Name: Un enfoque basado en espectrometría de Tandem Liquid Chromatography-Mass para el análisis de metabolitos de Staphylococcus aureus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprende a extraer y cuantificar metabolitos de Staphylococcus aureus mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas. Este método revela cómo la bacteria adapta su metabolismo durante la infección.

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Este trabajo fue financiado en parte por un NIH Camino a la concesión de la Independencia (GM conceder 099.893) y los fondos de inicio facultad de SRB, así como un proyecto de investigación de Grant (subvención GM 042219). Los proveedores de fondos no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recogida de datos e interpretación, o la decisión de presentar el trabajo para su publicación.

1. Preparación de tampón Soluciones <ol><li> Prepare la solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4) mediante la dilución de una solución madre de 10x PBS a una concentración final de 1x con ultrapura (destilada y desionizada) agua. </li><li> Preparar la solución de temple mediante la combinación de 2 ml de acetonitrilo, 2 ml de metanol, 1 ml de ultrapura H 2 O, y 19! L (0,1 mM concentración final) de ácido fórmico. </li><li> Prepare LC-MS disolvente A mediante la adición de ácido fórmico (0,2% [v / v] de concentración final) a agua ultrapura. </li><li> Preparar LC-MS disolvente B mediante la adición de ácido fórmico (0,2% [v / v] de concentración final) a acetonitrilo. NOTA: Todas las soluciones deben prepararse usando los reactivos de la más alta pureza disponible (generalmente de alto rendimiento de grado de cromatografía líquida). Las soluciones deben prepararse fresco antes de cada experimento y se almacenan en hielo antes de su uso. </li></ol> 2. Establecimiento de Crecimiento S. aureus en estado estacionario <ol><li> Nodriza de S. aureus cepas de interés para el aislamiento en agar tríptico de soja (TSA) de un stock de glicerol congelado. Incubar a 37 ° C durante 16-24 h. </li><li> Inocular 4 ml de caldo de soja tríptico (TSB) u otro medio adecuado en tubos de incubación de vidrio estériles con colonias individuales de cada cepa. Incubar inclinada (~ 70 ° de ángulo) con rotación a 60 revoluciones por min (rpm) a 37 ° C durante 16-20 h. NOTA: cultivos de una noche son propensos a gradientes de oxígeno cuando se usan métodos estándar, incluyendo los descritos en el paso 2.2, que afectan a la fisiología celular. Por lo tanto, emplear una estrategia de back-dilución múltiple para asegurar el estado de equilibrio biológico (véanse los pasos 2.4-3.2, a continuación). </li><li> Use un espectrofotómetro para medir la densidad óptica de los cultivos de la etapa 2.2 a 600 nm (OD 600). Usar medio estéril como una referencia óptica (en blanco). Diluir estas células a un OD 600 de 0,05 en 50 ml de medio TSB estéril (previamente calentada a 37 ° C) en separada, matraces de 250 mL DeLong. </li><li> Incubate los cultivos a 37 ° C en un baño de agua con agitación a 280 rpm. </li><li> Cada 30 min, tomar OD 600 mediciones; a medida que aumentan las densidades ópticas, puede ser necesario diluir los cultivos con TSB para que permanezcan dentro del rango de absorbancia lineal del espectrofotómetro. </li><li> Cuando los cultivos de la etapa 2.5 a alcanzar un OD 600 de ~ 0,8-1,0, subcultivo ellos en 50 ml de 37 ° C TSB a un OD 600 de 0,01-0,05 y repita los pasos 2.4 y 2.5. </li></ol> 3. Configuración de la muestra Colección <ol><li> Preparar un lecho de hielo seco triturado en un recipiente apropiado (por ejemplo, el plato de cristal, cubo de hielo, o más fría). </li><li> A medida que las densidades ópticas de los cultivos se aproximan al punto de cosecha se desea, añadir 1 ml de solución a un 35 mm sin tratar placa de Petri y pre-enfriar en hielo seco temple para ≥5 min. NOTA: El &quot;punto de cosecha deseada&quot; variará en función de los objetivos experimentales. Por ejemplo, si uno fuera a examinar metabolites durante el crecimiento aeróbico, indicadores clave de este estado incluyen la excreción de etilo y re-asimilación del acetato durante la fase de crecimiento post-exponencial 32, 33. En general, este punto debe estar dentro de una etapa de crecimiento específico (por ejemplo, fase exponencial). Los específicos OD 600 valores asociados con esta fase pueden variar entre las diferentes cepas bacterianas y medios de cultivo. </li><li> Coloque una frita de filtro de acero inoxidable (enfriado previamente a -20 ° C) en un tapón de goma y colocarlo encima de un frasco de vacío unido a un vacío de la casa o bomba de vacío. </li><li> Aplicar el vacío y colocar una membrana de éster de celulosa mixto (0,22 tamaño micras de poro) en la parte superior. NOTA: Es crítico utilizar un filtro con un diámetro igual a la de la frita y para centrar correctamente este filtro para asegurar que la muestra se extrae a través del filtro en lugar de sobre el borde. La humectación de la membrana con enfriado con hielo, H 2 O estéril puede ayudarCon el posicionamiento de la membrana. </li></ol> 4. La muestra de la cosecha <ol><li> A una OD 600 de ~ 0,4-0,5, utilizar una pipeta serológica para eliminar 13 ml de cultivo del matraz y para aplicar la muestra al filtro. </li><li> Después de toda la muestra se ha filtrado, lavar inmediatamente el filtro con ≥5 ml de PBS enfriado en hielo para lavar metabolitos asociados medianas. </li><li> Desconectar el vacío y el uso de un par de pinzas estériles para quitar el filtro de la frita. Invertir el filtro (-células hacia abajo) en la solución de enfriamiento rápido pre-enfriada. Nota: Es importante realizar los pasos anteriores rápidamente (es decir, en cuestión de segundos) y tan pronto como el líquido se ha eliminado para asegurar el enfriamiento rápido de las células, la detención de la actividad metabólica. </li><li> Incubar el filtro en una solución de enfriamiento rápido en hielo seco durante ≥20 min. </li><li> Utilizando pinzas estériles, invertir el filtro (lado celular up) en la placa de Petri y el uso de una micropipeta para enjuagar las células fuera de tél membrana en la solución de enfriamiento rápido. </li><li> Resuspenden las células en solución de enfriamiento rápido y luego transferir la suspensión celular a un tubo de 2 ml resistente a los impactos estéril que contiene ~ 100! L de perlas de sílice 0,1 mm. Almacenar esta en hielo seco o a -80 ° C. </li></ol> 5. Extracción de metabolitos <ol><li> Descongelar las muestras en hielo húmedo y romper las células en un homogeneizador con cuatro 30 s ráfagas a 6.000 rpm, con 2 min periodos de enfriamiento en hielo seco entre ciclos. </li><li> Aclarar los lisados durante 15 minutos en un pre-refrigerado, de microcentrífuga refrigerada a la velocidad máxima (es decir, 18.213 xg en ≤4 ° C). </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio. </li><li> Usando una micropipeta, transferir una pequeña porción de la muestra a un tubo de microcentrífuga para la cuantificación del contenido de péptido residual en el paso 6; almacenar el resto a -80 ° C. NOTA: El volumen de muestra reservado varía, dependiendo del ensayo BCA utilizado en la etapa 6.1. Estamuestra debe ser almacenado en hielo húmedo para su análisis inmediato o se congeló a -80 ° C. </li></ol> 6. del ácido bicinconínico (BCA) Ensayo <ol><li> Realizar un ensayo de BCA como se recomienda por el fabricante del kit, usando muestras procedentes de la etapa 5.4 para determinar la concentración de péptido residual para cada muestra. </li></ol> 7. LC-MS <ol><li> Mezclar 75 l de extracto de S. aureus con 75 l de LC-MS disolvente B, preparado en la etapa 1.4. </li><li> Vórtice para mezclar y centrifugado a 13.000 xg durante 5 min. </li><li> Coloque 100 l de sobrenadante en un vial de cromatografía líquida (LC) y la tapa él. Asegúrese de que no hay burbujas de aire atrapadas en la muestra. </li><li> Cargar los viales en el inyector automático LC-MS y LC editar la lista actualizada en el software &quot;Desconectado lista de trabajo Editor&quot;. <ol><li> Rellene la &quot;Nombre de ejemplo&quot; (por ejemplo, de tipo salvaje-1), &quot;Posición de ejemplo&quot; (por ejemplo, P1-A1), &quot;método&quot; (por ejemplo, fórmico Acid-Negativo Método), y (por ejemplo, de tipo salvaje-1) columnas &quot;del archivo de datos&quot;. Haga clic en el botón en el botón &quot;Guardar lista de trabajo&quot;. Abra el software de &quot;Espectrometría de Masas de adquisición de datos de estaciones de trabajo&quot; y la entrada de la lista de trabajo previamente guardado. Haga clic en el botón &quot;Inicio Lista de trabajo Ejecutar&quot; para iniciar la medición continua de LC-MS. </li></ol></li><li> Separar las muestras en una columna, la columna vincular a un tiempo de vuelo espectrómetro (TOF), y acoplar el espectrómetro de TOF con el sistema LC. Utilice un gradiente de fase móvil de la siguiente manera: 0-2 min, 85% de disolvente B; 3-5 min, 80% de disolvente B; 6-7 min, 75% de disolvente B; 8-9 min, 70% de disolvente B; 10-11.1 min, 50% de disolvente B; 11,1 a 14 min, 20% de disolvente B; y 14,1 a 24 min, 5% de disolvente B; terminar con un período de re-equilibrado de 10 min a 85% de disolvente B y un caudal de 0,4 ml min -1. </li><li> El uso de una bomba isocrática, infundir una solución masa de referencia con la carrera para permitir la calibración del eje masa simultánea. NOTA: Este pasose basa en el manual de espectrómetro de TOF estándar. <ol><li> Usar la mezcla de ácido acético y D4 hexakis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxi) fosfazina como la solución masa de referencia para realizar la calibración en tiempo real. Utilice la bomba isocrática con la velocidad de flujo de 2,5 ml min-1 durante la infusión. </li></ol></li></ol> 8. lotes Corrección de Counts Ion <ol><li> Designe a cualquier muestra para servir como una muestra de referencia para la corrección por lotes (por ejemplo, de tipo salvaje, replicar 1). </li><li> Calcular la suma de los recuentos de iones para todos los metabolitos dentro de la muestra de referencia. Repetir este cálculo para todas las muestras. </li><li> Divida el recuento de iones total de cada muestra por el recuento total de iones de la muestra de referencia para generar una relación. </li><li> Divida el recuento de iones para cada metabolito dentro de una muestra por la relación de muestra / referencia para obtener un recuento de iones lote corregido para cada metabolito. </li></ol> 9. Péptido Normalización <ol><li> reivide los valores de recuento de iones de lote corregido para cada muestra obtenida en la etapa 8 por la concentración de péptido determinado con el ensayo de BCA en el paso 6 para producir un valor normalizado para cada metabolito. NOTA: Los recuentos de iones, corregido por lotes por lotes normalizados para cada metabolito obtenido en la etapa 9.1 se puede comparar directamente entre cepas y se sometió a análisis estadístico (por ejemplo, una U de Mann-Whitney-test). Alternativamente, un metabolito conocido de ser sin cambios, ya sea por el tratamiento o fondo genético puede ser utilizado como un normalizador para detectar cambios debidos a la metabolito descomposición. La inclusión de una cantidad conocida de L-norvalina o ácido gluraric en el tampón de extracción se puede utilizar para corregir la pérdida durante el procesamiento de la muestra 34. </li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Todos los metabolitos de molécula pequeña se conectan entre sí a través de sus orígenes comunes en las vías metabólicas centrales. Durante el crecimiento exponencial, las células bacterianas están en el estado de equilibrio biológico y metabólica, proporcionando una instantánea del estado fisiológico en condiciones específicas. CodY supervisa la suficiencia de nutrientes al responder a ILV y GTP. Como ILV y GTP piscinas gota, la actividad Cody es probable reduce progresivamente, el ajuste de la expresión de sus genes di...

Los patógenos bacterianos deben enfrentarse a muchos desafíos en el entorno de acogida. Además de ataque directo por las células inmunes, el anfitrión también secuestra nutrientes esenciales para la supervivencia y replicación bacteriana, generando inmunidad nutricional 1, 2. Para sobrevivir a estos ambientes hostiles, los patógenos bacterianos se despliegan factores de virulencia. Algunos de estos factores permiten que las bacterias para evadir la respuesta inmune; Otros factores incluyen las enzimas digestivas, tales como hialuronidasa, termonucleasa, y lipasa, que pueden permitir a las bacterias para reponer los nutrientes que faltan por el consumo de constituyentes derivadas de tejido 3, 4, 5 secretadas. De hecho, las bacterias han evolucionado los sistemas de regulación que atan el estado fisiológico de la célula para la producción de factores de virulencia 6, 7, <s<html> hasta class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Un cuerpo creciente de evidencia apunta a Cody como un regulador crítico que une el metabolismo y la virulencia. Aunque primero descubierto en Bacillus subtilis como un represor del gen dipéptido permeasa (dpp) 11, Cody ahora se sabe que se produce en casi todas las bacterias G + C Gram-positivos bajos 12, 13 y regula docenas de genes implicados en carbono y nitrógeno metabolismo 14, 15, 16, 17, 18, 19. En las especies patógenas, Cody también controla la expresión de algunos de los genes de virulencia más importantes 20, 21,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 CodY se activa como una proteína de unión a ADN por dos clases de ligandos: aminoácidos de cadena ramificada (BCAA; isoleucina, leucina, y valina [ILV]) y GTP . Cuando estos nutrientes son abundantes, Cody reprime (o en algunos casos, estimula) la transcripción. Como estos nutrientes se vuelven limitado, se reduce progresivamente la actividad Cody, que resulta en una respuesta transcripcional graduada que rutas de re precursores a través de diversas vías metabólicas conectados a metabolismo central 28, 29, 30. Cromatografía líquida de Tandem acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) es una técnica poderosa que puede identificar con precisión y cuantificar de molécula pequeña metabolitos intracelulares 31. Cuando se combina con transcriptasaanálisis riptome (por ejemplo, RNA-Seq), este flujo de trabajo analítico puede dar una idea de los cambios fisiológicos que se producen en respuesta al estrés ambiental o nutricional. A continuación, presentamos un método para la extracción de metabolitos a partir de células de Staphylococcus aureus y el análisis posterior mediante LC-MS. Este enfoque ha sido utilizado para demostrar los efectos pleiotrópicos de CodY en S. aureus fisiología.

<table><tbody><tr><td>Material/Equipoa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DeLong Culture Maternal (250 mL)</td><td>Belco</td><td>2510-00250</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Brazo Lateral, 500 mL</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de goma de 3 orificios, #7</td><td>Fisher</td><td>14-131E</td><td></td></tr><tr><td>Acero inoxidable Portafiltros/frita</td><td>VWR</td><td>89428-936</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri, 35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>No tratado con cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Membrana de éster de celulosa mixta, 0,22 &mu; m tamaño de poro</td><td>Millipore</td><td>GSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos resistentes a los impactos, 2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1420-9600</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de sílice, 0,1 mm</td><td>Biospec Products Inc</td><td>11079101Z</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador Precellys 24</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119-200-RD000.0</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Columna de hidruro de diamante tipo C</td><td>Cogent Agilent</td><td>70000-15P-2</td><td></td></tr><tr><td>Tiempo de vuelo (TOF) de masa precisa LC-MS, serie 6200</td> Bomba cuatrimestral <td>Agilent</td><td>G6230B</td><td></td></tr><tr><td>, serie 1290</td><td>Agilent</td><td>G4204A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de contenedor, serie 1290</td><td>Agilent</td><td>G4220A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Accionamiento de válvulas, serie 1290</td><td>Agilent</td><td>G1107A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bomba isocrática, serie 1290</td><td>Agilent</td><td>G1310B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCC, serie 1290</td><td>Agilent</td><td>G1316C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Muestreador, serie 1290</td><td>Agilent</td><td>G4226A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Termostato, serie 1290</td><td>Agilent</td><td>G1330B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Químico</fuerte></td>Triptic Caldo de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>soja</td><td>Becton Dickinson</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, Granulado</td><td>Becton Dickinson</td><td>214530</td><td>El medio sólido contiene 1,5% [p/v] de agar</td></tr><tr><td>Salina tamponada con fosfato (pH 7,4) 10x</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Diluir fresco a 1x con agua ultrapura</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-500</td><td>Optima LC-MS</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-500</td><td>Optima LC-MS; tóxico</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318</td><td>Para espectrometría de masas, 98</td></tr><tr><td>%Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassHunter</td><td>Agilent</td><td>G3337AA</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Cepa bacteriana</ fuerte></td><td><fuerte>Especie</fuerte></td><td><fuerte>Cepa</fuerte></td><td><fuerte>Genotipo</fuerte></td></tr><tr><td>SRB 337</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>tipo salvaje</td></tr><tr><td>SRB 372</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>&Delta; codY::erm</td></tr><tr><td colspan="4">aLos productos químicos y materiales enumerados son específicos del método descrito y no incluyen productos químicos o suministros de laboratorio estándar.</td></tr></tbody></table>

un enfoque basado en espectrometría de tandem liquid chromatography-mass para el análisis de metabolitos de<em&gt; staphylococcus aureus</em

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En un esfuerzo para frustrar los patógenos bacterianos, anfitriones a menudo limitan la disponibilidad de nutrientes en el sitio de la infección. Esta limitación puede alterar las abundancias de metabolitos clave a los que factores reguladores responden, ajustando el metabolismo celular. En los últimos años, un número de proteínas y ARN han surgido como importantes reguladores de la expresión del gen de virulencia. Por ejemplo, la proteína CodY responde a niveles de aminoácidos de cadena ramificada y GTP y es ampliamente conservada en bajo de G + C bacterias Gram-positivas. Como un regulador global en Staphylococcus aureus, Cody controla la expresión de la virulencia y de genes metabólicos decenas. Se postula que el S. aureus utiliza Cody, en parte, para alterar su estado metabólico en un esfuerzo para adaptarse a las condiciones de nutrientes limitantes potencialmente encontradas en el entorno de acogida. Este manuscrito describe un método para la extracción y el análisis de metabolitos a partir de S. aureus utilizando cromatografía líquida acoplada con espectrometría de masastrometry, un protocolo que fue desarrollado para probar esta hipótesis. El método también destaca las mejores prácticas que garanticen el rigor y la reproducibilidad, tales como mantener el estado de equilibrio biológico y aireación constante y sin el uso de cultivos continuos quimiostato. Con relación a la USA200 susceptibles a la meticilina de S. aureus aislar UAMS-1 cepa parental, la isogénica mutante Cody exhibió incrementos significativos en aminoácidos derivados de aspartato (por ejemplo, treonina e isoleucina) y disminuye en sus precursores (por ejemplo, aspartato y O -acetilhomoserina ). Estos hallazgos se correlacionan bien con los datos de la transcripción obtenidos con el análisis de RNA-seq: genes en estas vías fueron reguladas entre 10 y 800 veces en el mutante nulo Cody. El acoplamiento de los análisis globales del transcriptoma y el metaboloma puede revelar cómo las bacterias alteran su metabolismo cuando se enfrentan a estrés ambiental o nutricional, proporcionando una visión potencial en los Physcambios IOLÓGICA asociados con el agotamiento de nutrientes experimentaron durante la infección. Tales descubrimientos pueden allanar el camino para el desarrollo de nuevos agentes antiinfecciosos y la terapéutica.

Hemos analizado piscinas de metabolitos intracelulares en S. aureus durante el crecimiento in vitro en un medio rico y complejo. Como prueba de principio, se compararon los perfiles de metabolitos entre el S. osteomielitis aureus sensible a la meticilina aíslan UAMS-1 (de tipo salvaje [WT]) y una cepa isogénica que carece del regulador global transcripcional CodY (Δ Cody) 26. El estado de equilibrio, se establecieron cu...

Aquí se describe un protocolo para la extracción de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus y su posterior análisis por cromatografía de líquidos y espectrometría de masas.

Un enfoque basado en espectrometría de Tandem Liquid Chromatography-Mass para el análisis de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

El objetivo general de este método de muestreo es obtener muestras de metabolitos de Staphylococcus aureus para su posterior cuantificación mediante cromatografía líquida en tándem con espectrometría de masas. Nuestro laboratorio tiene interés en estudiar la intersección entre el metabolismo y la patogénesis en bacterias relevantes para la salud humana. Actualmente, estamos utilizando al patógeno oportunista humano Staphylococcus aureus como organismo modelo.Una pregunta clave que deseamos responder es cómo las bacterias ajustan su fisiología y patogenicidad cuando se enfrentan a la escasez de nutrientes durante la infección del huésped. Esta técnica es ventajosa porque proporciona una instantánea de la distribución de metabolitos específicos entre las numerosas vías metabólicas en células en crecimiento activo, con una perturbación mínima de su estado fisiológico. Para comenzar, realice el aislamiento por estría de las cepas de S.aureus de interés en agar de soya tripticasa a partir del stock glicerolado congelado.Incube las células a 37 grados Celsius durante 16-24 horas. Al día siguiente, inocule 4 mL de caldo de soya triptica, o TSB, en tubos estériles de incubación de vidrio con colonias individuales de cada cepa. Incube los cultivos, inclinados con rotación, a 37 grados Celsius durante 16-20 horas.Utilice un espectrofotómetro para medir la densidad óptica de los cultivos a 600 nanómetros, abreviado como OD600. Con esta medición, diluya las células hasta un OD600 de 0.05 en 50 mL de medio TSB estéril, en matraces Delong de 250 mL. Incube los cultivos a 37 grados Celsius en un baño cálido con agitación a 280 rpm.Cada 30 minutos, tome mediciones de DO600. A medida que las densidades ópticas aumentan, puede ser necesario diluir los cultivos con TSB para mantenerlos dentro del rango lineal de absorbancia del espectrofotómetro. Mientras las células crecen, prepare frescamente las soluciones de tampón de extracción utilizando reactivos de la máxima pureza disponibles, tal como se describe en el protocolo escrito.Cuando los cultivos alcancen una DO600 entre 0,8 y 1,0, realice un subcultivo en 50 mL de TSB fresco y precalentado hasta una DO600 de 0,01 a 0,05, y repita los pasos de incubación y medición. Prepare una capa de hielo seco triturado en un recipiente adecuado, como un recipiente de vidrio, un cubo de hielo o una nevera portátil. Cuando las densidades ópticas de los cultivos se acerquen al punto deseado de recolección, agregue 1 mL de solución de parada a una placa de Petri no tratada de 35 mm y enfríe previamente en hielo seco durante al menos 5 minutos.Para nuestros fines, el punto deseado de cosecha es una densidad óptica de aproximadamente 0,4 a 0,5. Sin embargo, este valor puede variarse según los objetivos experimentales. A continuación, coloque un embudo de filtro de acero inoxidable en un tapón de goma y colóquelo sobre un matraz al vacío conectado a un sistema de vacío central o a una bomba de vacío.Aplique vacío y coloque una membrana de esteres mixtos de celulosa encima. Utilice un filtro con el mismo diámetro que el embolo para asegurar que se recojan todas las células. Es fundamental recolectar las células y detener la actividad metabólica lo más rápidamente posible, con el fin de obtener una instantánea de las abundancias metabólicas bajo una condición determinada.Incluso retrasos pequeños pueden afectar la fisiología en estado estacionario de las células. A un OD600 entre 0,4 y 0,5, utilice una pipeta serológica para retirar 13 mL de cultivo del frasco. Aplique inmediatamente la muestra al filtro.Después de filtrar toda la muestra, lave inmediatamente el filtro con no más de 5 mL de PBS frío con hielo para eliminar los metabolitos asociados al medio. Luego desconecte el vacío y use un par de pinzas estériles para retirar el filtro del frito. Invierta el filtro dentro de la solución de enfriamiento previamente enfriada.Incube el filtro en la solución de extinción sobre hielo seco durante al menos 20 minutos. Utilizando las pinzas estériles, invierta el filtro en la placa de Petri y use una micropipeta para enjuagar las células de la membrana hacia la solución de extinción. Resuspenda las células en la solución de extinción y luego transfiera la suspensión celular a un tubo estéril resistente al impacto de 2 mL que contenga aproximadamente 100 microlitros de perlas de sílice de 0,1 mm.Almacene esto en hielo seco o a 80 grados Celsius. Para comenzar la extracción de metabolitos, primero descongele las muestras en hielo húmedo. Luego, rompa las células en un homogenizador con cuatro ráfagas de 30 segundos a 6000 rpm, con períodos de enfriamiento de dos minutos en hielo seco entre ciclos.Aclare los lisados durante 15 minutos en un tubo microcentrífugo refrigerado previamente a máxima velocidad. Tras la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un tubo microcentrífugo limpio. Utilizando una micropipeta, transfiera una pequeña porción de la muestra a un tubo microcentrífugo para la cuantificación del contenido residual de péptido según se describe en el protocolo escrito.Almacene el resto de la muestra a 80 grados Celsius. Consulte el protocolo escrito para el análisis de los metabolitos mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas. Se utilizó el mutante nulo de CodY para investigar el agotamiento de aminoácidos de cadena ramificada, ya que la proteína CodY ajusta la expresión de decenas de genes en respuesta a la disminución de la concentración de estos nutrientes.La mutación codY tiene poco efecto sobre la velocidad de crecimiento de las células de S.aureus. La disminución en la densidad óptica a las tres horas indica el paso de re-dilución, que aumenta el número de divisiones celulares antes de la recolección y diluye diversas moléculas que se acumulan durante el crecimiento nocturno. Un análisis de secuenciación de ARN de los transcriptomas de las dos cepas muestra cambios significativos en la expresión de genes implicados en la síntesis de la familia de aminoácidos derivados del aspartato.Aquí, los números debajo de los nombres de los genes indican el cambio en la expresión en un mutante nulo de codY, en comparación con la cepa silvestre. Tras la cuantificación mediante LC-MS de los metabolitos extraídos, se compararon las abundancias entre las dos cepas. Centrándonos en algunos compuestos relacionados con la familia de aminoácidos derivados del aspartato, las abundancias de precursores, como el aspartato y la O-acetilhomoserina, están disminuidas en el mutante codY.Por el contrario, los productos finales como la treonina y la isoleucina aumentan. Aquí, la línea discontinua indica el umbral para los cambios en la abundancia en este experimento. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo extraer metabolitos de Staphylococcus aureus para su cuantificación mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas.Este protocolo también es adecuado, con modificaciones, para la recolección de metabolitos de otras especies bacterianas. Dado que las bacterias responden a entornos dinámicos, es importante realizar rápidamente los pasos de filtración y lavado para minimizar los posibles cambios fisiológicos inducidos por el muestreo. Los cambios también pueden reducirse manteniendo fría la placa de filtración y el PBS durante el muestreo.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

Los compuestos de captura se trifuncional pequeñas moléculas para reducir la complejidad del proteoma de funcionamiento reversible de moléculas pequeñas, la interacción de proteínas seguido por foto-reticulación y la purificación. Aquí se utiliza un compuesto de captura...

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

Fuente: Samuels, D. J., et al. Un enfoque basado en cromatografía líquida en tándem y espectrometría de masas para el análisis de metabolitos de Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra el uso de la cromatografía líquida–espectrometría de masas para identificar y cuantificar metabolitos intracelulares de S. aureus. Describe los pasos implicados en la extracción de metabolitos, la normalización de péptidos, la cromatografía líquida y el análisis de espectrometría de masas.

Un enfoque basado en cromatografía líquida–espectrometría de masas para analizar metabolitos de S. aureus

El perfil de metabolitos no dirigido mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) es una técnica poderosa para investigar el metabolismo.  Este artículo describe un flujo de trabajo típico utilizado para la elaboración de perfiles de metabolitos no dirigidos en suero, incluida la organización y preparación de muestras, la adquisición de datos, el análisis de datos, el control de calidad y la identificación de metabolitos.

A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)

Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

El ubicuo segundo mensajero c-di-GMP controla el crecimiento y el comportamiento de muchas bacterias. Hemos desarrollado una novedosa tecnología basada en espectrometría de masas de compuestos de captura para identificar y caracterizar bioquímicamente las proteínas de unión a c-di-GMP en prácticamente cualquier especie bacteriana.

Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas

Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

Este protocolo cubre un análisis detallado de la composición de peptidoglicanos utilizando espectrometría de masas de cromatografía líquida junto con extracción avanzada de características y software de análisis bioinformático.

Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

Presentamos un protocolo para la identificación y cuantificación de las principales clases de metabolitos solubles en agua en la levadura Saccharomyces cerevisiae. El método descrito es versátil, robusto y sensible. Permite la separación de isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua entre sí.

Metabolómica cuantitativa de Saccharomyces cerevisiae mediante cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem

Aquí presentamos un protocolo para la identificación rápida de proteínas producidas por bacterias patógenas secuenciadas genómicamente utilizando espectrometría de masas en tándem MALDI-TOF-TOF y análisis proteómico de arriba hacia abajo con software desarrollado internamente. Los iones proteicos metaestables se fragmentan debido al efecto del ácido aspártico y esta especificidad se explota para la identificación de proteínas.

Identificación de proteínas de inmunidad antibacteriana en Escherichia coli utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS y análisis proteómico de arriba hacia abajo

Los protocolos describen métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento acoplados al índice de refracción o a la detección espectrométrica de masas para estudiar reacciones metabólicas en sistemas complejos libres de células basados en lisato.

Cromatografía líquida acoplada a la detección de índice de refracción o espectrometría de masas para perfiles de metabolitos en sistemas libres de células basados en lisato

Aprende a extraer y cuantificar metabolitos de Staphylococcus aureus mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas. Este método revela cómo la bacteria adapta su metabolismo durante la infección.

Un enfoque basado en espectrometría de Tandem Liquid Chromatography-Mass para el análisis de metabolitos de Staphylococcus aureus (Video) | JoVE Journal

Un enfoque basado en espectrometría de Tandem Liquid Chromatography-Mass para el análisis de metabolitos de

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