Un enfoque basado en espectrometría de Tandem Liquid Chromatography-Mass para el análisis de metabolitos de

El objetivo general de este método de muestreo es obtener muestras de metabolitos de Staphylococcus aureus para su posterior cuantificación mediante cromatografía líquida en tándem con espectrometría de masas. Nuestro laboratorio tiene interés en estudiar la intersección entre el metabolismo y la patogénesis en bacterias relevantes para la salud humana. Actualmente, estamos utilizando al patógeno oportunista humano Staphylococcus aureus como organismo modelo.

Una pregunta clave que deseamos responder es cómo las bacterias ajustan su fisiología y patogenicidad cuando se enfrentan a la escasez de nutrientes durante la infección del huésped. Esta técnica es ventajosa porque proporciona una instantánea de la distribución de metabolitos específicos entre las numerosas vías metabólicas en células en crecimiento activo, con una perturbación mínima de su estado fisiológico. Para comenzar, realice el aislamiento por estría de las cepas de S.aureus de interés en agar de soya tripticasa a partir del stock glicerolado congelado.

Incube las células a 37 grados Celsius durante 16-24 horas. Al día siguiente, inocule 4 mL de caldo de soya triptica, o TSB, en tubos estériles de incubación de vidrio con colonias individuales de cada cepa. Incube los cultivos, inclinados con rotación, a 37 grados Celsius durante 16-20 horas.

Utilice un espectrofotómetro para medir la densidad óptica de los cultivos a 600 nanómetros, abreviado como OD600. Con esta medición, diluya las células hasta un OD600 de 0.05 en 50 mL de medio TSB estéril, en matraces Delong de 250 mL. Incube los cultivos a 37 grados Celsius en un baño cálido con agitación a 280 rpm.

Cada 30 minutos, tome mediciones de DO600. A medida que las densidades ópticas aumentan, puede ser necesario diluir los cultivos con TSB para mantenerlos dentro del rango lineal de absorbancia del espectrofotómetro. Mientras las células crecen, prepare frescamente las soluciones de tampón de extracción utilizando reactivos de la máxima pureza disponibles, tal como se describe en el protocolo escrito.

Cuando los cultivos alcancen una DO600 entre 0,8 y 1,0, realice un subcultivo en 50 mL de TSB fresco y precalentado hasta una DO600 de 0,01 a 0,05, y repita los pasos de incubación y medición. Prepare una capa de hielo seco triturado en un recipiente adecuado, como un recipiente de vidrio, un cubo de hielo o una nevera portátil. Cuando las densidades ópticas de los cultivos se acerquen al punto deseado de recolección, agregue 1 mL de solución de parada a una placa de Petri no tratada de 35 mm y enfríe previamente en hielo seco durante al menos 5 minutos.

Para nuestros fines, el punto deseado de cosecha es una densidad óptica de aproximadamente 0,4 a 0,5. Sin embargo, este valor puede variarse según los objetivos experimentales. A continuación, coloque un embudo de filtro de acero inoxidable en un tapón de goma y colóquelo sobre un matraz al vacío conectado a un sistema de vacío central o a una bomba de vacío.

Aplique vacío y coloque una membrana de esteres mixtos de celulosa encima. Utilice un filtro con el mismo diámetro que el embolo para asegurar que se recojan todas las células. Es fundamental recolectar las células y detener la actividad metabólica lo más rápidamente posible, con el fin de obtener una instantánea de las abundancias metabólicas bajo una condición determinada.

Incluso retrasos pequeños pueden afectar la fisiología en estado estacionario de las células. A un OD600 entre 0,4 y 0,5, utilice una pipeta serológica para retirar 13 mL de cultivo del frasco. Aplique inmediatamente la muestra al filtro.

Después de filtrar toda la muestra, lave inmediatamente el filtro con no más de 5 mL de PBS frío con hielo para eliminar los metabolitos asociados al medio. Luego desconecte el vacío y use un par de pinzas estériles para retirar el filtro del frito. Invierta el filtro dentro de la solución de enfriamiento previamente enfriada.

Incube el filtro en la solución de extinción sobre hielo seco durante al menos 20 minutos. Utilizando las pinzas estériles, invierta el filtro en la placa de Petri y use una micropipeta para enjuagar las células de la membrana hacia la solución de extinción. Resuspenda las células en la solución de extinción y luego transfiera la suspensión celular a un tubo estéril resistente al impacto de 2 mL que contenga aproximadamente 100 microlitros de perlas de sílice de 0,1 mm.

Almacene esto en hielo seco o a 80 grados Celsius. Para comenzar la extracción de metabolitos, primero descongele las muestras en hielo húmedo. Luego, rompa las células en un homogenizador con cuatro ráfagas de 30 segundos a 6000 rpm, con períodos de enfriamiento de dos minutos en hielo seco entre ciclos.

Aclare los lisados durante 15 minutos en un tubo microcentrífugo refrigerado previamente a máxima velocidad. Tras la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un tubo microcentrífugo limpio. Utilizando una micropipeta, transfiera una pequeña porción de la muestra a un tubo microcentrífugo para la cuantificación del contenido residual de péptido según se describe en el protocolo escrito.

Almacene el resto de la muestra a 80 grados Celsius. Consulte el protocolo escrito para el análisis de los metabolitos mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas. Se utilizó el mutante nulo de CodY para investigar el agotamiento de aminoácidos de cadena ramificada, ya que la proteína CodY ajusta la expresión de decenas de genes en respuesta a la disminución de la concentración de estos nutrientes.

La mutación codY tiene poco efecto sobre la velocidad de crecimiento de las células de S.aureus. La disminución en la densidad óptica a las tres horas indica el paso de re-dilución, que aumenta el número de divisiones celulares antes de la recolección y diluye diversas moléculas que se acumulan durante el crecimiento nocturno. Un análisis de secuenciación de ARN de los transcriptomas de las dos cepas muestra cambios significativos en la expresión de genes implicados en la síntesis de la familia de aminoácidos derivados del aspartato.

Aquí, los números debajo de los nombres de los genes indican el cambio en la expresión en un mutante nulo de codY, en comparación con la cepa silvestre. Tras la cuantificación mediante LC-MS de los metabolitos extraídos, se compararon las abundancias entre las dos cepas. Centrándonos en algunos compuestos relacionados con la familia de aminoácidos derivados del aspartato, las abundancias de precursores, como el aspartato y la O-acetilhomoserina, están disminuidas en el mutante codY.

Por el contrario, los productos finales como la treonina y la isoleucina aumentan. Aquí, la línea discontinua indica el umbral para los cambios en la abundancia en este experimento. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo extraer metabolitos de Staphylococcus aureus para su cuantificación mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas.

Este protocolo también es adecuado, con modificaciones, para la recolección de metabolitos de otras especies bacterianas. Dado que las bacterias responden a entornos dinámicos, es importante realizar rápidamente los pasos de filtración y lavado para minimizar los posibles cambios fisiológicos inducidos por el muestreo. Los cambios también pueden reducirse manteniendo fría la placa de filtración y el PBS durante el muestreo.