Preparación y In Vitro Caracterización de Magnetized miR-modificado células endoteliales

El objetivo general de este procedimiento es introducir una técnica que asegure la modificación celular con microARN y en paralelo la magnetización celular. Este método puede abordar desafíos clave en el campo de la medicina regenerativa. Como la ingeniería genética de células antes del trasplante.

Además de la modificación celular eficiente con microARN, lo permitieron con óxido de hierro. Esto se puede utilizar para mejorar la retención celular en el lado de interés mediante la aplicación de campos magnéticos. La terapia celular es muy prometedora para el tratamiento de las enfermedades cardíacas, la retención de hipocélulas y la supervivencia celular necesita mejorar urgentemente.

Comience este procedimiento con cultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana en preparación de complejos de transfección como se describe en el protocolo de texto. 48 horas antes de la transfección, siembre los HUVEC en placas plásticas de pocillos de cultivo celular de tamaño adecuado. Con una densidad celular inicial de aproximadamente 13.000 células por centímetro cuadrado de superficie de crecimiento.

A continuación, prepare nanopartículas frescas de miR / polietilenimeno / óxido de hierro súper paramagnético. Primero diluir 2,5 picomoles de microARN por centímetro cuadrado de superficie de crecimiento celular y solución de glucosa al cinco por ciento para obtener una concentración final de 0,125 picomoles de microARN por microlitro. A continuación, diluya el PEI en un volumen igual de solución de glucosa al cinco por ciento.

Añadir el PEI diluido a la solución de microARN y vorexear la mezcla obtenida durante 30 segundos. A continuación, incube la mezcla de miR/PEI durante 30 minutos a temperatura ambiente. Sonicar los MNP durante al menos 20 minutos en el baño de agua sonicante a temperatura ambiente.

A continuación, añada la cantidad adecuada de solución de MNP a la mezcla lista de miR/PEI. Después de agitar el vórtice durante 30 segundos, incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada la mezcla preparada de miR/PEI/MNP gota a gota directamente al medio de cultivo de las células.

Reemplace esta mezcla con medio de cultivo fresco seis horas después de la transfección. Después del análisis de la seguridad de los vectores como se describe en el protocolo de texto, confirme y caracterice la localización intracelular de los complejos de transfección mediante microscopía de iluminación estructurada confocal y de superresolución. Para hacerlo, siembre los HUVEC en cubreobjetos de vidrio recubiertos de gelatina colocados en los pocillos de placas de cultivo de 24 pocillos como antes.

Transfecte las células con miR / PEI / MNP marcado con 3 colores e incube durante 24 horas a 37 grados Celsius en una atmósfera humidificada que contenga un cinco por ciento de dióxido de carbono. Lave primero los cubreobjetos con albúmina sérica bovina al dos por ciento y solución salina tamponada con fosfato, y luego solo con PBS. Fije las células incubándolas en un cuatro por ciento de paraformaldehído o PFA a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Lavar con PBS y luego teñir los núcleos con DAPI siguiendo los protocolos estándar. A continuación, lave las células con PBS tres veces durante 15 minutos en la coctelera para eliminar el exceso de tinte. Coloque los portaobjetos de cubierta preparados en los portaobjetos del microscopio utilizando un medio de montaje adecuado y deje que los portaobjetos se sequen durante al menos una hora antes de utilizarlos para la microscopía.

Adquiera imágenes utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63 veces en la configuración de SIM que se encuentra en el protocolo de texto. Para la focalización de células y las condiciones dinámicas simuladas in vitro, primero transfecte los HUVEC en una placa de 24 pocillos como antes. Después de incubarlos durante 24 horas, lave las células.

A continuación, añada un x viajes en EDTA diluido en PBS e incube las células durante cuatro minutos a 37 grados centígrados antes de recoger las células. Centrifugar las células recogidas a 300 veces G durante 10 minutos. Mezcle el pellet de celda obtenido de un pocillo con un mililitro de medio de cultivo fresco.

Y transfiera las células a un solo pocillo de una placa de 12 pocillos. Fije un pequeño imán localmente con cinta adhesiva. Coloque la placa de cultivo en el agitador e incube la suspensión celular durante 12 horas a 150 RPM para simular condiciones dinámicas.

A continuación, lave las células y fíjelas con un cuatro por ciento de PFA. Teñir los núcleos con DAPI. Registre la unión de la célula mediante microscopía confocal de barrido láser con láseres de excitación de 19 nanómetros 405 y 504 en modo z-stack para obtener los datos sin procesar.

Utilice el procesamiento de imágenes de proyección de máxima intensidad para crear imágenes para su análisis. Para el análisis cuantitativo de células magnéticamente receptivas y no sensibles, primero transfecte los HUVEC en una placa de 24 pocillos. Incubar las células durante 24 horas antes de lavarlas y recogerlas como se ha descrito anteriormente.

Vuelva a suspender el pellet de células obtenido de cada pocillo con 500 microlitros de tampón de clasificación de células estériles calentado. Aplique la suspensión de celdas a una columna de clasificación magnética fijada por el imán suministrado. A continuación, lave las columnas del imán tres veces con tampón de clasificación de células nuevo.

Recoja el flujo como la fracción que no responde magnéticamente. Retire las columnas del imán y recoja inmediatamente la fracción de celda que responde magnéticamente empujando un tampón de clasificación de celdas fresco a través de la columna con un émbolo. Centrifugar las fracciones Mag y Mag + a 300 veces G durante 10 minutos.

Después de volver a suspender el gránulo de células en PBS, cuente las células y evalúe la viabilidad celular con un ensayo de exclusión de azul de tripano. Aislados de cordones umbilicales, los HUVEC se caracterizan por la expresión del marcador endotelial CD31 y por la formación de tubos en una matriz de membrana basal. Todos los HUVEC transfectados con miR/PEI/MNP adoptan miR etiquetados.

Y su supervivencia no se ve afectada 24 horas después de la transfección. Además, la microscopía de superresolución muestra la localización paranuclear de complejos de transfección marcados con 3 colores. La toxicidad del PEI se confirma por la disminución de la funcionalidad de las células transfectadas con miR/PEI.

Es importante destacar que la MNP restaura las propiedades de la célula. Las células modificadas con MIR/PEI/MNP no difieren de las células no tratadas en cuanto a la formación de tubos. Además, estas células mantienen la comunicación de la unión de brecha intercelular, como se revela a través de la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo.

Una vez que una suspensión de células modificadas con miR/PEI/MNP se siembra en los pocillos de una placa de cultivo colocada en el agitador giratorio, las células tienden a migrar y adherirse en el área de aplicación del imán local. Las imágenes representativas muestran el crecimiento celular en el área con la aplicación de imanes. Sin aplicación de imán.

Y en el centro del pozo de cultivo donde el flujo de líquido concentraba las células. Una vez dominada, la transfección celular se puede realizar en dos horas. Después de ver este video, debería tener una muy buena impresión sobre cómo modificar de manera transitoria pero altamente eficiente las células endoteliales, incluida la magnetización.

Y también cómo caracterizar terminalmente el producto celular. Al intentar este procedimiento, es importante seguir los números dados para la siembra de células, las cantidades de componentes para la preparación de complejos de transfección, el tiempo de incubación y el paso de lavado después de la transfección. Somos muy optimistas de que este enfoque será bien transferible a otros tipos de células para el tratamiento de otros órganos afectados.

Siguiendo este procedimiento se pueden realizar estudios in vivo con células magnetizadas modificadas. Podrían responder a preguntas adicionales sobre si la carga de hierro de las células es eficiente para garantizar su retención en el lado de interés. Y también para definir los límites de detección con resonancia magnética in vivo.