Name: Un grano emparejado y arreglo de imán para moldear los micropocillos con geometrías variables cóncavos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende a fabricar micropocillos cóncavos esféricos mediante fuerza magnética y perlas de acero auto-bloqueantes en sustratos de PDMS. Este método eficiente permite crear cientos de estructuras para cultivos celulares tridimensionales.

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Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro (NRF-2014R1A1A2057527 y NRF-2016R1D1A1B03934418).

1. elaboración de matriz de imán y placa de aluminio por-agujero matriz
<ol><li>Preparar dos de 50 x 50 mm (o mayor) placas de aluminio. El espesor de cada placa fue 300 μm que es la mitad del diámetro del grano.</li>
	<li>Forman una matriz de 30 x 30 a través del agujero en una de las placas de aluminio utilizando un CNC grabador rotatorio con una Φ550-μm micro broca de 30 mm/s de tasa de penetración y 8000 RPM de velocidad del huso. La distancia entre cada agujero (de centro a centro) fue de 1 mm (Figura 1a y Figura 2a, ).</li>
	<li>Formar una matriz de 30 x 30 de Φ750 μm a través de agujeros en la otra placa de aluminio, utilizando el mismo procedimiento que se describe en 1.2 (Figura 1a y Figura 2a, ii).</li>
	<li>Coloque las dos placas entre sí utilizando una cinta adhesiva y formar los agujeros de alineación de Φ3 mm en cada una de las cuatro esquinas de dos placas de aluminio.</li>
	<li>Remojar las placas de aluminio en ácido sulfúrico de 15% durante 12 h para limpiar sus superficies. Ya que la fina capa de óxido de aluminio sobre la superficie del aluminio que sea resistente a la corrosión, el diámetro de agujero y el grosor de la placa no cambia este tratamiento con ácido.</li>
	<li>Forman una matriz de 30 × 30 de 1 x 1 x 1 mm neodimio imanes (con una fuerza magnética de 0.363 N). Asegúrese de que cada imán es la polaridad opuesta a su vecino. Para evitar la ruptura o la dispersión de la matriz de imán, fije una placa de aluminio de 30 x 30 mm en la parte inferior de la matriz de imán usando cinta de doble cara (Figura 2a, la iii y la inserción en figura 2).</li>
</ol>2. proceso de captura de grano
<ol><li>Alinear y apilar las dos placas de aluminio (top placa: placa de orificio de 750 μm, placa inferior: placa de orificio de 550 μm) usando los orificios de alineación dispuestos en las cuatro esquinas de cada placa (Figura 1b).</li>
	<li>Traben las dos placas mediante la inserción de los tornillos M3 en los agujeros de alineación y luego fije los tornillos con tuercas (Figura 1b).</li>
	<li>Coloque el ensamblaje de placa de aluminio en el arreglo de imán preparado (Figura 1b, 2by 2C). Alinee el conjunto de imanes y la matriz de agujeros en la placa de aluminio durante el proceso de apilado. Utilizar una cinta adhesiva para fijar la posición de la matriz de imán.</li>
	<li>Lugar un número suficiente de acero de Φ600 mm. SUJ2 granos en el conjunto de placa y manipular los granos con un acrílico (o no metálico) de la placa tal que un grano queda atrapado en cada orificio (figura 1C, 1Dy 1e) mientras que al mismo tiempo quitar el exceso granos que no han presentado en los agujeros.</li>
	<li>Retire con cuidado la placa superior para evitar la dispersión no deseada y la dislocación de los granos atrapados (figura 1f).</li>
</ol>3. cóncavo micropocillos fabricación
<ol><li>Mover el molde cóncavo micropocillos, producido en pasos 2.1 a 2.5, arriba, a una placa Petri.</li>
	<li>La mezcla de monómero de polidimetilsiloxano (PDMS) y el agente endurecedor según las instrucciones de los fabricantes19 con un monómero PDMS: cociente de 10:1 del agente de curado.</li>
	<li>Gas de la mezcla PDMS utilizando un desecador y una bomba de vacío para eliminar las posibles burbujas en la mezcla PDMS.</li>
	<li>Vierta la mezcla PDMS en el molde cóncavo micropocillos y gas de nuevo utilizando el mismo procedimiento que se describe en 3.3 (figura 1f).</li>
	<li>Cueza al horno la mezcla PDMS en la placa caliente a 80 ° C por 2 h para formar un sustrato PDMS integrado de grano (figura 1 g).</li>
	<li>Quite el sustrato PDMS curado del molde (figura 1 g). En el proceso de extracción, pulverización metanol con botella de lavado para separar el sustrato PDMS del molde.</li>
	<li>Con un Φ15 x imán de 2 mm, retire los granos de acero atrapados el sustrato PDMS (figura 1 h). Para este proceso, puede utilizarse cualquier imán que es suficientemente fuerte para extraer los granos del substrato de PDMS.</li>
</ol>4. cultura de esferoide
<ol><li>Corte cóncavo sustrato PDMS micropocillos-patrón utilizando un punzón de biopsia Φ14 mm para montarse en placa de 24 pozos en este estudio.</li>
	<li>Esterilizar el sustrato resultante de PDMS de mm Φ14 en un esterilizador de la autoclave a 121 ° C y 15 psi.</li>
	<li>Coloque el sustrato esterilizado de PDMS en una placa bien 24.</li>
	<li>La capa del sustrato PDMS todo con pluronic F-127 solución al 4% (w/v) durante la noche para evitar la fijación de células a la superficie de los micropocillos. Durante el proceso de capa, eliminar posibles burbujas de aire atrapadas en los micropocillos cóncavos mediante pipeteo o utilizando un limpiador ultrasónico.</li>
	<li>Descargue la solución de F-127 tres veces mediante el uso de solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Sembrar 1 mL de solución de medio celular (medio de Eagle modificado de Dulbecco) (que contiene 2 x 106 células) en el sustrato PDMS. Tenga en cuenta que la densidad de siembra puede cambiar según el tamaño del esferoide de destino o tipo de celda de destino. Aquí, se utilizaron células madre procedentes de adiposo (ASC).</li>
	<li>Aspirar 1 mL del medio usando una pipeta de 1000 μL para quitar cualquier exceso células que no fueron atrapadas en los pocillos (figura 3).</li>
	<li>Incubar las células en 36,5 ° C, humedad de > 95% y 5% CO2 condición. En el caso de la ASC en nuestro estudio, las células se agregan a un esferoide en 48 h.</li>
</ol>

<ol><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+spheroids+as+a+tool+for+prediction+of+radiosensitivity+in+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy.</a> Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).</li>
<li>Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+immuno-cytochemical+characterization+of+a+hetero-spheroid+composed+of+fibroblasts+and+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes.</a> J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).</li>
<li>Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brave+little+world%3A+spheroids+as+an+in+vitro+model+to+study+tumor-immune-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions.</a> Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).</li>
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<li>Choi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ra/c4ra09730k#!divAbstract">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li>
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<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+MAter+Res+A%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li>
<li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

El reto principal de este método de fabricación era la segura fijación de los granos de la matriz a través del agujero en la placa de aluminio. Para resolver este desafío, la fuerza magnética en la forma de una matriz de 30 x 30 imán fue utilizada para fijar los granos con seguridad, como se muestra en las figuras 6 y 7. La densidad de flujo magnético de la matriz de imán, que tiene la polaridad opuesta, es más fuerte en el centro de cada superficie del imán. Porque la fuerza de la fuerz...

Las células cultivadas en forma de esferoide son más similares a real tejido en el cuerpo de un plano bidimensional de la cultura1. Teniendo en cuenta esta ventaja, el uso de esferoides se ha adoptado para mejorar el estudio de la interacción de célula a célula2,3, activación inmune4,5y6de la diferenciación de la detección de drogas. Además, esferoides con múltiples tipos de células se han aplicado recientemente a organoides (cerca de-fisiológico tridimensional (3D) el tejido), que son muy útiles para estudiar el desarrollo y la enfermedad humana7. Varios métodos se han utilizado para producir esferoides. El método más simple consiste en la utilización de una superficie no adhesiva, que las células se agregan entre sí y esferoides de forma. Un plato de Petri pueden tratarse con albúmina de suero bovino, pluronic F-127 o un polímero hidrofóbico (por ejemplo metacrilato de 2-hydroxyethl de poly) para hacer su superficie no adhesiva89. El método de frasco de spinner es otra forma bien conocida de producir grandes cantidades de esferoides10,11. En este método, las células se llevan a cabo en suspensión agitando para evitar de ser unido al sustrato. Por el contrario, la flotación células agregado esferoides de forma. El método superficie no adhesiva y el método de frasco de spinner pueden producir grandes cantidades de esferoides. Sin embargo, están sujetas a limitaciones incluyendo dificultades en controlar el tamaño del esferoide, así como el seguimiento y monitoreo de cada esferoide. Como un remedio para este tipo de problemas, otro método de producción del esferoide, a saber, el colgante gota método pueden ser empleados12. Se trata de depositar las gotas de la suspensión de células en la parte inferior de la tapa de una placa de cultivo. Estas gotas son generalmente 15 a 30 μL en tamaño y contienen aproximadamente de 300 a 3000 células13. Cuando se invierte la tapa, las gotas se llevan a cabo en lugar por la tensión superficial. El ambiente de microgravedad en cada gota concentra en las células, que entonces forman esferoides solo en la interfase líquido aire libre. Los beneficios de colgar el método de caída son que ofrece una distribución de tamaño bien controlados, si bien es fácil de rastrear y monitorear cada esferoide, en relación con los métodos de matraz superficie y spinner no adhesiva. Sin embargo, este método tiene una desventaja en que la producción masiva de esferoides y el propio proceso de producción es excesivamente trabajo intensivo.
Un conjunto de micropocillo es un plano de la placa con muchos pozos de tamaño micro, cada uno con un diámetro que van desde 100 hasta 1000 μm. El principio de producción del esferoide cuando utilice micropocillos es similar a la del método de superficie no adhesiva. Los beneficios incluyen el hecho de que los micropocillos proporcionan espacios entre los micropocillos para separar las células o esferoides, que es fácil controlar el tamaño del esferoide, mientras que también hace fácil supervisar cada esferoide sola. Con un gran número de los micropocillos, producción de esferoide alto rendimiento también es posible. Otra ventaja de los micropocillos es la opción a los pozos de la forma de diferentes formas (hexaedros, cilíndricos, trigonal prismático) dependiendo de propósitos experimentales únicas de los usuarios. En general, sin embargo, una forma tridimensional (3D) de cóncavo (o hemisférica) se considera el más adecuado para la producción de esferoides solo tamaño uniforme. Por lo tanto, la utilidad de los micropocillos cóncavos se ha divulgado para muchos estudios de Biología de la célula tales como examinar la diferenciación de cardiomiocitos de células madre embrionarias de14,15, racimos de la secreción de insulina de la célula del islote la actividad enzimática de los hepatocitos16y la resistencia a los medicamentos de tumor esferoides17.
Desafortunadamente, la fabricación de los micropocillos a menudo requiere instalaciones especializadas micropatterning; métodos de fotolitografía convencionales requieren exposición e instalaciones en vías de desarrollo mientras que los reactivos ion-aguafuerte-métodos necesitan equipo de plasma y viga de ion. Ese equipo es costoso que, junto con el proceso de fabricación complicado, presenta una alta barrera de entrada para los biólogos que no tienen acceso a la microtecnología. Para superar estos problemas, otros métodos rentables como hielo litografía18 (usando las gotas de agua congeladas) y el método de membrana flexible14 (usando una membrana, sustrato por-agujero y un vacío) se han sugerido. Sin embargo, estos métodos también conllevan graves inconvenientes como que es difícil controlar el tamaño del patrón, el logro de altos cocientes de aspecto y la producción de micropocillos de área más grande.
Para superar estas cuestiones, proponemos un método de fabricación de novela micropocillos cóncavo utilizando un substrato a través del agujero, bolas de acero y una variedad de imán. Usando este método, se pueden fabricar cientos de micropocillos esféricos cóncavos aprovechando el mecanismo de cuentas metálicas autobloqueantes asistida de fuerza magnética (figura 1). El proceso de fabricación implica el uso de muy pocas instalaciones costosas y complicadas y no requiere de muchas habilidades avanzadas. Como tal, personas aún pueden realizar fácilmente este método de fabricación. Para demostrar el método propuesto, humanos-adiposo-derivados de las células madre fueron cultivadas en los micropocillos cóncavos para producir esferoides.

<table><tbody><tr><td>Grabadora rotativa CNC</td><td>R/N/G,</td><td>EGX-350</td><td></td></tr>, <tr><td>Micro broca</td><td>HAM Pr&auml; zision</td><td>30-1301 TA</td><td>&Phi; 0,55 y 0,75 mm</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico 98%</td><td>Daejung</td><td>7683-4100</td><td>Para la limpieza de placas de aluminio. Diluir con agua destilada con solución al 15%</td></tr><tr><td>Imán de neodimio</td><td>Supermagnete</td><td>W-01-N</td><td>1 x 1 x 1 mm</td></tr><tr><td>Bola de rodamiento</td><td>Agami Modeling</td><td>SUJ2</td><td>&Phi; 600 &mu; m cordón de acero</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>p2443</td><td>Diluir con solución salina tamponada con fosfato al 4% (p/v) Medio</td></tr> de <tr><td>águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr></tbody></table>

un grano emparejado y arreglo de imán para moldear los micropocillos con geometrías variables cóncavos

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Un esferoide es una herramienta útil para comprender el comportamiento celular en que proporcione un en vivo-como el entorno tridimensional. Métodos de producción de varios esferoide como superficies no-adhesiva, frascos de spinner, gotas colgantes y micropocillos se han utilizado en estudios de interacción de célula a célula, activación inmune, de detección de drogas tallo diferenciación celular y la generación de organoide. Entre estos métodos, los micropocillos con una geometría cóncava tridimensional han ganado la atención de científicos e ingenieros, dados sus ventajas de generación esferoide de tamaño uniforme y la facilidad con que pueden ser las respuestas de los esferoides seguimiento. Aunque se han propuesto métodos rentables como el uso de membranas flexibles y litografía de hielo, estas técnicas incurren en graves inconvenientes como la dificultad para controlar el tamaño del patrón, logro de proporciones de alto y la producción de áreas más grandes de los micropocillos. Para superar estos problemas, proponemos un método robusto para la fabricación de los micropocillos cóncavos sin necesidad de instalaciones complejas de alto costo. Este método utiliza una matriz de 30 x 30 por-agujero, varios acero cien micrómetros-orden granos y la fuerza magnética para fabricar 900 micropocillos en un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS) de 3 cm x 3 cm. Para demostrar la aplicabilidad de nuestro método para aplicaciones biológicas de la célula, se cultivan células madre adiposas para 3 días y producido con éxito utilizando nuestra plataforma de micropocillos de esferoides. Además, se realizó una simulación de magnetostática para investigar el mecanismo, por el que se utilizó fuerza magnética para atrapar los granos de acero en los agujeros. Creemos que el método de fabricación de micropocillos propuesto puede aplicarse a muchos estudios celulares basado en el esferoide como screening de drogas, regeneración de tejidos, diferenciación de la célula de vástago y metástasis del cáncer.

Un molde convexo y un patrón de micropocillos fueron fabricados con éxito siguiendo los pasos 2.1 a 3.7. (Figura 4). Los granos de acero comerciales quedaron atrapados en la matriz por-agujero de 30 x 30. Los granos se mantuvieron firmemente sin espacios entre los granos y los correspondientes agujeros (figura 4a). La forma de micropocillos cóncava fabricado es cóncavo semiesférico, con un diámetro de 600 μm, que es lo mismo que ...

Este manuscrito presenta un método robusto de la fabricación de los micropocillos cóncavos sin necesidad de instalaciones complejas de alto costo. Usando la fuerza magnética, granos de acero y una matriz a través del agujero, varios cientos los micropocillos fueron formados en un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS) de 3 cm x 3 cm.

Un grano emparejado y arreglo de imán para moldear los micropocillos con geometrías variables cóncavos

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

El objetivo general de este método es fabricar micropozos esféricos cóncavos utilizando fuerzas magnéticas asistidas y microesferas metálicas autorroscantes. Hola, mi nombre es Gi Hun Lee y soy asistente de enseñanza en la Universidad Chung-Ang. En nuestro laboratorio estamos interesados en fabricar diversos dispositivos y plataformas a microescala para mejorar nuestros estudios relacionados con el desarrollo de instrumentos biológicos, su cultivo y nuevas microestructuras.Uno de nuestros intereses de investigación es desarrollar nuevos dispositivos y metodologías micro para realizar esto en un entorno tridimensional. Llamamos a esto cultivo. El cultivo es muy útil para comprender la respuesta tridimensional, porque es más similar al tejido real que el cultivo plano convencional en dos dimensiones.Se han intentado varios métodos para la producción de capas delgadas, como en un matraz o tubos, en una red de tambor y con microondas. Entre estos métodos, el método microcóncavo es una herramienta muy eficaz para producir productos tridimensionales. Cada inclinación del microdispositivo se monitorea individualmente y permite controlar el tamaño esférico y la distribución.Aquí proponemos nuestro método para fabricar microestructuras cóncavas con una perla y una matriz de pequeños imanes. Mediante esta técnica, se pueden fabricar 100 microestructuras cóncavas mediante el mecanismo de fuerza magnética que ayuda a mantener las perlas fijas. Las ampliaciones son dispares en el proceso de cada cavidad y no existen escalas de proporción recurrentes.Para comenzar, se fabricaron placas de aluminio con una matriz de orificios pasantes de 230 por 30 utilizando una grabadora rotativa CNC. El colocador proporciona una guía para los gránulos, tal como se mostrará en las siguientes secciones. El colocador se perforó con brocas de diferentes diámetros y la placa con el orificio más pequeño se colocó en la parte inferior.Los extremos exteriores también se perforan para alinear las placas. Luego, las dos placas se alinean, apilan y fijan juntas insertando N pernos en los orificios liminares y se aseguran con tuercas. Como se mencionó anteriormente, es importante que el fabricante coloque la placa con el orificio más pequeño en la parte inferior, para que las perlas puedan fijarse dentro de los pozos guía.El siguiente paso consiste en preparar una matriz de 30 por 30 de imanes de neodimio. Comenzamos aislando manualmente los imanes y organizándolos en una matriz de dos por dos. Luego los alineamos en una matriz más grande utilizando pinzas.Para crear una matriz de imanes adecuada, cada imán debe tener polaridad opuesta a la de su vecino. Además, para evitar la rotura o dispersión de la matriz, se fija una placa de aluminio en la parte inferior de la matriz de imanes utilizando cinta de doble cara. Ahora, estamos listos para ensamblar cada pieza que fabricamos en un molde de pocillos microscópicos.La matriz de imanes se fija cuidadosamente a la placa inferior utilizando cinta común. Es importante que la matriz de imanes se coloque con los imanes orientados hacia abajo. Una vez que la placa de aluminio y la matriz de imanes están correctamente colocadas, se colocan las esferas de acero sobre el conjunto de la placa.las perlas utilizadas en nuestro artículo son perlas de acero SUJ dos con diámetros de 600 micrones. Nuestro proceso de alineación es muy sencillo. Vertemos una cantidad suficiente de perlas sobre el ensamblaje y las retiramos utilizando una placa de acrílico.El imán en la parte inferior atrapa las perlas, que entran en los orificios de la placa de aluminio, y las perlas en exceso, que no se han alojado en los orificios, se eliminan durante el proceso de raspado. Las perlas en exceso se retiran utilizando otro imán. Cuando las perlas están correctamente alojadas dentro de los pozos guía, procedemos a retirar la placa superior.Durante este proceso, hay algunos casos en los que las perlas se salen y se desplazan. En este caso, inserte manualmente la perla de vuelta en el orificio utilizando pinzas. Ahora el molde de micropozos cóncavos está listo.Mueva la plataforma a otra placa de Petri y prepárela para el siguiente paso. Preparamos el PDMS siguiendo las instrucciones del fabricante, mezclando el monómero de PDMS y el agente de curado en una proporción de 10 a 1. Para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la mezcla de PDMS, desgasificamos la mezcla colocándola en un desecador durante aproximadamente una hora.Cuando esto se ha hecho, tomamos la mezcla de PDMS desgasificada y la vertemos sobre el molde de pocillos microcavos y la desgasificamos nuevamente. Luego horneamos la mezcla de PDMS en una placa calefactora a 80 grados Celsius durante dos horas para formar la bandeja secundaria de PDMS embebida. El siguiente proceso debe realizarse con gran cuidado.Con el fin de facilitar el proceso de eliminación, se vierte metanol sobre la bandeja secundaria y se retira secuencialmente la bandeja secundaria de PDMS. Cabe señalar que el fabricante debe asegurarse de que el metanol penetre bien en las ranuras para garantizar una eliminación limpia. Luego, la bandeja secundaria de PDMS se separa de la placa de aluminio; es más fácil cortar los bordes antes de desprender la bandeja secundaria.Finalmente, retiramos las perlas de la bandeja secundaria de PDMS. Antes de la extracción, estiramos y agitamos la bandeja secundaria durante un tiempo para aflojar los enlaces entre las perlas y la bandeja secundaria de PDMS. La eliminación real de las perlas es muy sencilla y puede realizarse utilizando un imán grande.La fabricación de micropozos cóncavos ha finalizado y los micropozos están listos para el cultivo celular. Para comprobar si nuestra plataforma de PDMS es adecuada para el cultivo de células, realizamos los siguientes procedimientos. En primer lugar, utilizamos un punzón de biopsia de 14 milímetros de diámetro para cortar la bandeja secundaria de PDMS con el patrón de micropozos cóncavos.Después de esterilizar la bandeja inferior de PDMS, la colocamos en una placa de 24 pocillos. Luego recubrimos toda la bandeja inferior de PDMS con una solución al cuatro por ciento de plurónico F-127 durante la noche para evitar que las células se adhieran a la superficie de los micro pocillos. Durante el proceso de recubrimiento, se deben eliminar las burbujas de aire atrapadas en los micro pocillos, ya sea mediante pipeteo o utilizando un limpiador ultrasónico.Después de asegurarse de que no queden burbujas de aire, sembramos un mililitro de solución de medio celular, que contendrá aproximadamente dos millones de células, sobre la bandeja inferior de PDMS. A continuación, se aspira el medio utilizando una pipeta de 1000 microlitros para eliminar cualquier exceso de células que no quedaron atrapadas en los micropozos, y todo está listo para colocar las células en el incubador. Se fabricó con éxito un molde convexo con un patrón de micropozos, y se atraparon microesferas de acero comerciales en una matriz de orificios pasantes de 30 por 30.Las perlas fueron sujetadas firmemente sin ningún gas entre las perlas y los orificios pasantes correspondientes. La forma del micropozo cóncavo fabricado es hemisférica cóncava con un diámetro de 600 micrones, igual al de la perla de acero. Una sección transversal de un micropozo cóncavo muestra que la distancia hasta el micropozo vecino era de un milímetro, igual a la de los orificios pasantes.Las células madre derivadas del tejido adiposo se cultivaron en microhendiduras cóncavas. Sembramos dos millones de células en la matriz de microhendiduras cóncavas de 14 milímetros de diámetro. Después de 24 horas, las células se habían agregado en esferoides.El diámetro promedio de los esferoides formados en una matriz de micropocillos fue de 185,68 micrones. Al tercer día, las células se habían agregado más, pero el diámetro promedio de los esferoides disminuyó a 147 micrones. Siguiendo este procedimiento, se pueden fabricar 100 micropocillos esféricos cóncavos mediante nuestro método relativamente sencillo y de bajo costo.

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