Un ensayo de transferencia de puntos de 5 mC cuantificando el nivel de metilación de ADN de la distredenciación de condrocitos In Vitro

El objetivo general de este experimento es determinar los niveles de 5-metilcitosina durante la desdiferenciación de condrocitos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el tratamiento de defectos del cartílago basado en células, como la implantación de condrocitos autólogos. La principal ventaja de esta técnica es que es un método fiable, sencillo y rápido para detectar el nivel general de metilación del ADN para evaluar el fenotipo de los condrocitos.

La implicación de esta tecnología es estándar para nuestra participación en la implantación de condrocitos autólogos porque la metilación del ADN durante la desdiferenciación de condrocitos es un obstáculo importante para el tratamiento de implantación de condrocitos autólogos para defectos del cartílago. Aunque este método puede proporcionar información sobre los niveles de metilación del ADN en la desdiferenciación de condrocitos, también se puede aplicar a otros estudios de enfermedades, como la osteoartritis. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando leímos los protocolos en las referencias de un método de transferencia de puntos.

Por favor, muestre que la demostración de este método es fundamental, ya que los estados de una mancha de puntos son difíciles de nombrar. El ADN genómico debe desnaturalizarse y luego diluirse en serie. A continuación, se apoya en una membrana de nailon con carga positiva.

La demostración de los procedimientos estará a cargo de Zhaofeng Jia, un estudiante graduado de nuestro laboratorio. Los tejidos del cartílago articular utilizados en este estudio se aislaron de las articulaciones de la rodilla de los pacientes donantes después de un traumatismo. Con un bisturí estéril, corte el cartílago en trozos de uno o dos milímetros cúbicos.

A continuación, añada un miligramo por mililitro de colagenasa II y DMEM al cartílago picado. E incubar a 37 grados centígrados durante 12 a 16 horas para digerir los condrocitos. Al día siguiente, filtre la suspensión celular resultante a través de un filtro celular de 40 micrómetros.

Gira hacia abajo las celdas. Deseche el sobrenadante, agregue PBS y vuelva a centrifugar. Cuente las células con un hemocitómetro.

Y semilla a una densidad de 20.000 a 30.000 células por centímetro cuadrado y DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de estreptomicina de penicilina. Cultivo en incubadora a 37 grados centígrados durante 48 horas. Coseche las células subconfluentes utilizando EDTA al 0,25% de tripsina.

Y se replaca a una densidad de 6.600 células por centímetro cuadrado. Cultive los condrocitos en monocapas durante un máximo de seis pasajes y evalúe en los pasajes uno, dos, tres, cuatro y cinco. Para comenzar este procedimiento, recoja las células por tripsinización y centrifugación.

A continuación, vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón de lisis por cada 10 millones de células mediante pipeteo e inversión rápida. Incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Añadir proteinasa K a una concentración de 160 microgramos por mililitro de lisado celular e invertir la mezcla vigorosamente.

Incubar durante seis horas a 55 grados centígrados. Añadir a cada muestra un volumen de Tris pH 7.9 fenol saturado a cloroformo a alcohol isoamílico. Agite bien la muestra con la mano durante aproximadamente 20 segundos.

Centrifugar las muestras a temperatura ambiente a 13.000 veces G durante cinco minutos. Retire la fase acuosa superior y transfiérala a un tubo nuevo. Para eliminar el fenol, agregue un volumen igual de cloroformo a cada tubo.

Agite con la mano y gire hacia abajo. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Añadir 0,1 volumen de muestra de acetato de sodio tres molares pH ocho y dos volúmenes de etanol al 100%.

Almacene los tubos a 20 grados centígrados bajo cero durante la noche para precipitar el ADN genómico. Al día siguiente, centrifugar las muestras a cuatro grados centígrados durante 10 minutos a 16.000 veces G para granular el ADN genómico. Lavar las muestras con etanol al 70%.

Y centrifugar a cuatro grados centígrados durante dos minutos a 13, 000 veces G. Retire el sobrenadante con cuidado y seque al aire la bolita de ADN. Resuspender el ADN en 10 milimolares tris pH ocho 0,1 milimolar EDTA. Comience este procedimiento desnaturalizando el ADN aislado en hidróxido de sodio de 0,1 molar durante 10 minutos a 95 grados centígrados.

Neutraliza el ADN con un molar de acetato de amonio sobre hielo. Y luego diluir dos veces con agua bidestilada. El paso más crítico en los ensayos de mancha es la detección de las muestras, y recuerde hacerlo lentamente y con cuidado.

Trate de minimizar cada conjunto manchado a tres o cuatro milímetros de diámetro. Con una punta de pipeta de boca estrecha, localice cuidadosamente dos microlitros del ADN genómico diluido en serie en una membrana de nailon cargada positivamente en el centro de la rejilla. Seque la membrana a 80 grados centígrados durante 30 minutos.

A continuación, bloquee los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos sumergiendo la membrana en 5%BSA en TBST en una placa de Petri de 10 centímetros durante una hora a temperatura ambiente con una agitación suave. Después de una hora, lave la membrana tres veces en TBST durante cinco minutos cada vez. Incubar la membrana con un anticuerpo monoclonal anti-5-metilcitosina de ratón en TBST a cuatro grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, lave la membrana tres veces en TBST durante cinco minutos cada vez. A continuación, incubar con un anticuerpo secundario, peroxidasa de rábano picante conjugado con inmunoglobulina G anti-ratón de oveja en TBST durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar la membrana en TBST como antes, agregue el sustrato enzimático a la membrana e incube durante cinco a 10 minutos.

Por último, visualice la señal de anticuerpo secundario utilizando un kit de quimioluminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los condrocitos cultivados en una monocapa hasta el pasaje seis mostraron cambios fenotípicos progresivos, volviéndose muy pinzados y aplanados con los pasajes sucesivos. Este cambio de morfología es típico del proceso de desdiferenciación de condrocitos.

El ADN genómico se aisló de los condrocitos después de un número variable de pasajes y los niveles de metilación del ADN se evaluaron mediante un ensayo de transferencia de puntos específico de 5-metilcitosina. Las intensidades de los puntos se analizaron mediante la imagen J. Se observaron niveles de metilcitosina progresivamente elevados con un subcultivo prolongado, lo que sugiere una asociación entre el aumento general de los niveles de metilación y la desdiferenciación de los condrocitos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 24 horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar maximizar la concentración y pureza del ADN genómico. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el perfil de mecanización de ADN genómico, para responder a preguntas adicionales, como los condrocitos de la desdiferenciación en monocultivo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la implantación de condrocitos autólogos evaluaran la maquinación del ADN de los condrocitos y determinaran el fenotipo de los condrocitos en el tratamiento de defectos del cartílago.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la transferencia de puntos de 5-metilcitosina para detectar la palanca de mecanización degenerada para evaluar el fenotipo de condrocitos. No olvide que trabajar con fenol puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben usar guantes mientras se realiza este procedimiento.