteriores que muestran que la expresión de GRHL2 induce un crecimiento independiente del anclaje. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, incluidos ensayos para medir los cambios en la migración celular, la invasión, la metástasis y la respuesta al tratamiento, con el fin de dilucidar las consecuencias fenotípicas de la MET en los sarcomas.