Preparación y

El objetivo general de este procedimiento es presentar una técnica que garantice la modificación celular con microARN y, al mismo tiempo, la magnetización celular. Este método puede abordar desafíos clave en el campo de la medicina regenerativa, como la ingeniería genética de células antes del trasplante.

Además de permitir una modificación celular eficiente con microARN, también lo permitieron con óxido de hierro. Esto puede utilizarse para mejorar la retención celular en el lado de interés mediante la aplicación de un campo magnético. La terapia celular es muy prometedora para el tratamiento de enfermedades cardíacas, pero la baja retención celular y la supervivencia de las células necesitan mejorarse urgentemente.

Comience este procedimiento con el cultivo de células endoteliales de vena umbilical humana en preparación de complejos de transfección, tal como se describe en el protocolo escrito. 48 horas antes de la transfección, siembre las HUVEC en placas de pocillos de cultivo celular de plástico del tamaño adecuado. Con una densidad inicial de aproximadamente 13.000 células por centímetro cuadrado de superficie de crecimiento.

A continuación, prepare nanopartículas frescas de microARN/polietilenoimina/óxido de hierro superparamagnético. Primero, diluya 2,5 picomoles de microARN por centímetro cuadrado de superficie de crecimiento celular y solución de glucosa al cinco por ciento para obtener una concentración final de 0,125 picomoles de microARN por microlitro. A continuación, diluya la PEI en un volumen igual de solución de glucosa al cinco por ciento.

Añada el PEI diluido a la solución de microARN y vortexee la mezcla obtenida durante 30 segundos. Incube luego la mezcla de miR/PEI durante 30 minutos a temperatura ambiente. Soneque las MNP durante al menos 20 minutos en un baño ultrasónico a temperatura ambiente.

Luego, agregue la cantidad adecuada de solución de MNP a la mezcla lista de miR/PEI. Después de agitar durante 30 segundos, incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue la mezcla preparada de miR/PEI/MNP gota a gota directamente al medio de cultivo sobre las células.

Sustituya esta mezcla por medio de cultivo fresco seis horas después de la transfección. Después del análisis de la seguridad del vector descrito en el protocolo del texto, confirme y caracterice la localización intracelular de los complejos de transfección mediante microscopía confocal y microscopía de iluminación estructurada de superresolución. Para ello, siembre las HUVEC en cubreobjetos de vidrio recubiertos con gelatina colocados en los pocillos de placas de cultivo de 24 pocillos como antes.

Transfecte las células con miR/PEI/MNP marcado con tres colores e incube durante 24 horas a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida que contenga cinco por ciento de dióxido de carbono. Lave las laminillas primero con albúmina sérica bovina al dos por ciento y solución salina tamponada con fosfato, y luego únicamente con PBS. Fije las células incubando en paraformaldehído al cuatro por ciento o PFA a 37 grados Celsius durante 15 minutos.

Lave con PBS y luego tiña los núcleos con DAPI siguiendo protocolos estándar. A continuación, lave las células con PBS tres veces durante 15 minutos en el agitador para eliminar el exceso de colorante. Coloque los cubreobjetos preparados sobre portaobjetos de microscopio utilizando un medio de montaje adecuado y deje secar las preparaciones durante al menos una hora antes de usarlas en microscopía.

Adquiera imágenes utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63 aumentos en la configuración SIM descrita en el protocolo escrito. Para el direccionamiento celular y las condiciones dinámicas simuladas in vitro, primero transfecte las HUVECs en una placa de 24 pocillos como antes. Después de incubarlas durante 24 horas, lave las células.

Luego, agregue una vez tripsina en EDTA diluida en PBS e incube las células durante cuatro minutos a 37 grados Celsius antes de recolectarlas. Centrifugue las células recolectadas a 300 × g durante 10 minutos. Mezcle el sedimento celular obtenido de un pocillo con un mililitro de medio de cultivo fresco.

Y transfiera las células a un solo pocillo de una placa de 12 pocillos. Fije un imán pequeño localmente utilizando cinta adhesiva. Coloque la placa de cultivo sobre el agitador e incube la suspensión celular durante 12 horas a 150 RPM para simular condiciones dinámicas.

Luego lave las células y fíjelas utilizando PFA al cuatro por ciento. Tiña los núcleos con DAPI. Registre la adhesión celular mediante microscopía confocal de barrido láser con láseres de excitación de 405 y 504 nanómetros en modo z-stack para obtener los datos brutos.

Utilice el procesamiento de imágenes por proyección de intensidad máxima para crear imágenes destinadas al análisis. Para el análisis cuantitativo de células magnéticamente responsivas y no responsivas, primero transfecte las HUVECs en una placa de 24 pocillos. Incube las células durante 24 horas antes de lavarlas y recolectarlas como se describió anteriormente.

Re-suspenda el botón celular obtenido de cada pocillo con 500 microlitros de tampón estéril para clasificación celular, previamente calentado. Aplique la suspensión celular a una columna de clasificación magnética fijada por el imán suministrado. Luego, lave las columnas en el imán tres veces con tampón fresco para clasificación celular.

Recopile el flujo inicial como la fracción no sensible al campo magnético. Retire las columnas del imán y recopile inmediatamente la fracción de células sensibles al campo magnético empujando tampón fresco para clasificación celular a través de la columna usando un émbolo. Centrifugue ambas fracciones, Mag- y Mag+, a 300 veces G durante 10 minutos.

Después de resuspender el pellet celular en PBS, cuente las células y evalúe la viabilidad celular mediante un ensayo de exclusión de azul de tripano. Aisladas de cordones umbilicales, las HUVECs se caracterizan por la expresión del marcador endotelial CD31 y por la formación de tubos sobre una matriz de membrana basal. Las HUVECs transfectadas con miR/PEI/MNP incorporan todas el miR marcado.

Y su supervivencia permanece inalterada 24 horas después de la transfección. Además, la microscopía de superresolución muestra la localización paranuclear de complejos de transfección marcados con tres colores. La toxicidad del PEI se confirma mediante la funcionalidad reducida de las células transfectadas con miR/PEI.

Es importante destacar que MNP restaura las propiedades celulares. Las células modificadas con miR/PEI/MNP no difieren de las células no tratadas en cuanto a la formación de tubos. Además, estas células mantienen la comunicación de uniones en hendidura intercelulares, tal como se revela mediante la recuperación de fluorescencia tras el blanqueo fotónico.

Una vez que se siembra una suspensión de células modificadas con miR/PEI/MNP en los pocillos de una placa de cultivo colocada sobre un agitador rotatorio, las células tienden a migrar y adherirse en el área de aplicación local del imán. Las imágenes representativas muestran el crecimiento celular en la zona con aplicación del imán. Sin aplicación del imán.

Y en el centro del pocillo de cultivo, donde el flujo del líquido concentraba las células. Una vez dominada, la transfección celular puede realizarse en dos horas. Después de ver este video, debería tener una muy buena idea de cómo modificar de forma transitoria pero altamente eficiente las células endoteliales, incluyendo la magnetización.

Y también cómo caracterizar terminalmente el producto celular. Al intentar este procedimiento, es importante seguir las cantidades indicadas de células para la siembra, los componentes para la preparación de los complejos de transfección, el tiempo de incubación y el paso de lavado después de la transfección. Tenemos mucha esperanza en que este enfoque sea fácilmente transferible a otros tipos celulares para el tratamiento de otros órganos afectados.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar estudios in vivo con células magnetizadas modificadas. Estos podrían responder preguntas adicionales sobre si la carga de hierro en las células es eficiente para garantizar su retención en el lado de interés, así como para definir los límites de detección mediante resonancia magnética in vivo.