Ca Cortical Multi-capa

El objetivo general de este procedimiento es permitir la visualización simultánea de la actividad neuronal en múltiples capas de neuronas corticales mediante indicadores de calcio en un ratón libre de movimiento y comprender el funcionamiento de los circuitos neuronales utilizando un microscopio de fluorescencia miniaturizado montado en la cabeza. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia de sistemas, como, ¿cómo se propaga la información a través de múltiples capas de la corteza? La principal ventaja de esta técnica es que permite visualizar poblaciones grandes de neuronas codificadas genéticamente a través de múltiples capas corticales en animales libres de movimiento, de forma fiable a lo largo del tiempo.

Con el fin de visualizar neuronas codificadas genéticamente de múltiples capas corticales en un animal que se comporta libremente, es necesario realizar los siguientes procedimientos, y este protocolo destaca la implantación de la sonda prismática, la instalación de la placa base y la imagenología in vivo en un ratón que se comporta libremente. Para comenzar este procedimiento, una o dos semanas después de la inyección del virus, coloque al animal en el aparato estereotáxico y prepárese para la cirugía de implantación de la sonda prismática desinfectándola en etanol al 70 % y limpiándola con papel para lentes. A continuación, realice una craneotomía circular utilizando un microtaladro con una fresa de 0,5 milímetros.

Asegúrese de que el diámetro de la craneotomía sea ligeramente mayor que el diámetro del prisma. Luego, posicione la craneotomía de manera que, cuando el prisma se inserte en la corteza, su borde plano quede frente al sitio de inyección del virus y dentro de un radio de 150 a 200 micrones. A continuación, retire la duramadre con pinzas finas.

Mantenga siempre el tejido húmedo con solución salina estéril una vez que se expone el tejido cerebral. Esto también mantendrá la presión sobre el tejido. Para aliviar la presión en el tejido cerebral durante la inserción de la sonda prismática, cree un trayecto de inserción sujetando una hoja de bisturí de borde recto al brazo portaelectrodos del aparato estereotáxico.

Colóquelo en un ángulo tal que la placa del cuchillo sea perpendicular a la curvatura del cráneo y esté en un plano paralelo a la columna de inyección del virus. Posicione cuidadosamente el cuchillo por encima de la craneotomía, a lo largo de su borde medio interno y aproximadamente a 200 micrómetros de forma lateral respecto al sitio de inyección del virus, con el filo cortante orientado hacia posterior. Ponga a cero el eje Z cuando la punta del cuchillo toque la piamadre.

Luego, bájelo gradualmente hasta una profundidad a la que se insertará la sonda de prisma. Posteriormente, mueva el bisturí un milímetro hacia posterior, para crear un trayecto para el borde delantero del prisma. Retraiga lentamente el bisturí utilizando el micromanipulador del brazo estereotáxico en incrementos de 10 micrones por segundo, y coloque un trozo de esponja de gel espuma empapada con solución salina estéril sobre la incisión.

A continuación, sujete el portador de lentes al brazo del manipulador estereotáxico con el mismo ángulo que el cuchillo en el paso anterior. Alinee el prisma de manera que el lado plano del prisma quede por encima de la incisión y paralelo a la columna de inyección del virus. Una vez que el prisma esté en el ángulo correcto, bájelo gradualmente al cerebro en incrementos de 10 micrones hasta un nivel Z final de 1,1 milímetro desde la superficie del cerebro, para esta sonda.

Cubra cualquier tejido expuesto alrededor del prisma en la craneotomía con una capa protectora muy delgada de adhesivo elastómero, utilizando una aguja de 25 gauge. Para evitar que la lente se mueva dentro de la craneotomía, después de que el adhesivo elastómero haya curado, utilice una aguja de 25 gauge para aplicar algo de adhesivo de cianoacrilato y fijar el vidrio de la lente del prisma al cráneo adyacente sobre la capa de adhesivo elastómero. Una vez que el adhesivo de cianoacrilato haya curado, desenrosque el soporte de la lente y retire cuidadosamente el microscopio.

A continuación, retire lentamente el brazo del manipulador estereotáxico para dejar el cabezal del prisma firmemente implantado. Aplique una capa de acrílico dental o adhesivo de cianoacrilato alrededor del implante, cubriendo la superficie expuesta del cráneo sin tocar el tejido muscular retraído circundante. Cubrir una amplia zona del cráneo con esta tapa craneal ayudará posteriormente en la fijación de la placa base.

Posteriormente, mezcle el catalizador y la base de un cartucho de adhesivo de silicona y coloque una gota del elastómero dentro del manguito del cabezal del prisma, cubriendo la parte superior de la lente del cabezal, con el fin de prevenir cualquier daño y la acumulación de polvo. De una semana a diez días después de implantar el cabezal del prisma, verifique la expresión del virus en el tejido a través del cabezal del prisma implantado. Para ello, retire la tapa de adhesivo de silicona que cubre la superficie de la lente del cabezal del prisma implantado.

Examine la superficie de la lente de la sonda y limpie suavemente cualquier residuo con papel para lentes y etanol al 70 %, para asegurar que la superficie de imagen esté limpia. A continuación, fije una placa base al microscopio y apriete el tornillo de sujeción de la placa base para mantenerla en posición. Luego, asegure el microscopio en el sujetador del microscopio ubicado en el brazo del micromanipulador estereotáxico.

Sujete el agarre a una varilla que pueda montarse en el brazo del micromanipulador estereotáxico. Posteriormente, coloque el microscopio por encima de la lente de la sonda de prisma, utilizando el brazo del micromanipulador estereotáxico. Inspeccione visualmente la orientación observando la lente del prisma desde el lateral y la parte trasera de la plataforma del animal.

Debe alinearse el eje óptico tanto del objetivo del microscopio como de la sonda de prisma. A continuación, inicie el software de adquisición, seleccione el proyecto y encienda el LED del microscopio mediante el software. Evalúe la calidad del alineamiento del microscopio enfocando la fase superior de la lente de la sonda de prisma implantada en el software de adquisición, moviendo el brazo manipulador del estereotáxico.

Cuando esté correctamente alineado, los bordes de la lente de la sonda prismática deben verse nítidos. Ajuste la distancia física del microscopio por encima de la sonda prismática implantada, utilizando el brazo manipulador estereotáxico para obtener el plano focal deseado dentro del tejido. Luego, utilice acrílico dental o cianoacrilato para fijar permanentemente la placa base a la tapa de acrílico y así cerrar la brecha.

Es fundamental no aplicar adhesivo en ninguna parte del cuerpo del microscopio ni en el tornillo de fijación mientras se pega la placa base a la cabeza del animal. Ahora, suelte el microscopio del sujetador y retire el sujetador del microscopio. Si se utilizó cianoacrilato u otro adhesivo transparente, cúbralo con esmalte de uñas negro o una capa de cemento dental negro para evitar la entrada de luz ambiental en la tapa craneal, lo cual podría contaminar las imágenes futuras obtenidas durante los experimentos.

A continuación, proteja la sonda de prisma implantada con la tapa de la placa base. En este procedimiento, conecte el microscopio a su caja de adquisición de datos conectada al ordenador e inicie el software de adquisición. Luego, retire la tapa de la placa base girando la tornillo de fijación de la placa base en sentido antihorario y levantando la tapa de la placa base.

Coloque el microscopio en la placa base sobre el animal. El microscopio debe encajar en su lugar con la ayuda de los imanes en la placa base. Luego, avance el tornillo de fijación de la placa base hasta sentir una ligera resistencia.

A continuación, seleccione la configuración de adquisición que se utilizará para recopilar los datos, que incluye la velocidad de fotogramas para capturar los datos. Verifique el histograma de la imagen al seleccionar la configuración para asegurar una buena relación señal-ruido. Luego, comience a adquirir los datos.

Una vez finalizada la grabación, afloje el tornillo de fijación de la placa base y desacople el microscopio de la placa base tirando suavemente hacia arriba del microscopio. Posteriormente, coloque nuevamente la tapa de la placa base y apriete suavemente el tornillo de fijación de la placa base. A continuación se muestra una demostración de un animal con el microscopio montado, interactuando libremente con los objetos en el área de comportamiento.

Durante la obtención de imágenes en animales despiertos y con comportamiento activo mediante el sistema, se registró la actividad de las neuronas corticales somatosensoriales cuando el ratón fue expuesto a tres ambientes diferentes: campo abierto el día uno, familiarización con objetos los días dos a cuatro, y objeto novedoso el día cinco. Tras la extracción de las células utilizando el software de análisis de datos de imágenes de calcio, se superpusieron filtros espaciales correspondientes a las ubicaciones celulares sobre la proyección de intensidad media de fluorescencia de los datos grabados por el microscopio.

Una línea discontinua blanca separa las capas de dos, tres y cinco células. Rastros de calcio correspondientes de cinco células de cada una de las capas muestran el patrón de activación de las células en dos contextos conductuales diferentes: familiarización con el objeto y exposición a un objeto novedoso. Las células de las capas dos y tres fueron más activas en comparación con las células de la capa cinco en el día en que el ratón fue expuesto a un objeto novedoso.

A continuación se muestran el resto de las gráficas de la actividad celular de las entidades superficiales, cuando el animal se encontraba en campo abierto, familiarización con objetos y exploración de objetos novedosos. Una vez dominadas, cada técnica puede completarse en menos de una hora si se realiza adecuadamente. Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores de neurociencia de sistemas exploren tipos celulares específicos en distintas áreas cerebrales, aprovechando diferentes paradigmas conductuales en modelos de fisiología neural normal y en enfermedad.

Tras este protocolo, se deberá tener una buena comprensión de cómo etiquetar múltiples capas de la corteza somatosensorial, implantar una sonda prismática y fijar un microscopio miniaturizado montado en la cabeza.