Optimización y Análisis Comparativo de Métodos de Enriquecimiento de ADN de Organelos Vegetales Adecuados para Secuenciación de Próxima Generación

El objetivo general de este experimento es comparar dos métodos utilizados para aislar ADN de orgánelos de alta calidad, tanto de plástidos como de mitocondrias, del tejido de las hojas de las plantas que es adecuado para la secuenciación de próxima generación. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en biología vegetal, como el alcance de la diversidad de orgánulos en los taxones y cómo los cambios en la secuencia o estructura del genoma de los orgánulos afectan el desarrollo y la respuesta al estrés. Compararemos dos técnicas, el método de centrifugación diferencial que enriquece para un tipo de orgánulo específico y la técnica de metafraccionamiento que recupera el ADN orgánulo total de muestras de tejido congelado más pequeñas.

El procedimiento estándar para cultivar plántulas de trigo es plantar semillas en vermiculita, en macetas cuadradas con cuatro a seis semillas por esquina. Transfiera las macetas a un invernadero con un ciclo de luz de 16 horas. Riega las plantas todos los días.

Fertilice las plantas con un cuarto de cucharadita de fertilizante granular 20-20-20 MPK después de la germinación, y nuevamente a los siete días después de la germinación. Para la adulación de las plántulas de trigo, plante semillas y cuide las plantas como en el procedimiento estándar. Pero coloque las macetas en una cámara de crecimiento oscura.

Una alternativa al cultivo de estas plántulas en una cámara de crecimiento oscura es cubrir las plantas en el invernadero pero con la ventilación adecuada. El primer paso en este procedimiento es aislar los orgánulos. Coseche cinco gramos de pañuelo fresco y enjuáguelo con agua fría y estéril en un vaso de precipitados frío con hielo.

Con unas tijeras, corte el tejido de la hoja en trozos de aproximadamente un centímetro directamente en un tubo de 50 milímetros preenfriado que contiene dos cilindros de molienda de cerámica. Mantenga las muestras en hielo durante todo el procedimiento. Para evitar la contaminación cruzada, es importante cambiar las tijeras entre muestras.

Lleve las muestras a la campana extractora y agregue 20 mililitros de tampón STE a cada tubo de 50 mililitros. Coloque las muestras en bloques de molienda criogénicos preenfriados en un aparato de molienda de tejidos y muela las muestras durante 30 segundos a 1.750 rotaciones por minuto. Coloque las muestras en hielo durante aproximadamente un minuto.

Gire las posiciones de la muestra y muela durante otros 30 segundos a 1.750 rotaciones por minuto. Regrese las muestras a la cubeta de hielo. Para cada muestra, inserte un embudo en un tubo limpio de 50 mililitros colocado en hielo y coloque una capa de tela de filtración en el embudo.

Humedecer previamente el paño filtrante con cinco mililitros de tampón STE y guardar el flujo. Vierta el tejido homogeneizado en el embudo. Enjuague el tubo de molienda con 15 mililitros de tampón Ste, vuelva a tapar e invierta el tubo para enjuagar las paredes y la tapa y vierta su contenido en el embudo.

Retire con cuidado las piedras cerámicas y luego exprima y escurra el paño de filtración en el embudo. Para evitar la contaminación cruzada, cambie los guantes entre muestras. Envuelva las tapas de los tubos con una película de parafina para evitar derrames.

Centrifugar a 2.000 x G, a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, utilice una pipeta serológica para aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet y colóquelo en un tubo de centrífuga de alta velocidad de 50 mililitros con una junta de sellado hermética. Coloque un pequeño vaso de hielo en una balanza, rasgue la balanza y pese cada sobrenadante.

Utilice el tampón STE para equilibrar los tubos con una precisión de 0,1 gramos y, a continuación, centrifugar a 18.000 x G a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Una vez finalizada la centrifugación, devuelva las muestras a la campana extractora y deseche el sobrenadante. Agregue un mililitro de tampón ST al pellet y vuelva a suspender suavemente con un pincel suave.

Agregue 24 mililitros de tampón ST para obtener un volumen final de 25 mililitros. Agite suavemente el pincel en una suspensión para mezclarlo y, a continuación, presione el pincel en el costado de un tubo para eliminar todo el líquido antes de quitar el pincel. Después de equilibrar los tubos, centrifugar a 18.000 x G a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.

Durante esta centrifugación, prepare la solución de ADN 1 como se describe en el protocolo de texto y alícuota 200 microlitros en un tubo de 1,5 mililitros por muestra. Cuando se complete la centrifugación, deseche el sobrenadante y seque el tubo. A cada tubo de centrífuga de alta velocidad, agregue 300 microlitros de tampón STE y vuelva a suspender el pellet con un pincel suave.

Coloque el pincel en el tubo de 1,5 mililitros previamente preparado que contiene 200 microlitros de solución de ADN's 1 y agite el pincel para eliminar cualquier pellet residual atascado en el pincel. Pipetea la solución del ADN 1 en el tubo de centrífuga de alta velocidad y gíralo suavemente para mezclar. Envuelva la película de parafina alrededor de la parte superior de cada tubo e incube a 37 grados centígrados en un baño de agua durante 30 minutos.

Durante la incubación, mezcle suavemente girando. Con una punta de pipeta con un orificio ancho, pipetee suavemente la mezcla de pellets fuera del tubo y colóquela en un tubo de baja unión de 1,5 mililitros. Agregue 500 microlitros de EDTA de 400 milimolares, pH 8.0 al tubo de centrífuga de alta velocidad.

Pipetear suavemente para eliminar completamente el pellet residual y transferir el EDTA al tubo de unión baja que contiene la mezcla de pellets. Mezclar suavemente por inversión. Centrifugar a 18.000 x G, a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.

Posteriormente, deseche el sobrenadante, seque cada tubo y use el pellet inmediatamente para el aislamiento del ADN. En este método, el ADN organelar se enriquece a partir del ADN genómico total que se extrajo utilizando columnas comerciales de extracción de ADN. Prepare la cantidad requerida de perlas magnéticas unidas a proteínas MBD2 FC, según las instrucciones del fabricante, y escale las reacciones para usar entre uno y dos microgramos de ADN de entrada total.

En esta demostración, se requieren 160 microlitros de perlas para un microgramo de ADN de entrada total. Para capturar el ADN nuclear metilado, agregue un microgramo de ADN de entrada a un tubo que contenga 160 microlitros de perlas magnéticas unidas a MBD2 para cada muestra individual y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta de diámetro ancho. Agregue el volumen apropiado de tampón de lavado aglutinante 5x para una concentración final de 1x y pipetee la muestra hacia arriba y hacia abajo con una punta de diámetro ancho, varias veces para mezclar.

Gire los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para el éxito de la extracción, es fundamental mezclar bien las perlas durante la incubación, en particular, si hay una aglomeración significativa de perlas. Para evitar la aglomeración de perlas y asegurar la extracción del ADN metilado, pipetee suavemente las muestras con una punta de pipeta de diámetro ancho y agite las muestras dos o tres veces durante la incubación.

Haga girar brevemente los tubos que contienen la mezcla de ADN y cuentas magnéticas. Coloque los tubos en una rejilla magnética durante al menos cinco minutos para recoger las cuentas a los lados de los tubos. La solución debe parecer clara, contiene ADN enriquecido con orgánulos no metilados.

Con puntas de diámetro ancho, retire con cuidado el sobrenadante aclarado sin alterar las perlas y transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros limpio y de baja fijación. Almacene las muestras a 20 u 80 grados centígrados. Se empleó el ensayo de PCR aguda para evaluar la abundancia relativa de tres implicones específicos de orgánulos en el ADN genómico total y la fracción de ADN orgánulo obtenida de ambos métodos.

En general, los datos indican que el método de centrifugación diferencial enriquece preferentemente para las mitocondrias. La fracción no metilada del ADN genómico total metilfraccionado muestra un enriquecimiento sustancial de ambos implicones orgánulos. Los porcentajes de lecturas asignadas a los genomas de referencia de mitocondrias o cloroplastos de primavera china y trigo cultivado chris son consistentes con los resultados de la QPCR.

La centrifugación diferencial produce ADN que está más enriquecido en ADN mitocondrial y el metilfraccionamiento produce ADN que probablemente refleja la abundancia nativa de los dos genomas organelares. Las etiquetas de muestra, incluida la E, designan muestras idiladas y NE designan muestras no idiladas. Curiosamente, la idilatura no cambió la abundancia de orgánulos.

En ambos métodos, la cobertura teórica de los genomas referenciados a mitocondrias o cloroplastos, supera la cobertura de 100x, incluso cuando se remultiplexan 12 bibliotecas. El ADN genómico total migra como un frotis difuso en electroforesis en gel posterior al campo y supera las 50 kilobases. La fracción nuclear después del metilfraccionamiento disminuye de tamaño, pero permanece centrada alrededor de 50 kilobases, lo que sugiere que el ADN metilfractioantado es el más adecuado para la secuenciación de lectura larga.

Una vez dominadas, ambas técnicas de extracción de ADN orgánulo se pueden realizar en uno o dos días, desde la recolección de la muestra hasta la evaluación del producto final, si se realiza correctamente. La técnica de metilfraccionamiento tiene el potencial de ampliar en gran medida la gama de estudios de ADN de orgánulos a muestras raras y difíciles, ya que los aportes de tejido son extremadamente bajos. Sin embargo, la centrifugación diferencial puede ser preferible cuando solo se requiere ADN mitocondrial para estudios posteriores.

Del mismo modo, los pasos de centrifugación pueden ajustarse para extraer preferentemente el ADN de los plástidos si se desea. Ambos métodos de extracción de ADN orgánulo producen ADN que es adecuado para la secuenciación de próxima generación, pero el metilfraccionamiento produce ADN de alta tasa molecular que es ideal para la secuenciación de lectura larga.