Name: Medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína G mediante unión de GTP marcada con radio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprende a medir la señalización de receptores GPCR mediante unión de GTP marcado con radio en células HEK. Este método simple y rápido permite caracterizar propiedades farmacológicas de receptores establecidos y huérfanos.

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Este trabajo fue apoyado por la concesión nacional de los institutos de la salud DA-000266 y la concesión del programa de entrenamiento del científico médico C32 (CV, NWZ, y PCS). Los autores también quieren reconocer somersault18: 24 (somersault1824.com) para la Biblioteca de Ciencias y Ilustraciones Médicas.

1. Expresión de HA-MOR1 recombinante en células cultivadas NOTA: Siga todos los protocolos de cultivo celular en una campana estéril de flujo laminar. <ol><li> Esterilizar la capa de flujo laminar de cultivo celular con etanol al 70% y mantener la técnica estéril en todo el cultivo celular. </li><li> Se prepararon células de riñón embrionarias humanas 293 (HEK293) medio de cultivo celular, medio de Eagle modificado completo de Dulbecco (DMEM): DMEM, pH 7,4, suplementado con 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina y 10% de suero bovino fetal ). </li><li> Placa 2,5 x 10 6 células HEK293 sobre una placa de cultivo de tejidos de 10 cm en 10 ml de DMEM completo e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta alcanzar una confluencia del 70-80% (O / N). NOTA: Para recolectar suficiente proteína para un experimento de unión a GTP completo, plancha por lo menos 3 placas de 10 cm de células. </li><li> Transfectar las células con HA-MOR1 utilizando un reactivo de transfección de elección y siguiendo las instrucciones del fabricante,; S directrices. Incubar durante 36-48 h. NOTA: El ADNc de MOR-1 humana (NCBI Reference Sequence: NM_000914.4) era un don generoso de Gavril Pasternak y se clonó en pCMV-HA. </li></ol> 2. Fraccionamiento celular y recolección de membranas <ol><li> Preparar los siguientes tampones de lisis: <ol><li> Tampón 1: ácido 4- (2 - hidroxietil) - 1 - piperazinoetanosulfónico 10 mM (HEPES), pH 7,4; 1 mM de ácido etilenglicol-bis (β-aminoetil éter) -N, N, N &#39;, N&#39;-tetraacético (EGTA); Sacarosa al 10%; Cóctel inhibidor de proteasa; Y ditiotreitol 1 mM (DTT). Agregue el DTT fresco el día del aislamiento de la membrana. </li><li> Tampón 2: HEPES 10 mM, pH 7,4; 1 mM de EGTA; 1 mM de MgCl $ ₂ $ ; Y 1 mM de DTT. Agregue el DTT fresco el día del aislamiento de la membrana. </li></ol></li><li> Quitar las células transfectadas de la incubadora (paso 1.4), aspirar el medio y enjuagar las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo. Aspirar el PBS y el exceso de líquido deel plato. </li><li> Añadir 600 μl de Tampón 1 a las células. Usando un raspador de células, desalojar las células de la superficie de la placa y pipetear la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 1,6 ml. </li><li> Inmediatamente engaje el tubo de microcentrífuga en nitrógeno líquido. Una vez que las muestras son congeladas, descongelar los lisados ​​en hielo o colocarlos a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo. </li><li> Repita los pasos 2.3 y 2.4 con todas las placas de las células. </li><li> Una vez que los lisados ​​se han descongelado, utilice un homogeneizador de micro-tubo de un solo pulso para abrir las celdas. Pulse el homogeneizador 3-5 veces durante 10 s, colocando el tubo de nuevo en el hielo durante 30 s entre pulsos. <ol><li> Recoger 20 μL como fracción de células enteras. </li></ol></li><li> Centrifugar la muestra restante durante 10 min a 1.000 xg y 4 ° C. Recoger el sobrenadante y colocarlo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,6 ml sobre hielo. </li><li> Resuspender el sedimento en 100 μl de Tampón 1 y volver a homogeneizar con un mazo. Pulse el homoGenizer 3-5 veces durante 5 s, colocando el tubo de nuevo en el hielo durante 30 s entre pulsos. <ol><li> Centrifugar la muestra una segunda vez durante 10 min a 1.000 xg y 4 ° C. Combinar el sobrenadante con el sobrenadante del paso 2.7. NOTA: El gránulo restante contiene proteínas nucleares y de membrana. </li></ol></li><li> Centrifugar los sobrenadantes combinados durante 20 min a 11.000 xg y 4ºC. Separar el sobrenadante (la fracción citosólica) en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,6 ml. </li><li> Resuspender el sedimento en 200 μl de tampón 2. Homogeneizar el sedimento triturándolo 3-5 veces. Centrifugar la muestra durante 20 minutos a 21.100 xg y 4 ° C. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el sedimento que contiene la fracción de membrana cruda en 50 μl de Tampón 2. </li><li> Inmediatamente proceder a los experimentos de unión a GTPγS (sección 3) o congelación rápida en nitrógeno líquido y almacenar a -80 ° C. </li></ol> 3. Unión [35S] GTPγS NOTA: Utilice el protocolo de seguridad radioquímica estándar cuando se manipula [35S] GTPγS y cuando se realizan experimentos de unión a [35S] GTPγS. Use guantes protectores y una bata de laboratorio en todo momento. Compruebe que el material de embalaje no tenga fugas ni grietas. Deseche los residuos y el exceso de reactivos de acuerdo con los protocolos institucionales. <ol><li> Preparar el tampón de unión incompleto (IBB) mezclando HEPES 50 mM, pH 7,4; MgCl _ {2} 5 mM; NaCl 100 mM; Y ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA) en agua destilada. </li><li> Diluir el stock [35S] GTPγS a 50 nM en Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 y DTT 10 mM. Hacer 500 μL de alícuotas y almacenarlas a -80 ° C. Utilice sólo una alícuota recién descongelada inmediatamente antes de iniciar el experimento. Descongele las partes alícuotas en hielo. </li><li> Preparar GTPγS no marcado con radiación disolviendo 1 mg de polvo de GTPγS en 177,62 μl de agua pura para una concentración de stock de 10 mM. Haga alícuotas de 10 μL y guárdelas en-20 ° C. </li><li> Preparar el tampón de unión completo (CBB) mediante la adición de IBB para incluir una concentración final de DTT 1 mM, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1% (p / v), 10 μM de GDP y [35S] GTPγS 0,1 nM. NOTA: El CBB ahora contiene GTP radiomarcado. Tome las precauciones de seguridad apropiadas mientras trabaja con soluciones radiactivas. </li><li> Descongele la fracción de membrana de la etapa 2.11 sobre hielo. </li><li> Cuantificar la concentración de proteína de la fracción de membrana a través de un ensayo de proteína Bradford utilizando un espectrofotómetro a 595 nm. <ol><li> Preparar una serie de diluciones de patrones de proteína BSA con tampón 2, a concentraciones finales de 0, 250, 500, 750, 1.500, 2.500 y 5.000 μg / mL. </li><li> Añadir 2 μl de cada estándar o membrana a 1 mL de reactivo Bradford en una cubeta. Mezclar completamente vortexing. </li><li> Ajustar el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm y en blanco utilizando la cubeta con 0 μg / ml de proteína. </li><li> Esperar 5 min y rCada una de las normas y cada una de las muestras a una longitud de onda de 595 nm. </li><li> Trazar la absorbancia de las normas frente a la concentración. Utilizando la Ley de Beer-Lambert (A = εcl, donde ε = coeficiente de extinción, l = longitud de la cubeta, yc = concentración), calcule la concentración de las muestras de membrana. </li></ol></li><li> Diluir las fracciones de membrana a una concentración de 100 μg de proteína / ml en IBB. NOTA: Un plato de 10 cm de células HEK293 típicamente produce entre 1 y 3 mg de proteína / ml. </li><li> Preparar las siguientes condiciones experimentales en tubos individuales de microcentrífuga de 1,6 ml: una serie de dilución de ligando, una condición de actividad basal para medir la unión basal de GTP y una condición de unión no específica para medir la unión no específica de GTP. <ol><li> Para la serie de dilución de ligando, preparar una serie de dilución del ligando de interés en un volumen final de 100 μl de CBB. Preparar la serie de ligandos a 2x la concentración final deseadaOns Espaciar las concentraciones de ligando para cubrir adecuadamente un rango de respuestas. <ol><li> Para ensayar el efecto de DAMGO sobre la unión a GTP a través de MOR1, se prepararon diluciones DAMGO de 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM y 2 pM en CBB (final Volumen: 100 mu l). NOTA: Por ejemplo, si el ligando de interés tiene un valor EC50 esperado de 10 μM, prepara diluciones de ligando de 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM y 2 mM. Estas cinco condiciones cubren una amplia gama de concentraciones y son 2x la concentración deseada para el ensayo. </li></ol></li><li> Para la unión basal, prepare un tubo con 100 μl de CBB solamente. </li><li> Para la unión no específica, preparar un tubo con 99 μL de CBB suplementado con 1 μl de GTPγS no marcado con 2 mM. </li></ol></li><li> Añadir 100 μl de la solución de membrana diluida (paso 3.7) a cada condición experimental. </li><li> Incubar las membranas con los diversos experimEn tubos de microcentrífuga de 1,6 ml durante 30 min a 25 ° C en un termomixador o en un agitador orbital. </li></ol> 4. Filtración de Membrana <ol><li> Preparar el tampón de lavado combinando Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; 5 mM de MgCl $ ₂ $ ; Y 50 mM de NaCl en agua destilada. </li><li> Presoak los filtros de fibra de vidrio en agua durante 10 min. NOTA: Los filtros tienen un tamaño de poro de 1 μm, un diámetro de 2,1 cm y un espesor de 675 μm. </li><li> Retire las muestras del termomixer o agitador orbital (paso 3.10). Hacer girar brevemente las muestras durante 5 s para recoger cada muestra en la parte inferior del tubo. </li><li> Retire la tapa del aparato de filtración al vacío. Coloque los filtros previamente calcinados en los orificios de vacío del aparato. Vuelva a asegurar la tapa del aparato para formar un sello de vacío. Encienda el aspirador. </li><li> Pipetear 195 μL de cada 200 μL de condición experimental en filtros para minimizar el error de la adsorción a las paredes del tubo y / o de la pipetaTing </li><li> Lavar los filtros tres veces con 1 mL de tampón de lavado helado. </li></ol> 5. Cuenta de centelleo líquido <ol><li> Coloque los viales de cuentaje de 5 ml en un bastidor de recuento. Añadir 5 ml de líquido de centelleo a cada vial. </li><li> Apague el vacío (paso 4.4). Retire la tapa del aparato de filtración al vacío. Usando pinzas, tome los filtros de los orificios de vacío del aparato de filtración y deje caer cada filtro en un vial de centelleo individual de 5 ml. </li><li> Prepare un vial con 195 μL de CBB para determinar la señal máxima. </li><li> Cubra cada vial de forma segura. Incubar los viales en un agitador orbital a 25 ° C durante 10 min. </li><li> Encienda el contador de centelleo. Programar el contador de centelleo para medir la emisión de isótopos 35 S durante 5 min por muestra usando el programa de centelleo asociado estándar. </li><li> Presione &quot;Inicio&quot; para tomar una cuenta. </li><li> Cuando finalice el conteo, deseche el vial contadoS como residuos peligrosos. </li></ol> 6. Análisis de datos <ol><li> Introduzca los datos en el software de estadísticas y análisis. <ol><li> Restar la unión no específica de cada una de las otras mediciones para determinar la unión específica. NOTA: El grado de unión no específica se determina por la muestra incubada con GTPγS no radiomarcado (etapa 3.8.3). </li><li> Abra el software de estadísticas y análisis y seleccione una entrada de conjunto de datos XY. </li><li> Introduzca los datos de unión específica de los experimentos de unión de [35S] GTPγS a una tabla de datos en el software de estadística y análisis. Introduzca las concentraciones agonistas, en forma de concentraciones molares, en la columna &quot;X&quot;. Introduzca los 35 S contables asociados como valores &quot;Y&quot;. </li></ol></li><li> Transforma los datos. <ol><li> Convierta los valores de X a su logaritmo respectivo haciendo clic en &quot;Analizar&quot;. Seleccione &quot;Transformar&quot; desde el built-iN análisis. </li><li> En el cuadro de diálogo &quot;Transformar&quot;, seleccione &quot;Transformar valores X usando&quot; y seleccione la función &quot;X = log (X)&quot;. Elija crear un nuevo gráfico de los resultados. </li><li> Haga clic en Aceptar.&quot; </li></ol></li><li> Normalizar los valores Y. <ol><li> Con los resultados transformados mostrados, haga clic en &quot;Analizar&quot;. Seleccione &quot;Normalizar&quot; de los análisis integrados. </li><li> En el cuadro de diálogo &quot;Normalizar&quot;, seleccione el botón de opción para definir 0% como el &quot;valor más pequeño en cada conjunto de datos&quot; y el 100% como &quot;el valor más grande en cada conjunto de datos&quot;. Seleccione el cuadro para presentar los resultados como porcentajes. Seleccione el cuadro para crear un nuevo gráfico de los resultados. </li><li> Haga clic en Aceptar.&quot; </li></ol></li><li> Ajustar una curva de regresión no lineal a los datos trazados. Realizar un análisis de regresión no lineal. <ol><li> Con los resultados normalizados mostrados, haga clic en &quot;Analizar&quot;. De los análisis incorporados, Seleccione &quot;Regresión no lineal (ajuste de curva)&quot;. </li><li> Si investiga un agonista, seleccione &quot;registro (agonista) frente a respuesta normalizada - pendiente variable&quot; en el cuadro de diálogo. </li><li> Si se investiga un antagonista, &quot;seleccione log (antagonista) frente a la respuesta normalizada - pendiente variable&quot; del cuadro de diálogo. </li><li> Haga clic en Aceptar.&quot; </li></ol></li><li> Revise el gráfico y los resultados para asegurarse de que el ajuste y los datos estén en un acuerdo razonable. Asegúrese de que la regresión coincida con el patrón general de los datos trazados y de que los residuos no sean tan grandes que hagan plana la curva dosis-respuesta. NOTA: El software resume los resultados de la regresión no lineal y detalla la concentración que provoca la respuesta semimáxima (EC50), el coeficiente de Hill (n H ) y la concentración inhibitoria semimaxal (IC50). </li><li> Derivar la potencia del parámetro agonista / antagonista. <ol><li> Derivar el agonista equConstantes de disociación de ilibrio (K $ _ { b } $) de cualquiera de los siguientes experimentos 16 , 17 , 18 <ol><li> Evaluar el cambio en la dosis-respuesta de un agonista en competencia con una concentración fija de antagonista. En este caso, CE50 &#39;= CE50 (1 + [antagonista] / antagonista Kb ), donde EC50&#39; es la EC50 desplazada a la derecha. </li><li> Evaluar la unión de [35S] GTPγS con concentraciones variables de antagonista en competencia con una concentración fija de agonista. En este caso, Kb = IC50 / (2 + (agonista / agonista EC50) n ) 1 / n - 1, donde n es el coeficiente de Hill del agonista. </li></ol></li></ol></li><li> Dependiendo de la variabilidad de los datos, repetir el experimento (pasos 3.8-5.6) para cada ligando aproximadamente 3-5 veces y el promedio de los resultados utilizando un software de estadística y análisisson. </li></ol>

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El presente protocolo describe dos métodos separados pero complementarios: un enfoque sencillo para fraccionar células y tejidos en compartimentos amplios pero distintos y un medio para investigar la señalización de GPCR midiendo la unión de [35S] GTPγS. El fraccionamiento celular eficiente tiene una amplia gama de aplicaciones, que van desde la extracción y enriquecimiento de proteínas, hasta la evaluación de la localización subcelular de proteínas, hasta el estudio de la farmacología de re...

Los receptores G-Protein-Coupled (GPCRs) son una gran familia de receptores de la superficie celular responsables de una notable variedad de procesos fisiológicos, incluyendo analgesia, olfacción y comportamiento 1 . Los GPCR actúan detectando señales externas específicas y posteriormente estimulando la señalización intracelular. Por lo tanto, marcan una unión clave entre los entornos externos e internos de una célula. Debido al papel crítico que juegan los GPCR en la biología, se han convertido en objetivos principales tanto para la investigación básica como para el descubrimiento de fármacos 2 , 3 . A diferencia de otras familias de receptores que se unen a ligandos discretos, los GPCR pueden unirse a tipos muy diferentes de moléculas. Mientras que un GPCR puede interactuar con péptidos, otro puede detectar fotones, pequeñas moléculas o iones 1 , 4 . Aunque sus ligandos son diversos, los GPCR se unifican en su arquitecto generalUre y función. Individual GPCRs se componen de siete α-helicoidal transmembrana proteínas con terminales extracelulares amino y intracelular carboxilo terminales [ 5 , 6] . GPCRs se acoplan a intracelulares G-proteínas heterotriméricas complejos de proteínas compuestas de α, β y γ subunidades-que median diversas vías de señalización [ 7] . La subunidad G $ α $ es una proteína de unión a nucleótidos de guanina que es inactiva cuando está unida a guanosina difosfato (GDP) y activa cuando está unida a guanosina trifosfato (GTP) 8,9. Cuando los GPCR se unen a sus ligandos, experimentan un cambio conformacional que permite que G $ α $ se disocie de G $ β $, permitiendo de este modo que G $ to $ cambie GDP por GTP $ TP $ . El propio receptor está fosforilado en su terminal carboxilo por varias serina / treónIne quinasas 10 , 11 e internalizadas para atenuar la señalización del receptor 12 , 13 , 14 . Mientras tanto, el monómero G α activado y el dímero G $ β $ proceden a activar vías de señalización distintas 7 . Existen varias isoformas de cada subunidad de proteína G, y cada isoforma se dirige a vías de flujo y sistemas de mensajero secundarios particulares. Las principales isoformas G $ s $ incluyen G $, $, G $ _ $, G $ _ { i } $ y G $ _ $ 12-13 . Típicamente, los GPCR individuales se asocian con una isoforma G α particular, uniendo así un estímulo externo a una respuesta celular específica 1 . La caracterización de una interacción GPCR-ligando es crítica para entender la biología del receptor. Dado que el intercambio PIB / GTP es uno de los primerosNts que sigue la unión de ligando, el seguimiento de la unión a GTP puede medir la activación o inhibición de GPCR. Ensayar más eventos descendentes en la señalización de GPCR a menudo no es tan cuantitativa o estequiométrica, puede no distinguir agonistas completos de los parciales, y puede requerir reactivos costosos. Además, el aumento de la unión a GTP a las proteínas G α es un evento casi universal tras la activación de GPCR, lo que significa que la medición de la unión a GTP es un ensayo ampliamente aplicable para monitorizar la actividad de la mayoría de los GPCR. La medición de la unión a GTP es un método simple y rápido para monitorizar la señalización de GPCR en células que sobreexpresan el receptor de interés o en tejido nativo. El presente protocolo detalla un ensayo funcional de unión a GTP usando un GPCR arquetípico, el receptor opioide μ (MOR1), para determinar cuantitativamente la actividad de un agonista y antagonista en la señalización de GPCR. Este protocolo describe primero cómo aislar las membranas crudas de las células que sobreexpresan MOR1. Tenga en cuenta queEste protocolo no se limita a sistemas de sobreexpresión y puede aplicarse a muchas fuentes de membrana, incluyendo tejido nativo o preparaciones que expresan múltiples receptores y proteínas G 15 . El protocolo entonces detalla cómo medir la unión de un análogo de GTP radiactivo a estas membranas en respuesta a concentraciones variables de [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) o naloxona, un agonista y antagonista de MOR1, respectivamente. El análogo de GTP, [35S] guanosina-5&#39;-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), no es hidrolizable. Esta propiedad es crítica porque las subunidades G α exhiben actividad GTPasa intrínseca 7 y eliminaría el gamma fosfato marcado sobre un radioquímico GTP hidrolizable. Las membranas son entonces atrapadas sobre filtros de fibra de vidrio y lavadas, después de lo cual el GTP radiomarcado se cuantifica por recuento de centelleo líquido. Se pueden derivar múltiples parámetros farmacológicos para caracterizarE la interacción receptor-ligando, incluyendo la respuesta semimáxima (EC50) y el coeficiente de Hill (nH) para los agonistas y la concentración inhibitoria medio-máxima (IC50) y la constante de disociación de equilibrio (Kb) para los antagonistas 16 , 17 , 18 .

<table><tbody><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato, sin glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313021</td><td>Warm en un 37&deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific 25030081</td><td></td><td>Warm en un 37&deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific 15140122</td><td></td><td>Warm en un 37&deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum Reducido Medio</td><td>Thermo Fisher Scientific 31985070</td><td></td><td>Warm en un 37&deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific 16000044</td><td></td><td>Warm en un 37&deg; C Baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 10 cm</td><td>Reactivo Sigma-Aldrich</td><td></td> CLS430167 <td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>1,6 mL tubos de microcentrífuga</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanoácido sulfónico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Tris( hidroximetil)aminometano (base de Trizma)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>etilenglicol-bis(&beta;-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA Tabletas, Mini, EASYpack Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotrietol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DO632</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-1</td><td></td></tr><tr><td>Motor</td> <td>de morteros de pelletsSigma-Aldrich</td><td>Z359971</td><td></td></tr><tr><td>Mortles</td><td>Bel Art</td><td>F19923-0001</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>[35S]guanosina-5'-O-(3-tio)trifosfato ([35S]GTP&gamma; S)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG030H</td><td></td></tr><tr><td>guanosina-5'-O-(3-tio)trifosfato no radiomarcado (GTP&gamma; S)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89378</td><td></td></tr><tr><td>difosfato de guanosina (GDP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51060</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reactivo</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>espectrofotómetro UV/VIS</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU640</td><td></td></tr><tr><td>espectrofotómetro cubetas</td><td>USA Scientific</td><td>9090-0460</td><td></td></tr><tr><td>agitador orbital</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>termomezclador</td><td>Eppendorf</td><td>535027903</td><td></td></tr><tr><td>filtros de fibra de vidrio&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1821-021</td><td></td></tr><tr><td>aparato de filtración al vacío</td><td>Millipore Corporation</td><td>XX2702550</td><td></td></tr><tr><td>microcentrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td>65717</td><td></td></tr><tr><td>Contador de centelleo</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>fluido de centelleo&nbsp;</td><td>Ecoscint A</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>viales de contador de centelleo</td><td>Beckman Coulter</td><td>592690</td><td></td></tr><tr><td>tapas de viales de centelleo</td><td>Beckman Coulter</td><td>592928</td><td></td></tr><tr><td>Prisma 6</td><td>Software GraphPad</td><td>Anticuerpo PRISM 6</td><td></td></tr><tr><td>ATP1A1</td><td>Estudios de desarrollo Hibridoma</td><td>a6F</td><td>1:1000 en 3% BSA</td></tr><tr><td>Anticuerpo GAPDH</td><td>EMD Millipore</td><td>CB1001</td><td>1:5000 en 3% BSA</td></tr><tr><td>Anticuerpo H2B</td><td>Señalización celular</td><td>2934S</td><td>1:2500 en 3%</td></tr><tr><td>BSA Anticuerpo PDI</td><td>Señalización</td> celular <td>3501S</td><td>1:1000 en 3% BSA</td></tr><tr><td>Anticuerpo HA</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>1:2000 en 3% BSA</td></tr></tbody></table>

medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína g mediante unión de gtp marcada con radio

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Los receptores G-Protein-Coupled (GPCRs) son una gran familia de receptores transmembrana que desempeñan papeles críticos en la fisiología celular normal y constituyen un objetivo farmacológico principal para múltiples indicaciones, incluyendo la analgesia, la regulación de la presión arterial y el tratamiento de la enfermedad psiquiátrica. Tras la unión del ligando, los GPCR catalizan la activación de las proteínas G intracelulares estimulando la incorporación de guanosina trifosfato (GTP). Las proteínas G activadas estimulan entonces las vías de señalización que provocan respuestas celulares. La señalización de GPCR puede monitorizarse midiendo la incorporación de una forma radiomarcada y no hidrolizable de GTP, [35S] guanosina-5&#39;-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), en proteínas G. A diferencia de otros métodos que evalúan más procesos de señalización aguas abajo, la unión de [35S] GTPγS mide un evento proximal en la señalización de GPCR y, de manera importante, puede distinguir agonisSt, antagonistas y agonistas inversos. El presente protocolo describe un método sensible y específico para estudiar la señalización de GPCR usando preparaciones de membrana cruda de un GPCR arquetípico, el receptor de opioides μ (MOR1). Aunque existen enfoques alternativos para las células y tejidos fraccionados, muchos son costo-prohibitivos, tediosos y / o requieren equipo de laboratorio no estándar. El presente método proporciona un procedimiento sencillo que enriquece las membranas crudas funcionales. Después de aislar MOR1, se determinaron diversas propiedades farmacológicas de su agonista, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) y antagonista, naloxona.

El fraccionamiento celular puede usarse para aislar y enriquecer proteínas asociadas a membranas a partir de proteínas citosólicas y nucleares. La Figura 1 es una transferencia de Western que demuestra el contenido de las tres fracciones primarias que se pueden recoger durante el proceso de fraccionamiento subcelular. Específicamente, la Figura 1 muestra que el fraccionamiento separa de forma limpia las proteínas de membrana ( <...

La unión a trifosfato de guanosina (GTP) es uno de los primeros eventos en la activación de receptores acoplados a proteína G (GPCR). Este protocolo describe cómo caracterizar farmacológicamente las interacciones específicas de GPCR-ligando mediante la monitorización de la unión del análogo de GTP marcado con radio, [35S] guanosina-5&#39;-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), en Respuesta a un ligando de interés.

Medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína G mediante unión de GTP marcada con radio

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar membranas celulares que contengan receptores acoplados a proteínas G o RAPG y estudiar la farmacología de RAPG mediante un ensayo funcional de unión de GTP. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioquímica sobre las propiedades farmacológicas de receptores acoplados a proteínas G ya establecidos o huérfanos. Las principales ventajas son que es sencillo, rápido y mide el evento más cercano en la señalización de los receptores acoplados a proteínas G.Primero, siembre células renales embrionarias humanas en una placa de cultivo tisular de 10 centímetros con 10 mililitros de DMEM completo. Incube las células a 37 °C y 5 % de dióxido de carbono hasta alcanzar una confluencia del 70 % al 80 %. Tras la incubación, transfecte las células con HAMOR1 utilizando un reactivo de transfección adecuado según las indicaciones del fabricante.A continuación, incubar las células como se describió previamente durante 36 a 48 horas. Después de retirar las células transfectadas del incubador, aspirar el medio y lavar las células con cinco mililitros de PBS frío. Luego, aspirar el PBS y el líquido excedente de la placa.A

measuring-g-protein-coupled-receptor-signaling-via-radio-labeled-gtp

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A continuación, describimos los métodos detallados en vivo de imágenes de células para la investigación de la quimiotaxis. Se presenta fluorescencia microscópica métodos para controlar la dinámica espacio-temporal de los eventos de señalización en las células que migran. La medición de la señalización de eventos nos permite entender mejor cómo una red de señalización de GPCR logra gradiente de detección de factores quimiotácticos y los controles de la migración direccional de las células...

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum</em

Un método para estimar la constante de afinidad de un agonista para el estado activo...

La cuantificación de la actividad agonista en el G receptores acoplados a proteínas

Nos genéticamente-codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina en varias posiciones específicas en los GPCR y mostrar la versatilidad del grupo azido en diferentes aplicaciones. Estos incluyen una tecnología fotorreticulación dirigido a identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de un GPCR, y la modificación bioorthogonal específica de sitio de los GPCR con una etiqueta de epítopo de péptido o de la sonda fluorescente.

Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

El ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia que aquí se describe es un sistema de cribado de la farmacología inversa medio de rendimiento para la identificación de ligando funcionalmente la activación (s) de G receptores acoplados a proteínas huérfanas (GPCRs).

Caracterización de G receptores acoplados a proteína por un ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia

Los métodos sencillos para detectar la activación selectiva de proteínas G por receptores acoplados a proteínas G siguen siendo un desafío pendiente en la señalización celular. Aquí, los biosensores de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster se han desarrollado mediante la unión por pares de un GPCR a péptidos de proteínas G para sondear los cambios conformacionales a concentraciones controladas en células vivas.

Conformaciones GPCR Proteína G-selectivos mide usando sensores FRET en un fluorómetro Ensayo de suspensión de células vivas

El ensayo celular se describe está diseñado para la identificación del receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4)-agentes interactuantes que inhiben o estimulan, ya sea competitivo o allosterically, la intracelular Ca2 + liberación iniciada por activación de CXCR4.

Un ensayo de cinética basada en fluorescencia Ca2 + movilización para identificar G proteína-juntó el Receptor agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos

Aquí se describe un protocolo para investigar la Prenilación y guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carga de la GTPasa Rho. Este protocolo consta de dos métodos detallados, es decir, ensayo de fraccionamiento de la membrana y un GTPasa-ligado del inmunosorbente. El protocolo puede ser usado para medir la Prenilación y GTP carga de diferentes otras GTPasas pequeñas.

Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

Dado que los GPCR son objetivos atractivos para drogarse, el cribado de ligando GPCR es por lo tanto indispensable para la identificación de compuestos de plomo y para estudios de desorfanización. Hacia estos esfuerzos, describimos PRESTO-Tango, una plataforma de recursos de código abierto utilizada para la elaboración simultánea de perfiles de reclutamiento transitorio de é-arrestin2 en aproximadamente 300 GPCRs utilizando un ensayo de reportero basado en TEV.

Interrogatorio paralelo del reclutamiento de la serie 2 para la detección de ligandos a escala de GPCR a escala mediante el ensayo PRESTO-Tango

S1P ejerce sus diversos efectos fisiológicos a través de la subfamilia de receptores S1P (S1PRs). Aquí, se describe una tubería para exponer las estructuras y la función de los S1PR.

Una tubería para investigar las estructuras y vías de señalización de los receptores de esfingosina 1-fosfato

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

Este protocolo describe el uso de biosensores basados en BRET para la medición en tiempo real de la activación de la proteína G en células HEK293 vivas tras la estimulación del ligando del receptor acoplado a proteína G. Aquí, el receptor β2-adrenérgico y el receptor cannabinoide tipo 1 sirven como ejemplos para demostrar la eficiencia de los sensores para varios subtipos de proteína G y en varios GPCR.

Biosensores de proteína G basados en BRET para medir la actividad del receptor acoplado a proteína G en células vivas

Aprende a medir la señalización de receptores GPCR mediante unión de GTP marcado con radio en células HEK. Este método simple y rápido permite caracterizar propiedades farmacológicas de receptores establecidos y huérfanos.

Medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína G mediante unión de GTP marcada con radio

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