Espectroscopía de RMN como una herramienta robusta para la Evaluación Rápida del perfil lipídico de los suplementos de aceite de pescado

El objetivo general de este método es determinar el perfil lipídico de los suplementos de aceite de pescado mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Este método puede ayudar a responder preguntas clave para el análisis de lípidos, como el contenido de lípidos de los suplementos de aceite de pescado y la distribución posicional de varios ácidos grasos en el esqueleto de glicerol. La principal ventaja de esta técnica es que hace posible el análisis rápido y robusto de varias moléculas diferentes en una instantánea sin utilizar pasos de separación y purificación.

Para preparar las muestras para el análisis de RMN de protones y carbono, primero extraiga 120 microlitros, que son alrededor de 110 miligramos de aceite de pescado, de una cápsula dietética con una jeringa y colóquela en un vial de vidrio de 4 ml. Anota el peso del aceite de pescado. Use 500 microlitros de una solución madre de BHT para disolver 100 miligramos más o menos 10 miligramos de aceite de pescado.

Después de disolver el aceite, transfiera toda la solución directamente a un tubo de RMN de cinco milímetros de alta calidad y coloque una tapa. Analice las muestras dentro de las 24 horas posteriores a la preparación de las muestras. Inserte el tubo de RMN en una turbina giratoria.

Coloque el girador y el tubo en la parte superior de un medidor de profundidad graduado y empuje suavemente la parte superior del tubo hasta que su parte inferior toque la parte inferior del medidor. A continuación, coloque el tubo de RMN en un lugar abierto del estuche de muestra. Anote el número de ranura en el que se coloca la muestra.

Para cargar la muestra en el instrumento de RMN, regrese a la computadora de control y escriba SX-number, donde number es la ranura en el estuche de muestra que contiene la muestra. Espere a que la señal de deuterio del cloroformo deuterado aparezca en la pantalla. Tan pronto como la señal de deuterio sea visible, escriba lock"en la línea de comandos y seleccione cloroformo deuterado de la lista de solventes para bloquear la muestra usando su resonancia de deuterio.

Escriba bsmsdisp" en la línea de comandos para asegurarse de que el giro no esté activo. Si el botón de giro es verde, haga clic en él para desactivar el giro. Después de escribir el comando new"para crear un nuevo conjunto de datos, ingrese un nombre para el conjunto de datos en la pestaña de nombre y el número de experimento en la pestaña de número de experimento titulada EXPNO.

Utilice el número uno en la pestaña de número de proceso titulada PROCNO. Escriba el título del experimento en la pestaña TÍTULO. En la pestaña Experimento, pulse Seleccionar y elija el archivo de parámetros C13IG.

Luego presione Establecer elemento seleccionado en el editor "y haga clic en Aceptar. Escriba getprosol" en la línea de comandos para obtener los parámetros estándar para la sonda de RMN y el solvente actuales. Luego escriba el comando atma"para realizar el ajuste automático y para la coincidencia de la sonda tanto para los núcleos de carbono como para los de protones. A continuación, realice una calce de gradiente unidimensional para lograr un campo magnético altamente homogéneo y, por lo tanto, una forma de línea óptima para las señales de RMN.

Para ello, utilice el procedimiento automático estándar para el calzado 1D simplemente ejecutando secuencialmente los comandos qu topshim 1dfast ss; qu topshim tuneb ss; y qu topshim report"en la línea de comandos. Después de la optimización de los parámetros como se describe en el protocolo de texto, adquiera espectros de RMN de carbono unidimensionales. Para ello, vaya al conjunto de datos de carbono y utilice una secuencia de pulsos desacoplada con compuerta inversa escribiendo pulprog zgig" en la línea de comandos.

Escriba comandos en la línea de comandos para configurar el espectral con nppm, el centro del transmisor de RF, el número de exploraciones, el número de exploraciones ficticias, el número de puntos de datos y la duración del pulso para un ángulo de pulso de noventa grados. Escriba digmod baseopt"en la línea de comandos para adquirir un espectro con una línea base mejorada. A continuación, establezca un retardo de relajación de 60 segundos para el instrumento de 850 megahercios escribiendo di 60s"en la línea de comandos.

Ajuste la ganancia del receptor a un valor apropiado utilizando el comando rga" para el cálculo automático de la ganancia del receptor. Finalmente, inicie la adquisición escribiendo el comando de adquisición de pulsos zg" en la línea de comandos. Para procesar los datos, primero escriba si 64K"en la línea de comandos para aplicar el relleno de cero y establezca el tamaño del espectro ferroviario en 64K.

A continuación, establezca el parámetro de ensanchamiento de línea en 1,0 hercios escribiendo lb 1,0" en la línea de comandos para aplicar una función de espera con un factor de ensanchamiento de línea de 1,0 hercios antes de la transformación 4ea. Ejecute la transformación 4ea escribiendo efp" en la línea de comandos. A continuación, realice la corrección de fase automática escribiendo el comando apk" en la línea de comandos.

Si se requieren ajustes de fase adicionales para mejorar aún más el espectro, haga clic en la pestaña Proceso. A continuación, haga clic en el icono Ajustar fase y en los iconos de Corrección de fase para la corrección de fase de orden cero y de primer orden. Al hacer clic en los iconos de corrección de fase de orden cero y primer orden, arrastre el ratón hasta que todas las señales estén en modo de absorción positiva.

Aplique y guarde los valores de corrección de fase haciendo clic en el botón Volver y guardar para salir del modo de corrección de fase. Aplique una función polinómica de cuarto orden para la corrección de la línea de base tras la integración escribiendo el comando abs n" en la línea de comandos. Para informar de los cambios químicos en ppm desde TMS, acérquese a la señal TMS, luego haga clic en el icono de Calibración y coloque el cursor con la línea roja en la parte superior de la señal de RMN a la que se va a hacer referencia, TMS en este caso.

Para ajustar la intensidad del umbral, utilice el botón central del ratón si es necesario. Haga clic con el botón izquierdo y escriba 0. Cuando se utiliza BHT como estándar interno, integre el pico en delta 151.45 extendiéndose cinco hercios desde cada lado del pico.

A continuación, iguale la integral a los micromoles de BHT por 0,5 mililitros de la solución madre. Integre los picos de interés extendiéndose cinco hercios desde cada lado del pico. Si es necesario centrarse en una región, haga clic en el icono de resaltado para desactivarlo.

A continuación, haga clic con el botón izquierdo y arrastre para acercar la región. Vuelva a hacer clic en el icono de resaltado para activar la función de integración y pasar al siguiente pico. Haga clic con el botón izquierdo y arrastre el cursor a través de la integral.

Haga clic en el botón Devolver regiones guardadas. Aquí se muestra un espectro representativo del análisis de RMN de carbono en la región de carbono carbonilo. Se muestran las señales de RMN de EPA y DHA en las posiciones sn-1, 3 y sn-2.

Estas señales se pueden utilizar para la determinación cuantitativa de EPA y DHA. Aquí se muestra un espectro representativo del análisis de RMN de protones. Se muestran las señales de RMN de EPA y DHA que se pueden utilizar para su determinación.

El espectro de RMN de protones se caracteriza por un ancho espectral más estrecho en comparación con el espectro de RMN de carbono y, por lo tanto, una resolución espectral más baja. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 30 minutos si se realiza correctamente. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del análisis de lípidos analizaran rápidamente diversos componentes lipídicos que aparecen en matrices multicomponentes, como suplementos dietéticos, aceites vegetales y biocombustibles.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aplicar la espectroscopia de RMN de protones y carbono para el análisis del perfil lipídico de los suplementos de aceite de pescado. No olvide que trabajar con fuertes campos magnéticos producidos por espectrómetros de RMN puede ser extremadamente peligroso para los marcapasos y las prótesis quirúrgicas, así como para los artículos electrónicos como tarjetas de crédito y relojes.