Name: Ca Cortical Multi-capa 2+ Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprende a realizar imágenes de Ca²⁺ en múltiples capas corticales de ratones con movimiento libre utilizando sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada. Este método permite visualizar grandes poblaciones de neuronas codificadas genéticamente.

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Los autores desean agradecer a V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger y K. Svoboda del Proyecto GENIE (Genetically-Encoded Neuronal Indicator and Effector) en el Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes por su generosa donación de AAV1-GCaMP6f A la Universidad de Pennsylvania Vector Core. También les gustaría dar las gracias al A. Olson y Neuroscience Microscopy Core en la Universidad de Stanford apoyado por NIH NS069375 subvención para sus servicios de microscopía confocal.

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<li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells%2C+including+respective+grid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li>
<li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li>
<li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Comm%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763(2016).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
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</ol>

Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes intereses en competencia: SG, SO y VC son empleados pagados en Inscopix.

La comprensión de la actividad del circuito neural durante el comportamiento despierto es un nivel vital de investigación neurocientífica necesaria para diseccionar eficazmente la función cerebral en la salud y la enfermedad. La corteza es una región particularmente importante para estudiar en el contexto del comportamiento despierto, ya que desempeña un papel importante en muchas funciones sensoriales, cognitivas y ejecutivas vitales 28 , 29 . Se cree que la columna cortical es la unidad funcional básica en la corteza y se sabe que la actividad a nivel de población de las células corticales difiere en función de su ubicación física dentro de la columna. Por ejemplo, las neuronas excitatorias en capas 2/3 en la corteza somatosensorial se proyectan principalmente a otras regiones neocorticales y modulan otras redes corticales 30 , mientras que las células en capas más profundas se proyectan principalmente a regiones subcorticales como el tálamo 31 . Registro de la actividad de cienS de las células corticales preespecificadas simultáneamente y de forma fiable a lo largo del tiempo a través de diferentes láminas en sujetos que se comportan libremente, mejorarían considerablemente nuestra comprensión del flujo de información cortical, permitiendo una más fina disección funcional de las columnas corticales informadas por información conductual en tiempo real, escamas. La recopilación de este nivel de datos de circuitos neuronales se hace posible con el uso de una plataforma de microscopía miniaturizada eficiente y aerodinámica para llevar a cabo la formación de imágenes de Ca 2+ a gran escala en sujetos que se comportan libremente (o sujetos fijados a la cabeza según se desee). Utilizado con los indicadores de calcio genéticamente codificados para permitir la focalización específica de tipo celular y la obtención de imágenes de un campo de visión de múltiples capas proporcionado por una sonda de prisma crónicamente implantada, este protocolo exploró un caso entre muchas aplicaciones posibles: observar diferencias laminares en procesamiento cortico somatosensorial cuando ratones Físicamente comprometido con un objeto novedoso ( Figura 5 ).Esta es la primera ilustración procedural de este tipo de método específico de tipo celular in vivo para estudiar múltiples capas corticales en animales despiertos y que se comportan libremente y amplía el espectro de métodos experimentales disponibles para comprender las estructuras laminares en el cerebro activo. El campo de visión periscópico habilitado por la sonda de prisma en esta técnica puede aplicarse de manera factible a otras estructuras cerebrales cuando se desea la preservación del tejido directamente dorsal a una región de interés; Por ejemplo, la obtención de imágenes CA3 podría lograrse sin interrupción de la función del hipocampo. El enfoque basado en la sonda de prisma para la obtención de imágenes de la actividad de Ca 2+ requiere la inserción física y la implantación permanente de un microprisma en la corteza, lo que equivale a la creación de una lesión cortical donde se inserta la sonda de lente. Esto puede resultar en interrupciones de los circuitos neuronales locales, incluyendo el corte de dendritas apicales y procesos. TSu procedimiento también causará una activación inicial de las células gliales en la región, aunque se espera que esté localizada en el tejido a unos 150 μm de la cara del prisma, y ​​que se disipe después de que el cerebro haya cicatrizado 22 . Es muy importante considerar si esta técnica afectará la anatomía normal del circuito y / o el comportamiento de los animales al planear experimentos. Siempre deben llevarse a cabo grupos de control conductual para asegurar que no haya alteraciones significativas en los comportamientos basales que podrían producir resultados confundidores experimentales. Utilizando esta técnica miniaturizada de imágenes de Ca 2+ móvil con manipulación neurofarmacológica, diversos paradigmas cognitivos, sociales, motores o intrínsecos de comportamiento, y combinándolo con otras métricas fisiológicas pueden profundizar y enriquecer los estudios enfocados en la comprensión de los roles funcionales de los circuitos neuronales en el comportamiento y la señal Procesamiento 32 . Supresión o activaciónLa modificación de ciertas vías moduladas por fármacos puede influir en comportamientos asociados, que pueden ser fácilmente estudiados utilizando esta tecnología 33 . Ramificación en diferentes tipos de células mediante la modificación de la orientación del indicador de calcio es otra aplicación potente y útil, y permite muchas combinaciones creativas de herramientas experimentales para abordar diversas preguntas del circuito neuronal.

La corteza es un actor esencial en muchas funciones mentales y de comportamiento complejas, desde la atención, la percepción sensorial y el control cognitivo de arriba hacia abajo 1 , 2 , 3 a las vías de motivación, recompensa y adicción 4 , 5 . La comprensión de los procesos computacionales que subyacen en su función es un objetivo importante para impulsar una mejor comprensión clínica de muchos trastornos mentales y del comportamiento. Muchas teorías actuales de la enfermedad psiquiátrica se centran en torno a la idea de que la disfunción del circuito neural cortical o la discordiación puede ser la causa de anormalidades cognitivas y conductuales que son las características de condiciones como la esquizofrenia 6 , el autismo 7 o el trastorno obsesivo-compulsivo 8 . Por lo tanto, la obtención de datos de la actividad neural de la población de coRtical circuitos dentro del contexto adecuado de la información de comportamiento simultánea es de gran importancia, y idealmente puede ser dirigido a tipos de células específicas para una disección de circuito neural más fino. Los microscopios miniaturizados junto con las microlentes de índice de refracción de gradiente implantables (GRIN) permiten el acceso óptico a conjuntos neuronales bajo condiciones de movimiento libre desde una diversidad de posibles regiones cerebrales 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , incluyendo la corteza 14 , 15 , 16 . El uso de un sistema de microscopía móvil, junto con los indicadores de calcio genéticamente codificados permite imágenes consistentes de la misma población celular que abarca cientos de neuronas durante días o semanas en muchas regiones del cerebro [ 9] , y puede serGenéticamente dirigidos a tipos celulares específicos utilizando vectores virales o técnicas transgénicas. Como se sabe que la corteza soporta diferentes funciones y se conecta a diferentes regiones cerebrales dependiendo de la ubicación de las células dentro de la lámina cortical 17 , 18 , 19 , estamos interesados ​​en obtener simultánea actividad neuronal multicapa en sujetos que se comportan despiertos. Aquí se demuestra cómo la imagen de cientos de neuronas marcadas fluorescentemente en los ratones que se comportan libremente durante días, utilizando el microscopio de fluorescencia miniaturizado 20 emparejado con una sonda de prisma implantado, que ofrece una visión multicapa de la corteza ( Figura 1 ). La sonda de prisma usada aquí está compuesta por dos lentes GRIN separadas: un prisma y una lente relé cilíndrica ( Figura 1 ). La luz del microscopio excita el marcado fluorescenteCélulas situadas a lo largo de la cara de formación de imágenes de la sonda de prisma, después de haber sido reflejadas por la hipotenusa de la porción de prisma de la sonda. La luz emitida de las células también refleja la hipotenusa del prisma, se recoge a través del objetivo del microscopio y llega al sensor en el microscopio. La sonda de prisma utilizada en este procedimiento está adaptada para facilitar su uso con equipos estereotáxicos estándar. El microscopio de fluorescencia miniaturizado 20 detecta transitorios de Ca 2+ potencialmente evocados potencialmente en poblaciones neuronales con una sola resolución de células, después de que dichas células han sido específicamente marcadas con indicadores fluorescentes codificados genéticamente con Ca2 + . En este protocolo, se inyecta Ca 2 + indicador codificado en un vector viral (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), el implante de una sonda de prisma, instalar el microscopio, a continuación, obtener varios días de somatosensorial (S1 miembro posterior) datos de actividad neuronal De una exposición de animalesD a nuevas superficies de objetos durante la exploración libre ( Figura 2 ).

<table><tbody><tr><td>Neurostar Motorizado Instrumento estereotáxico ultrapreciso para animales pequeños</td><td>Kopf</td><td>Modelo 963SD</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscopio</td> de cirugía <td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>Cirugía e imágenes</td></tr><tr><td>Mini sonda de termistor rectal (.062"/1.6 mm de diámetro) - Conector de 1/4"</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica para cirugía 5 X 12,5 cm&nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td></td></tr><tr><td>Cirugía DC controlador de temperatura</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Cirugía Microjeringa Bomba</td> World <td>Precision Instruments</td><td>modelo UMP3; serie 155788 F110</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &mu; L Jeringa</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>35 G Punta biselada Nanofil NDL 2PK</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF35BV-2</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Omnidrill35, 115 - 230 V</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Fresas</td></tr><tr><td>de cirugía para micro drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>imagenológico</td></tr><tr><td>AAV1. CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-PV3435</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Ketoprofeno</td><td>Victor Medical</td><td>5487</td><td></td></tr><tr><td>Cirugía Carprofeno</td><td>Victor Medical</td><td>1699008&nbsp;</td><td>cirugía</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Victor Medical</td><td></td><td>1001054 Surgery</td></tr><tr><td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Esponja de espuma de gel 12 cm x 7 mm)</td><td>Pfizer (Fisher Scientific)</td><td>NC9841478</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Pinza de cirugía</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Cuchillos de disección</td><td>Fino Science Tools</td><td>10055-12</td><td>Kit</td>de</tr><tr><td>implantes ProView</td> para cirugía <td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>Cirugía e imagen</td></tr><tr><td>Sonda de prisma ProView 1,0 mm-Dia. ~4,3 mm Longitud</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>Cirugía e imagen</td></tr><tr><td>Paquete adhesivo Kwik-Sil de 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>Sellador de cirugía</td></tr><tr><td>Kwik-Cast World</td><td>Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Cirugía e Imagen</td></tr><tr><td>Poste de montaje óptico en miniatura</td><td>Newport</td><td>M-TSP-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de imagen Placa base</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de imagen Cubierta de placa base</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td>Imaging</td></tr></tbody></table>

ca cortical multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

El circuito in vivo y la imagen funcional de nivel celular es una herramienta crítica para entender el cerebro en acción. Imágenes de alta resolución de las neuronas corticales de ratón con microscopía de dos fotones ha proporcionado una visión única en la estructura cortical, la función y la plasticidad. Sin embargo, estos estudios se limitan a los animales fijos de la cabeza, reduciendo en gran medida la complejidad del comportamiento disponible para el estudio. En este artículo, se describe un procedimiento para realizar la microscopía de fluorescencia crónica con la resolución celular a través de múltiples capas corticales en los ratones que se comportan libremente. Utilizamos un microscopio de fluorescencia miniaturizado integrado emparejado con una sonda de prisma implantada para visualizar y registrar simultáneamente la dinámica del calcio de cientos de neuronas a través de múltiples capas de la corteza somatosensorial mientras el ratón participaba en una nueva tarea de exploración de objetos durante varios días. Esta técnica puede adaptarse a otras regiones cerebrales de diferentes especies animales para otras pAradigmas

El protocolo descrito aquí describe una manera eficaz y eficiente para realizar longitudinal de múltiples capas Ca 2 + imágenes de cientos de neuronas corticales en libremente comportarse ratones utilizando prisma sondas ( Figura 1 ]. Los enfoques previos hacia la formación de imágenes corticales multicapa se han limitado principalmente a los animales fijos 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Con el fin de adquirir este nivel de datos en un contexto de libre comportamiento, una plataforma de microscopio miniaturizado se utilizó para la flexibilidad de comportamiento, Se usó un indicador de calcio codificado genéticamente (GCaMP6f) para dirigir una población celular específica (células CAMKII + en la corteza); Y se eligió una sonda de prisma para proporcionar un campo crónico de visión de múltiples capas. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Hemos demostrado el flujo de trabajo para la preparación del animal para la obtención de imágenes. Se inyectó un vector viral que codifica un indicador de calcio apropiado en la corteza ( Figura 2 , Paso 1), antes de implantar crónicamente una sonda de prisma para permitir el acceso óptico a las células marcadas ( Figura 2 , Etapa 2). Una placa base que sirve como muelle temporal seguro para la colocación del microscopio durante las sesiones de formación de imágenes se instaló entonces sobre la cabeza del animal ( Figura 2 , Paso 3), permitiendo la visualización de la actividad cortical a través de múltiples capas celulares en un comportamiento despierto experimental ( Figura 2 , Paso 4). Para asegurar que la población celular deseada estaba siendo dirigida, en la Figura 3 se muestra una sección cerebral coronal post-mortem de un ratón representativo, con el tracto de sonda prismática y el campo de visión marcados con respecto al laboratorio GCaMP6fEled neuronas en las capas 2/3 y 5 de la corteza somatosensorial. Durante el estado de vigilia, la actividad de las neuronas corticales somatosensoriales se registró cuando el ratón fue expuesto a tres entornos diferentes: campo abierto (día 1), familiarización con el objeto (día 2-4) y objeto novel (día 5) ( Figura 4 ). El día 1 el ratón fue colocado en un campo de comportamiento carente de cualquier objeto. El día 2-4 el ratón fue colocado en la arena con los mismos dos objetos texturalmente diferentes (una almohadilla de gel y un bloque de madera). El día 5, uno de los objetos fue reemplazado por un objeto nuevo. El animal se formó imágenes a lo largo de 5 días durante 20 minutos cada día. Después de la extracción celular utilizando el software de análisis de datos de imagen Ca2 + , se superpusieron filtros espaciales correspondientes a las ubicaciones de células en la proyección de intensidad fluorescente media de los datos de registro de microscopio( Figura 5) . Una línea discontinua blanca separa las capas 2/3 y 5 células. Correspondientes Ca 2 + trazas a partir de 5 células de cada una de las capas muestran el patrón de disparo de las células en dos contextos de comportamiento diferentes - objeto familiarización y novela objeto exposición. Las células de la capa 2/3 eran más activas en comparación con las células de la capa 5 el día en que el ratón fue expuesto a un objeto nuevo. Esto también es evidente a partir de los diagramas de trama que muestran la actividad de activación umbral de todas las células de imagen en los días 1, 4 y 5. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Figura 1: In Vivo Ca 2 + imágenes a través de múltiples capas corticales en movimientos libres de ratones. ( A ) Especificaciones de la sonda de prisma y representación del plano de imagen. El recubrimiento reflectante en el interior de la hipotenusa permite la formación de imágenes 90 ° desde el plano de inserción de la sonda de prisma. La lente cuFf se integra con el soporte de la lente, lo que agiliza el procedimiento de implantación y permite la visualización potencial de la fluorescencia del tejido ambiental durante la implantación ( B ) (i). Ilustración de la colocación de la craneotomía con sonda de prisma y la incisión del cuchillo en relación con el sitio de inyección del virus, y (ii) la ilustración de la localización del lado plano de la sonda del prisma con respecto a la incisión del cuchillo y el sitio de inyección del virus. ( C ) Ilustración de la configuración de formación de imágenes de Ca 2+ in vivo que muestra el recorrido de la luz para un área pequeña dentro del campo de visión completo a través de la sonda de prisma implantada en la corteza del ratón. ( D ) Ejemplo de campo de visión durante la instalación de la sonda de prisma. Microscopio en miniatura se une al soporte de la lente, que contiene la sonda de prisma que permite comprobar la expresión del virus durante la instalación de la sonda de prisma. ( E ) Integración de microscopio con sonda prismática para la obtención de imágenes corticales multicapa de células S1 marcadas con GCaMP6f. F Ejemplo de campo de visiónDurante la instalación de la placa base. El patrón transparente de vasos sanguíneos es visible en el momento de la instalación de la placa base con algunas células en imagen cruda. Más células son claramente visibles cuando se activa DF / F en la ventana del software de adquisición. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Figura 2: Esquema que muestra la línea de tiempo de los eventos de flujo de trabajo para la implantación de la sonda de prisma y la instalación de microscopio. El número de semanas se representa en el eje X y los pasos del flujo de trabajo de los procedimientos a lo largo del eje Y. ( A ) Gráfico que ilustra la inyección viral (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) a lo largo del mismo eje dorso-ventral, para etiquetar múltiples capas de la corteza somatosensorial del ratón. ( B ) 2 semanas después de las inyecciones de virus, un problema de prismaE se implanta en un eje que es paralelo a los sitios de inyección de virus. ( C ) Aproximadamente una semana después de la implantación de la sonda de prisma, se comprueba la expresión del animal con el microscopio y se monta una placa de base en la cabeza si una población de células es visible. ( D ) El animal está entonces listo para la imagen crónica durante las tareas de comportamiento relevantes (Clip art de ratón modificado después de permiso de UW-Madison Bioquímica MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Figura 3: Validación histológica postmortem de la localización de la sonda de prisma y expresión de GCaMP. ( A ) Sección coronal de un cerebro de ratón representativo que muestra el tramo de la sonda prismática y con su lado de formación de imágenes enfrentadoLas células que expresan GCaMP6f (AAV1.CaMKII.GCaMP6f expresadas en neuronas en las capas 2/3 y 5). ( B ) La misma sección coronaria cerebral después de la tinción para DAPI. Barra de escala = 250 μm ( C ) Visualización ampliada de las células que expresan GCaMP6f en la corteza somatosensorial. Barra de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Figura 4: La actividad del ratón durante la habituación, la familiarización y la prueba de exposición de objetos noveles fue rastreada mediante video utilizando software de vídeo. ( A ) El día 1, el animal fue colocado en un campo de comportamiento desprovisto de cualquier objeto (Campo Abierto). ( B ) En los días 2-4, se colocaron los mismos dos objetos texturalmente diferentes (almohadilla de gel y bloque de madera) en la arena (Object FamiLiarización). ( C ) El día 5, uno de los objetos fue reemplazado por un objeto novedoso (bloque de madera con papel de lija) (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Figura 5: Dinámica de calcio de capas superficiales y profundas de la corteza somatosensorial de un ratón representativo de imágenes con el microscopio. ( A ) Imagen fusionada de filtros espaciales neuronales (manchas verdes) y proyección de intensidad de fluorescencia media de la grabación del microscopio a través del campo de visión de la sonda prismática. Frontera entre capas supragranulares e infragranulares indicadas por una línea blanca discontinua. Barra de escala = 100 μm. ( B ) Trazas de calcio de cinco células superficiales y profundas de capa de ejemplo (llena azul y rojo cElls en el panel A), indicando unidades de desviación estándar de fluorescencia siguiendo el análisis de componente principal y independiente. Barra de escala horizontal 50 s y barra de escala vertical 10 SD ( C ) Gráfica ráster de las células de capas superficiales (capas 2/3) y profundas (capa 5) mostradas sobre Campo abierto, Familiarización de objetos y Exploración de objetos noveles. Barra de escala = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un procedimiento para la realización de gran escala Ca 2 + imágenes con resolución celular a través de múltiples capas corticales en los ratones que se mueven libremente. Cientos de células activas se pueden observar simultáneamente usando un microscopio en miniatura montado en la cabeza acoplado con una sonda de prisma implantada.

Ca Cortical Multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

El objetivo general de este procedimiento es permitir la visualización simultánea de la actividad neuronal en múltiples capas de neuronas corticales mediante indicadores de calcio en un ratón libre de movimiento y comprender el funcionamiento de los circuitos neuronales utilizando un microscopio de fluorescencia miniaturizado montado en la cabeza. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia de sistemas, como, ¿cómo se propaga la información a través de múltiples capas de la corteza? La principal ventaja de esta técnica es que permite visualizar poblaciones grandes de neuronas codificadas genéticamente a través de múltiples capas corticales en animales libres de movimiento, de forma fiable a lo largo del tiempo.Con el fin de visualizar neuronas codificadas genéticamente de múltiples capas corticales en un animal que se comporta libremente, es necesario realizar los siguientes procedimientos, y este protocolo destaca la implantación de la sonda prismática, la instalación de la placa base y la imagenología in vivo en un ratón que se comporta libremente. Para comenzar este procedimiento, una o dos semanas después de la inyección del virus, coloque al animal en el aparato estereotáxico y prepárese para la cirugía de implantación de la sonda prismática desinfectándola en etanol al 70 % y limpiándola con papel para lentes. A continuación, realice una craneotomía circular utilizando un microtaladro con una fresa de 0,5 milímetros.Asegúrese de que el diámetro de la craneotomía sea ligeramente mayor que el diámetro del prisma. Luego, posicione la craneotomía de manera que, cuando el prisma se inserte en la corteza, su borde plano quede frente al sitio de inyección del virus y dentro de un radio de 150 a 200 micrones. A continuación, retire la duramadre con pinzas finas.Mantenga siempre el tejido húmedo con solución salina estéril una vez que se expone el tejido cerebral. Esto también mantendrá la presión sobre el tejido. Para aliviar la presión en el tejido cerebral durante la inserción de la sonda prismática, cree un trayecto de inserción sujetando una hoja de bisturí de borde recto al brazo portaelectrodos del aparato estereotáxico.Colóquelo en un ángulo tal que la placa del cuchillo sea perpendicular a la curvatura del cráneo y esté en un plano paralelo a la columna de inyección del virus. Posicione cuidadosamente el cuchillo por encima de la craneotomía, a lo largo de su borde medio interno y aproximadamente a 200 micrómetros de forma lateral respecto al sitio de inyección del virus, con el filo cortante orientado hacia posterior. Ponga a cero el eje Z cuando la punta del cuchillo toque la piamadre.Luego, bájelo gradualmente hasta una profundidad a la que se insertará la sonda de prisma. Posteriormente, mueva el bisturí un milímetro hacia posterior, para crear un trayecto para el borde delantero del prisma. Retraiga lentamente el bisturí utilizando el micromanipulador del brazo estereotáxico en incrementos de 10 micrones por segundo, y coloque un trozo de esponja de gel espuma empapada con solución salina estéril sobre la incisión.A continuación, sujete el portador de lentes al brazo del manipulador estereotáxico con el mismo ángulo que el cuchillo en el paso anterior. Alinee el prisma de manera que el lado plano del prisma quede por encima de la incisión y paralelo a la columna de inyección del virus. Una vez que el prisma esté en el ángulo correcto, bájelo gradualmente al cerebro en incrementos de 10 micrones hasta un nivel Z final de 1,1 milímetro desde la superficie del cerebro, para esta sonda.Cubra cualquier tejido expuesto alrededor del prisma en la craneotomía con una capa protectora muy delgada de adhesivo elastómero, utilizando una aguja de 25 gauge. Para evitar que la lente se mueva dentro de la craneotomía, después de que el adhesivo elastómero haya curado, utilice una aguja de 25 gauge para aplicar algo de adhesivo de cianoacrilato y fijar el vidrio de la lente del prisma al cráneo adyacente sobre la capa de adhesivo elastómero. Una vez que el adhesivo de cianoacrilato haya curado, desenrosque el soporte de la lente y retire cuidadosamente el microscopio.A continuación, retire lentamente el brazo del manipulador estereotáxico para dejar el cabezal del prisma firmemente implantado. Aplique una capa de acrílico dental o adhesivo de cianoacrilato alrededor del implante, cubriendo la superficie expuesta del cráneo sin tocar el tejido muscular retraído circundante. Cubrir una amplia zona del cráneo con esta tapa craneal ayudará posteriormente en la fijación de la placa base.Posteriormente, mezcle el catalizador y la base de un cartucho de adhesivo de silicona y coloque una gota del elastómero dentro del manguito del cabezal del prisma, cubriendo la parte superior de la lente del cabezal, con el fin de prevenir cualquier daño y la acumulación de polvo. De una semana a diez días después de implantar el cabezal del prisma, verifique la expresión del virus en el tejido a través del cabezal del prisma implantado. Para ello, retire la tapa de adhesivo de silicona que cubre la superficie de la lente del cabezal del prisma implantado.Examine la superficie de la lente de la sonda y limpie suavemente cualquier residuo con papel para lentes y etanol al 70 %, para asegurar que la superficie de imagen esté limpia. A continuación, fije una placa base al microscopio y apriete el tornillo de sujeción de la placa base para mantenerla en posición. Luego, asegure el microscopio en el sujetador del microscopio ubicado en el brazo del micromanipulador estereotáxico.Sujete el agarre a una varilla que pueda montarse en el brazo del micromanipulador estereotáxico. Posteriormente, coloque el microscopio por encima de la lente de la sonda de prisma, utilizando el brazo del micromanipulador estereotáxico. Inspeccione visualmente la orientación observando la lente del prisma desde el lateral y la parte trasera de la plataforma del animal.Debe alinearse el eje óptico tanto del objetivo del microscopio como de la sonda de prisma. A continuación, inicie el software de adquisición, seleccione el proyecto y encienda el LED del microscopio mediante el software. Evalúe la calidad del alineamiento del microscopio enfocando la fase superior de la lente de la sonda de prisma implantada en el software de adquisición, moviendo el brazo manipulador del estereotáxico.Cuando esté correctamente alineado, los bordes de la lente de la sonda prismática deben verse nítidos. Ajuste la distancia física del microscopio por encima de la sonda prismática implantada, utilizando el brazo manipulador estereotáxico para obtener el plano focal deseado dentro del tejido. Luego, utilice acrílico dental o cianoacrilato para fijar permanentemente la placa base a la tapa de acrílico y así cerrar la brecha.Es fundamental no aplicar adhesivo en ninguna parte del cuerpo del microscopio ni en el tornillo de fijación mientras se pega la placa base a la cabeza del animal. Ahora, suelte el microscopio del sujetador y retire el sujetador del microscopio. Si se utilizó cianoacrilato u otro adhesivo transparente, cúbralo con esmalte de uñas negro o una capa de cemento dental negro para evitar la entrada de luz ambiental en la tapa craneal, lo cual podría contaminar las imágenes futuras obtenidas durante los experimentos.A continuación, proteja la sonda de prisma implantada con la tapa de la placa base. En este procedimiento, conecte el microscopio a su caja de adquisición de datos conectada al ordenador e inicie el software de adquisición. Luego, retire la tapa de la placa base girando la tornillo de fijación de la placa base en sentido antihorario y levantando la tapa de la placa base.Coloque el microscopio en la placa base sobre el animal. El microscopio debe encajar en su lugar con la ayuda de los imanes en la placa base. Luego, avance el tornillo de fijación de la placa base hasta sentir una ligera resistencia.A continuación, seleccione la configuración de adquisición que se utilizará para recopilar los datos, que incluye la velocidad de fotogramas para capturar los datos. Verifique el histograma de la imagen al seleccionar la configuración para asegurar una buena relación señal-ruido. Luego, comience a adquirir los datos.Una vez finalizada la grabación, afloje el tornillo de fijación de la placa base y desacople el microscopio de la placa base tirando suavemente hacia arriba del microscopio. Posteriormente, coloque nuevamente la tapa de la placa base y apriete suavemente el tornillo de fijación de la placa base. A continuación se muestra una demostración de un animal con el microscopio montado, interactuando libremente con los objetos en el área de comportamiento.Durante la obtención de imágenes en animales despiertos y con comportamiento activo mediante el sistema, se registró la actividad de las neuronas corticales somatosensoriales cuando el ratón fue expuesto a tres ambientes diferentes: campo abierto el día uno, familiarización con objetos los días dos a cuatro, y objeto novedoso el día cinco. Tras la extracción de las células utilizando el software de análisis de datos de imágenes de calcio, se superpusieron filtros espaciales correspondientes a las ubicaciones celulares sobre la proyección de intensidad media de fluorescencia de los datos grabados por el microscopio.Una línea discontinua blanca separa las capas de dos, tres y cinco células. Rastros de calcio correspondientes de cinco células de cada una de las capas muestran el patrón de activación de las células en dos contextos conductuales diferentes: familiarización con el objeto y exposición a un objeto novedoso. Las células de las capas dos y tres fueron más activas en comparación con las células de la capa cinco en el día en que el ratón fue expuesto a un objeto novedoso.A continuación se muestran el resto de las gráficas de la actividad celular de las entidades superficiales, cuando el animal se encontraba en campo abierto, familiarización con objetos y exploración de objetos novedosos. Una vez dominadas, cada técnica puede completarse en menos de una hora si se realiza adecuadamente. Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores de neurociencia de sistemas exploren tipos celulares específicos en distintas áreas cerebrales, aprovechando diferentes paradigmas conductuales en modelos de fisiología neural normal y en enfermedad.Tras este protocolo, se deberá tener una buena comprensión de cómo etiquetar múltiples capas de la corteza somatosensorial, implantar una sonda prismática y fijar un microscopio miniaturizado montado en la cabeza.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución.

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

En ángulo recto microprismas insertado en la corteza cerebral del ratón permite obtener imágenes profundas de múltiples capas corticales con un punto de vista típicamente se encuentran en el segmento. De un milímetro microprismas ofrecen un campo de visión amplio (~ 900 m) y resolución espacial suficiente para resolver las espinas dendríticas. Demostramos capa de imagen V neuronal y vascular mediante imágenes neocortical microprismas.

Imágenes in vivo de Deep capas corticales con un microprisma

En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la...

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

Fuente: Thapa, R., et. al., Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio en el cerebro profundo In Vivo.  J. Vis. Exp. (2021)El video muestra imágenes de calcio en tiempo real utilizando un miniscopio en un ratón transducido, correlacionando la actividad neuronal con el comportamiento.

Imágenes de calcio en tiempo real de la corteza prefrontal medial de un ratón utilizando un miniscopio

El uso de múltiples ángulos para cortar el cerebro pup ratón, mejoramos sobre una rebanada cerebral agudo descrito previamente-que captura las conexiones entre la mayoría de las principales estructuras del mesencéfalo y el prosencéfalo auditivas.

Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala

Aquí describimos un procedimiento para tejido claro etiquetado fluorescente y a gran escala imagen de tejido de cerebro de ratón que, por lo tanto, permite la visualización de la organización tridimensional de tipos celulares en el neocortex.

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

El presente protocolo describe la fabricación de una ventana craneal grande (6 x 3 mm2) utilizando envoltura de alimentos, silicona transparente y vidrio de cubierta. Esta ventana craneal permite experimentos in vivo de imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones en el mismo ratón.

In vivo Imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones de un ratón usando una ventana craneal grande

Este protocolo detalla el procedimiento para obtener imágenes de las respuestas de calcio en el colículo superior (SC) de ratones despiertos, incluida la obtención de imágenes de la actividad de una sola neurona con microscopía de dos fotones mientras se deja la corteza intacta en ratones de tipo salvaje, y la obtención de imágenes de todo el SC con microscopía de campo amplio en ratones mutantes de corteza parcial.

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

Cuando se integra con una placa de cabeza y un diseño óptico compatible con microscopios de uno y dos fotones, la lente de microprisma presenta una ventaja significativa en la medición de respuestas neuronales en una columna vertical en diversas condiciones, incluidos experimentos bien controlados en estados de cabeza fija o tareas de comportamiento natural en animales que se mueven libremente.

Obtención de imágenes a largo plazo de poblaciones neuronales identificadas mediante microprismas en animales que se mueven libremente y con la cabeza fija

Aprende a realizar imágenes de Ca²⁺ en múltiples capas corticales de ratones con movimiento libre utilizando sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada. Este método permite visualizar grandes poblaciones de neuronas codificadas genéticamente.

Ca Cortical Multi-capa 2+ Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada (Video) | JoVE Journal

Ca Cortical Multi-capa

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