Name: Establecimiento de un Biorepository basado en la Clínica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprenda a establecer un biorepositorio clínico para procesar muestras de tumores cutáneos en dermatología. Este protocolo permite a asistentes médicos preservar tejidos descartados para investigación biomédica sin interrumpir las operaciones clínicas rutinarias.

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Este trabajo fue apoyado con fondos de la Midwestern University Colegio de Ciencias de la Salud Investigación Facilitación Grant, otorgado a EEH, y Midwestern University Oficina de Investigación y Programas Patrocinados Intramural Grant, otorgado a KJL. El apoyo adicional fue proporcionado por Affiliated Laboratories y Affiliated Dermatology. Agradecemos a Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel y Ali Zaidi por su asistencia técnica.

Toda la experimentación en muestras de tejidos humanos fue aprobada por Western IRB (WIRB Protocol # 20142461). El único criterio para la recolección de tejidos para estos procedimientos es un diagnóstico de SCC probado con biopsia. No se describieron criterios de exclusión en el protocolo IRB original, pero no se utilizaron muestras de pacientes con una enfermedad transmisible transmitida por la sangre conocida. El consentimiento informado se obtuvo antes de la recolección de tejido cutáneo, sangre y saliva. La Junta de Revisión Institucional del Medio Oeste aprobó el trabajo de validación con muestras de biorepositores basadas en clínicas en la Universidad de Midwestern (AZ # 807). 1. Tratamiento de tejidos tumorales cutáneos NOTA: Esto debe ser realizado por un histotechnologist de Mohs. <ol><li> Procesamiento de tejido de carcinoma de células escamosas (SCC) para ARN y cultivo de explosivos <ol><li> Después de que el tejido ha sido extirpado por el cirujano de Mohs, recolectar de 10 a 50 mg (≥ 10 mm 3 </sup&gt;) Muestra de tejido del centro del lado apical del tejido durante la relajación (que es el proceso de manipulación del tejido para permitir que se acueste sobre la diapositiva) antes de procesamiento adicional. NOTA: Esto sólo es posible si el tumor es lo suficientemente grande para permitir que se elimine una muestra de 10-50 mg (≥ 10 mm 2 ) antes de la evaluación histológica, que es parte del procedimiento de Mohs. Si el tumor no es lo suficientemente grande como para permitir que se elimine un mínimo de 2 mm 3 , no proceda con el procesamiento de ARN (salte el paso 5). </li><li> Transferir el tejido viable a un tubo de 1,5 ml marcado que contenga medio de cultivo (mezcla 1: 1 de DMEM: F-12 de Ham, HEPES 25 mM, penicilina 100 UI / ml y estreptomicina 100 mu g / ml) El tejido está completamente sumergido en el medio. Guarde este tubo a 4 ° C antes del procesamiento adicional. </li><li> Utilice el tejido para el aislamiento de ARN y el análisis de expresión (ver paso 5) y / o el establecimientoDe un cultivo de explante (véase el paso 6) en 24 h. </li><li> Colocar el resto de la muestra de tumor que se retiró del paciente (paso 1.1.1) en un soporte de tejido de criostato (o &quot;mandril&quot;). Incorpore el tejido en un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT), congelando el tejido dentro del soporte, para permitir la terminación de la histología de Mohs y para la preparación de diapositivas histológicas adicionales para el análisis experimental. </li></ol></li><li> Preparación de diapositivas histológicas <ol><li> Corte cortes de tejido de 7 μm de espesor usando un criostato y cree dos (o más) diapositivas para cada muestra de tumor. Asegúrese de que cada diapositiva contenga hasta tres secciones del tumor completo. NOTA: Una de las dos diapositivas será teñida usando H &amp; E por el histotecnólogo de Mohs, y las diapositivas adicionales pueden ser procesadas con análisis IF, IHC o FISH. </li><li> Coloque los portaobjetos en acetona durante 1-2 s para fijar el tejido. Establezca estas diapositivas a un lado para secar. No H &amp; EMancha o cubreobjetos la diapositiva que se utilizará para la futura inmunofluorescencia (IF), inmunohistoquímica (IHC), o análisis de hibridación in situ fluorescente (FISH), dependiendo del protocolo experimental. </li></ol></li><li> Procesamiento de Tejido Post-Mohs <ol><li> Una vez que se ha completado el procesado de Mohs (pasos 1.1-1.2), trabaje en la cámara de criostato y extraiga la muestra del medio de incrustación criogénica y coloque el tejido en un tubo criogénico marcado. </li><li> Coloque el vial marcado en nitrógeno líquido antes de que el tejido se haya descongelado. Si se van a utilizar muestras para el análisis de proteínas y / o ADN, se pueden transferir a nitrógeno líquido oa un congelador de -80 ° C en unos pocos minutos para almacenarlos para la futura expresión de proteínas y el análisis de mutaciones de ADN (véanse los pasos 4-5) . NOTA: Si se desea un ARN intacto a partir de la muestra posterior a Mohs, es esencial mantener la muestra congelada durante la eliminación del medio de incrustación de crio. Si no se ejerce una extremaEn este paso, la muestra post-Mohs debe reservarse para análisis de proteínas y / o ADN. </li></ol></li><li> Procesamiento de Fresh ANT <ol><li> En el momento del cierre de Mohs, obtener ANT del cirujano Mohs. </li><li> Eliminar una cantidad igual o mayor de ANT tal como se recolectó de la muestra de SCC (véase más arriba) del lado apical del tejido normal y transferirlo a un tubo de 1,5 ml marcado que contenía medio de cultivo (mezcla 1: 1 de DMEM: Ham F- 12 suplementado con HEPES 25 mM, penicilina 100 UI / ml y estreptomicina 100 mu g / ml) usando pinzas. </li><li> Sumerja completamente el tejido en el mismo medio de cultivo y almacénelo a 4 ° C hasta su posterior procesamiento (vea los pasos 4-6). </li></ol></li></ol> 2. Tratamiento de sangre, saliva y frotis bucal <ol><li> Obtenga aproximadamente 10 ml de sangre en tubos de recolección de EDTA mediante venipunción. </li><li> Transferir la sangre de los tubos de recolección a un tubo estéril de centrífuga de 15 ó 50 ml. Eliminar aproximadamente 200 μl en un tubo criogénico de 1,5 ml, evitando burbujas; Almacene esta muestra de sangre entera a -80 ° C, para ser usada para futura genotipificación y afinación de tejidos, si es necesario. <ol><li> Hacer girar la sangre restante a 1,000 xg durante 30 min y seguir procedimientos estándar para recoger la fracción de plasma. </li><li> Alícuota del plasma en incrementos de 1 mL en tubos criogénicos de 1,5 mL y almacénelos a -80 ° C para su uso durante futuros análisis de biopsia de líquido. </li></ol></li><li> Use un hisopo estéril para obtener una muestra de hisopo bucal y guarde el hisopo en un tubo estéril a temperatura ambiente. </li><li> Si es necesario, obtenga una muestra de saliva y guárdela en un tubo estéril a temperatura ambiente. NOTA: Estas muestras pueden utilizarse para futura genotipificación y afinación de tejidos, si es necesario. </li></ol> 3. Registro de muestras <ol><li> Transferir la información de la lista de comprobación de las muestras de pacientes a la base de datos del depósito biológico. Incluir información del paciente y diagDe la tabla de pacientes. </li><li> Imprima etiquetas con un código de barras para cada muestra y registre cada una en la base de datos para vincular cada muestra recogida con los datos del paciente. </li><li> Anote la distribución de las muestras des-identificadas en la base de datos del biorepository antes de transferir las muestras al laboratorio de investigación. </li></ol> 4. Aislamiento de Proteínas y Análisis Western Blot <ol><li> Colocar cada muestra de tejido (SCC y / o ANT) en un vial que contenga 500 μl de tampón de lisis celular que contenga inhibidores de proteasa por 100 mg de tejido para lisar el tejido. Se utilizó un tampón de ensayo de radioimmunoprecipitación (RIPA), compuesto de Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio al 0,5%, NP-40 al 1,0% y SDS al 0,1%. Pueden usarse otros tampones de lisis celular. </li><li> Homogeneizar los tejidos utilizando un homogeneizador de tejidos durante 5 minutos en intervalos de 20 segundos a 4 ° C. Hacer girar las muestras a 21.000 xg y 4 ° C durante 20 minutos y recoger el sobrenadante que contiene la proteína en un fresco tuser. Se vuelve a centrifugar el sobrenadante usando las mismas condiciones y se recoge el sobrenadante final en un tubo nuevo. </li><li> Se electroforan 30-50 μg de proteína de cada muestra usando un gel de gradiente de SDS-poliacrilamida al 4-20%. Mancha el gel con Coomassie Blue para visualizar las bandas de proteínas, si lo desea. </li><li> Si se necesita el análisis Western blot de proteínas expresadas, transfiera las proteínas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) siguiendo protocolos estándar. Después de la transferencia, Ponceau mancha la membrana de PVDF para visualizar bandas de proteína, si se desea. </li><li> Bloquear la membrana y la sonda PVDF para detectar proteínas de interés siguiendo los protocolos estándar. Utilizar anticuerpos primarios específicos de la (s) proteína (s) de interés, junto con anticuerpos secundarios correspondientes específicos para los anticuerpos primarios, a concentraciones recomendadas por el fabricante para el análisis de transferencia Western. </li><li> Exponer la membrana sondada utilizando un sustrato quimioluminiscente e imagen de la membrana utilizando un imagiNg. </li></ol> 5. Aislamiento de ARN y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) <ol><li> Coloque inmediatamente muestras de tejido fresco (SCC y / o ANT) en un tubo de 1,5 ml que contenga una solución de estabilización de ARN y coloque muestras de tejido post-Mohs en un tubo de 1,5 ml que contenga una solución de transición de tejido congelado, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Asegúrese de que el tejido esté completamente sumergido. Guarde estas muestras a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Retirar las muestras de ARN de -80 ° C y descongelar sobre hielo. Transferir el tejido a un nuevo tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de tampón de extracción de ARN (fenol / tiocianato de guanidina) por 50-100 mg de tejido. </li><li> Lyse los tejidos utilizando un homogeneizador de tejidos. Realizar seis ciclos de homogeneización, seguido de un período de enfriamiento de la muestra; Cada ciclo consta de 20 s de homogeneización a 4 ° C y un período de enfriamiento de 40 s. Después de la homogeneización, incubar la muestra durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 0,2Ml de cloroformo por 1 ml de tampón de extracción de ARN y agitar vigorosamente el tubo a mano durante 15 s. Incubar durante 2-3 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Hacer girar las muestras a 12.000 xg y 4 ° C durante 15 min. Retirar la fase acuosa de la muestra y colocarla en un nuevo tubo de 1,5 ml. </li><li> Añadir 0,5 ml de isopropanol al 100% por 1 ml del tampón de extracción de ARN utilizado en el paso 5.2 a la fase acuosa e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. NOTA: Si se anticipa que los rendimientos de ARN son bajos ( es decir, el volumen de tejido inicial es inferior a 10 mg), las muestras pueden precipitarse durante la noche a -80ºC. Adicionalmente, se pueden a~nadir 5 μg de glucógeno libre de ARNasa por 500 μl de tampón de extracción de ARN durante la etapa de precipitación con isopropanol para mejorar los rendimientos de ARN. </li><li> Hacer girar la muestra a 12.000 xg a 4 ° C durante 10 min. Se retira el sobrenadante y se lava el sedimento con 1 ml de etanol al 75%. </li><li> Vórtice brevemente la muestra y luego gírela a 7.500 xg y 4 °C durante 5 min. Desechar el lavado y secar al aire el gránulo durante 5-10 min. </li><li> Resuspender el sedimento de ARN en 20 μl de agua libre de RNasa. <ol><li> Si se desea, purificar cada muestra de ARN utilizando un kit de limpieza de ARN siguiendo las recomendaciones del fabricante. NOTA: Si se realiza este paso, se perderán los ARN pequeños de la muestra. </li></ol></li><li> Se electroforó una muestra de 1 μg usando un gel de agarosa de formaldehído-MOPS al 1,2% para analizar la calidad del ARN. NOTA: Como alternativa, analizar las muestras utilizando un bioanalizador para obtener un número RIN 13 . </li><li> Reverse-transcribir el ARN a cDNA utilizando un protocolo de transcripción inversa para qPCR análisis de mRNAs (o miRNAs) de interés de interés. </li></ol> 6. Culturas de explosivos de tejidos <ol><li> Esterilizar el tejido extirpado antes del cultivo sumergiendo el tejido en etanol al 70%. </li><li> Coloque el tejido en una lámina o plato y agregue suficiente medio de cultivo (mezcla 1: 1 de DMEM: Ham &amp; #39; s F-12 suplementado con FBS al 10%, HEPES 25 mM, penicilina 100 UI / mL y estreptomicina 100 mu g / ml) para cubrir el tejido (para evitar que el tejido se seque). Cuidadosamente cortar el tejido en fragmentos (&lt;1 mm 3 ) con una cuchilla de bisturí. </li><li> Transferir los fragmentos de tejido a un plato de cultivo de tejidos de 35 mm y agregar aproximadamente 20 μl de suero bovino fetal (FBS) sobre cada fragmento. </li><li> Dejar el plato abierto en una campana de cultivo durante 20-30 min, o hasta casi seco. </li><li> Añadir 1 ml de medio de cultivo (mezcla 1: 1 de DMEM: F-12 de Ham suplementado con FBS al 10%, HEPES 25 mM, penicilina 100 UI / ml y estreptomicina 100 mu g / ml) a cada placa e incubar a 37º C en CO _ { 2 } al 5%. Subculture o subclone los cultivos si es necesario. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A juicio del autor, este protocolo es el primero de su tipo que se centra en la adquisición clínica de muestras de tejido cutáneo en un enfoque rentable y rápido. Los pacientes sometidos a microcirugía de Mohs se programan típicamente durante bloques específicos del tiempo, y la colección se limita a estos períodos. La recolección de muestras involucra el esfuerzo del asistente médico involucrado en el cuidado del paciente, el histotecnólogo de Mohs que procesa las muestras tumorales y un miembro del personal de laborat...

La investigación sobre el cáncer y los biomarcadores se basa en un suministro de muestras de tejido humano de calidad, y la oferta limitada ha obstaculizado la investigación 1 , 2 . Muchos estudios dermatológicos están limitados por la oferta inadecuada, la calidad variable y los costos asociados con el uso de tejido humano. El costo de establecer un gran biobanco dedicado se ha estimado en aproximadamente dos millones de dólares 3 , y estos costos colocan el uso de tejido humano fuera del alcance de muchos investigadores. Además, el proceso de generación y almacenamiento de muestras de investigación plantea el riesgo de afectar las operaciones clínicas y retrasar la atención al paciente si no se ejecuta cuidadosamente. Se ha establecido un biorepository rentable, basado en clínicas, que se centra en las muestras de cáncer de piel siguiendo las mejores prácticas recomendadas y la validación de muestras 4 , 5 , 6 . <pEste protocolo se ha desarrollado en una clínica de dermatología que realiza un gran volumen de cirugías micrográficas de Mohs para eliminar el carcinoma de células escamosas (SCC), el carcinoma basocelular (CBC) y los cánceres de piel de melanoma. Los donantes voluntarios pueden ser reclutados de esta población de pacientes. Es importante establecer el biorepository en el sitio de la colección para capturar rápidamente el tejido y la sangre de pacientes consentidos sin retrasar el tratamiento. La recopilación de muestras de la misma clínica minimiza las variaciones en las técnicas de recolección y minimiza las variaciones en la calidad de las muestras, lo que puede ser problemático para las aplicaciones posteriores 7 , 8 . El objetivo de la técnica de cirugía micrográfica Mohs es asegurar que todo el tejido canceroso se elimina mientras se preserva el mayor número posible de tejidos sanos. El procedimiento implica la eliminación progresiva de capas delgadas de tejido tumoral. Cada capa sucesiva es suExaminado tologically (después de cryosectioning el tejido del tumor y de realizar la mancha de H &amp; E) por un dermatologist para determinar si todo el tejido del cáncer se ha quitado. La extirpación y examen de capas posteriores de tejidos se realiza mientras el paciente permanece en la oficina. Esta técnica se considera la mejor opción de tratamiento para SCC 9 . En este punto, la herida se cierra y, para mejorar la cicatrización y la apariencia estética, el tejido normal adyacente (ANT) es frecuentemente extirpado. Por lo tanto, este procedimiento quirúrgico para extirpar un tumor es idealmente adecuado para recoger tejidos histológicamente caracterizados para futuros estudios. El procedimiento de adquisición para obtener tejido tumoral, tejido adyacente normal, saliva y muestras de sangre ha sido diseñado para tener un impacto mínimo en las tareas normales del personal ( Figura 1 ). Asistentes médicos realizar la sangre dibuja mientras se prepara al paciente para el procedimiento. Después de completar el procedimiento de Mohs, el M<html> Ohs histotechnologist prepara más diapositivas histológicas de la muestra y transfiere el tejido al biorepository. Los costos asociados con el establecimiento del depósito biológico incluyen la compra de congeladores de crioconservación, la creación de un espacio de laboratorio clínico modesto y el desarrollo de un programa de seguimiento de inventario. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig1.jpg" /> Figura 1: Secuencia de recolección de muestras y personal responsable. Tras el ingreso del paciente y el logro del consentimiento del paciente, el asistente médico recoge un hisopo bucal y realiza un drenaje de sangre. El dermatólogo y el asistente médico luego excisan el tumor y cierran la herida, durante el cual se recogen las muestras de SCC y ANT, respectivamente. Un técnico de laboratorio dedicado procesa la sangre y secciona las muestras de SCC y ANT para el cultivo de tejidos, la preservación y la entrada en el biorepository.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La diversidad de muestras recogidas permite una variedad de enfoques experimentales ( Figura 2 ). Las muestras recogidas del paciente son hisopos bucales (la saliva también se puede recoger si es necesario), sangre entera y tejido extirpado. Los hisopos bucales y una muestra de la sangre entera se guardan, sin procesar, para el genotipado y el emparejamiento de tejidos. La sangre entera se separa en glóbulos blancos (WBC) y fracciones de plasma para análisis futuros. Después del procesamiento de Mohs, el tumor congelado se coloca directamente en nitrógeno líquido y se transfiere a un congelador a -80ºC. Las muestras frescas, viables de tejido tumoral y de ANT se cultivan usando modificaciones de las técnicas anteriores 10 , 11 y luego se crioconservan. Durante la recolección, el número de cada tipo de muestra se registra en una hoja de cálculo antes de<html> El programa de seguimiento de inventarios para facilitar el procesamiento preciso ( Tabla 1 ). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig2.jpg" /> Figura 2: Esquema de la recolección y procesamiento de muestras de biorrepositores basados ​​en la clínica. Se recoge un hisopo bucal y una muestra de sangre del paciente y se almacena para genotipificación y emparejamiento de tejido aguas abajo. La sangre entera se procesa posteriormente para el aislamiento de glóbulos blancos (WBC) y el análisis de CTC, así como para la colección de plasma y el análisis de biopsia de líquido. El tejido excisado durante el procedimiento de Mohs se procesa histológicamente para fines de diagnóstico, después de lo cual las diapositivas histológicas pueden usarse experimentalmente para análisis inmunohistoquímicos adicionales. Siempre que la muestra de tejido extirpada sea lo suficientemente grande, una porción de tejido fresco se elimina y secciona para aislamiento de proteína y ARN y para el establecimiento de líneas celulares cultivadas.55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fecha de colección: </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Paciente 1 </td><td> Paciente 2 </td><td> Paciente 3 </td><td> Paciente 4 </td><td> Paciente 5 </td></tr><tr><td> Iniciales y fecha de nacimiento </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Color de los ojos </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipo de ejemplo </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ubicación de la muestra </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Saliva </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> WAgujero de sangre </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plasma </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tumor Viable </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tejido Normal Viable </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tumor Mohs Nitrógeno Líquido </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nitrógeno líquido normal del tejido </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diapositivas </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1: Lista de verificación para registrar las colecciones de muestras. Los datos rastreados y registrados con cada muestra recogida incluyen iniciales del paciente, fecha de nacimiento y color de los ojos (para la tipificación de la piel), así como la locatiEn la extracción de la muestra. El número de muestras de saliva, los volúmenes de recolección de sangre y el número de especímenes de tejidos viables y conservados recolectados también se registran como referencias para asignaciones a usos posteriores. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55583/Table1.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Para validar los procedimientos de recolección de muestras, cada tipo de muestra se ha probado en aplicaciones descendentes. Utilizando modificaciones de las técnicas anteriores 12 , el tumor y la ANT se han utilizado con éxito en el aislamiento de proteínas y ARN y pueden usarse potencialmente para aislar el ADN. Los explantes viables establecidos a partir de las secciones de tejido se han evaluado mediante microscopía, mientras que las diapositivas histológicas almacenadas se han utilizado para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Siguiendo el protocolo descrito aquí, es posible extender este modelo a otras clínicas de dermatología, otros tipos de tumores (como el melanoma), Y otras especialidades y prácticas quirúrgicas para proporcionar muestras de tejido humano para la investigación multifacética en cánceres humanos. Es probable que algunas modificaciones de este protocolo sean necesarias para otras prácticas pero, en principio, este protocolo es aplicable a cualquier práctica quirúrgica que descarte rutinariamente muestras de pacientes recolectadas durante el tratamiento del paciente.

<table><tbody><tr><td>Tubos de extracción de sangre de plástico BD Vacutainer con K3EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-685-2B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía Electrónica de las Ciencias Cuchillas de doble filo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-949-411</td><td></td></tr><tr><td>Pinza curva de punta media de uso general</td> Tubos de microcentrífuga premium <td>ThermoFisher</td><td>Scientific 16-100-110</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville KGM Medio de queratinocito</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC9791321</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía electrónica Ciencias Tejido TEK OCT Compuesto</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-363-579</td><td></td></tr><tr><td>Criostato Leica CM1950 Portaobjetos</td><td></td> de microscopio esmerilados 14047743909 <td></td><td>Leica Biosystems</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Rapid-Chrome H& E Kit de tinción de sección congelada</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>99-900-01</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Tubos criogénicos de almacenamiento a largo plazo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>03-337-7X</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Boca Scientific BuccalT-Swab&nbsp;</td>Tecnología de señalización de células <td>NC9679349</td><td></td> <td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td>10x Tampón RIPA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-195-822</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI78443</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R Microcentrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-401-203</td><td></td></tr><tr><td>Trituradora de pellets Homogeneizador inalámbrico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-141-3</td><td></td></tr><tr><td>Mortero de pellets sin ARNasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>121-141-364</td><td></td></tr><tr><td>Forma SteriCycle CO2 Incubadora</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-998-089</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Suero fetal bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SH30071.02</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Advanced DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-634-028</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Penicilina-Estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 1 M Hepes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-630-130</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Cultivo Celular 35 mm con Vent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1256591</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CFH clon de anticuerpo monoclonal OX-24</td><td>Abnova</td><td>MAB12583</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p40 (p63 delta) anticuerpo</td><td>Abnova</td><td>ABX-144A</td><td></td></tr><tr><td>Anti MUC-1 anticuerpo</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-7313</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Caracol + (phospho S246)</td><td>Abcam</td><td>Ab63568</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phallodin</td><td>Molecular Probes&nbsp;</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Mountant Antidecoloración con</td><td>Sondas Moleculares DAPI&nbsp;</td><td>P36941</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Axio Imager Z1 con cámara Axiocam</td><td>Zeiss</td><td>4300009901</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 contraste de fase con cámara DP72</td><td>Olympus IX511F3</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de un biorepository basado en la clínica

Establishment of a Clinic-based Biorepository

La incidencia de cáncer de piel ( por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular y melanoma) ha aumentado en los últimos años. Se espera que haya una demanda paralela de muestras tumorales cutáneas para estudios de investigación biomédica. Sin embargo, la disponibilidad de tejidos es limitada debido al costo de establecer un depósito biológico y la falta de protocolos disponibles para obtener muestras clínicas que no interfieran con las operaciones clínicas. Se estableció un protocolo para recolectar y procesar el tumor cutáneo y las muestras asociadas de sangre y saliva que tienen un impacto mínimo en los procedimientos clínicos de rutina en la fecha de la cirugía de Mohs. Las muestras tumorales se recogen y procesan a partir de pacientes sometidos a su primera capa de cirugía Mohs para neoplasias cutáneas probadas por biopsia por el histotecnólogo Mohs. El tejido normal adyacente se recoge en el momento del cierre quirúrgico. Las muestras adicionales que se pueden recoger son hisopos de sangre entera y bucal. Mediante la utilización de muestras de tejido que normalmente se desechan, se generó un depósito biológico que ofrece varias ventajas clave basándose en la clínica frente al laboratorio. Estos incluyen una amplia gama de muestras recogidas; Acceso a los registros de pacientes no identificados, incluidos los informes de patología; Y, para el donante típico, el acceso a muestras adicionales durante las visitas de seguimiento.

El tumor y la ANT se han utilizado con éxito en el aislamiento de proteínas y se han ensayado mediante transferencia Western. Como se muestra en la Figura 3 , se pueden detectar marcadores cutáneos de carcinoma de células escamosas (Muc1 14 , FHL- 15 y p40 16 , 17 ) en muestras de pacientes recogidas y almacenadas en nuestro depósito biológico clínico. <p class=...

Los tumores cutáneos se descartan a menudo después de la cirugía micrográfica de Mohs. Se describe aquí un protocolo que permite al personal de soporte clínico procesar y almacenar eficazmente muestras de tumores cutáneos ( por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular y melanoma) para aplicaciones de laboratorio aguas abajo sin interferir con las operaciones clínicas.

Establecimiento de un Biorepository basado en la Clínica

The incidence of skin cancer (e.g., squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, and melanoma) has been increasing over the past several years. It is ...

El objetivo general de este protocolo es permitir que el personal de apoyo clínico en una consulta de dermatología procese y almacene eficazmente muestras de tumores cutáneos para aplicaciones de laboratorio posteriores, sin interferir con las operaciones clínicas rutinarias. Este protocolo fue diseñado para permitir que los asistentes médicos y los histotécnicos de Mohs recojan y almacenen muestras de tumores cutáneos para futuros proyectos de investigación biomédica, como parte de sus operaciones clínicas diarias. La principal ventaja de este protocolo es que los tejidos extirpados que normalmente se descartan y destruyen se recogen y preservan para investigación, mediante procedimientos que afectan mínimamente las operaciones clínicas rutinarias.La variedad de muestras recopiladas permite establecer correlaciones entre biomarcadores proteínicos y de ARN en las muestras de tejido y plasma con los datos de resultados en pacientes. En principio, este protocolo, una vez ligeramente modificado, es aplicable a cualquier práctica quirúrgica que descarte rutinariamente muestras de pacientes obtenidas durante el tratamiento del paciente. La procedimiento será demostrado por Stefani Fawks, histotecnóloga de Mohs, y el Dr. Mitchell Manway, investigador asociado en nuestra práctica.Para comenzar, utilice el tejido recibido del cirujano de Mohs y, con un escalpelo, extirpe una muestra de 10 a 50 miligramos del centro del lado apical del tejido. Con pinzas, transfiera el tejido viable a un tubo etiquetado de 1,5 mililitros, previamente llenado con medio de cultivo. Asegúrese de que el tejido esté completamente sumergido en el medio. Coloque la muestra en un refrigerador y guárdela a cuatro grados Celsius, durante no más de 24 horas antes de cualquier procesamiento adicional. Recolecte al menos un fragmento de tejido de 10 milímetros cúbicos del lado apical del tejido extirpado, cuando la muestra del tumor sea lo suficientemente grande y dicha extracción no interfiera con el procesamiento rutinario de Mohs. A continuación, coloque la muestra tumoral restante sin procesar en un soporte de tejido para criostato.Incorpore el tejido en un compuesto de temperatura óptima para corte y congélelo dentro del porta para preparar cortes histológicos. Utilizando un criostato, corte el tejido en secciones de siete micrones de grosor y coloque hasta tres secciones sobre un portaobjeto. Después del corte, fije el tejido sumergiendo los portaobjetos en acetona durante uno o dos segundos.Luego, deje que los portaobjetos se sequen al aire. Manteniendo la muestra restante en una cámara de criostato, desprenda el tejido del medio de inclusión criogénico y transfiéralo a un tubo criogénico etiquetado. Transfiera inmediatamente el vial etiquetado al nitrógeno líquido.La transferencia del tejido a un vial criogénico después del procesamiento de Mohs debe realizarse en la cámara del criostato a menos veinte grados Celsius. Si se realiza correctamente y el tejido se mantiene congelado, este paso permitirá la extracción exitosa de ARN a partir de muestras de tejido post-Mohs. A continuación, obtenga tejido normal adyacente del cirujano de Mohs.Extraiga una muestra del lado apical del tejido normal adyacente. Luego, utilizando pinzas, transfiera la muestra extraída a un tubo etiquetado de 1.5 mililitros lleno con medio de cultivo. Sumerja el tejido en el mismo medio de cultivo.Colóquelo en una bolsa de muestra adecuada y almacénelo a cuatro grados Celsius hasta su posterior procesamiento. Recolecte aproximadamente 10 mililitros de sangre venosa en tubos de recolección recubiertos con EDTA. Combine las muestras de sangre en un tubo estéril de centrífuga de 15 mililitros.Luego, transfiera aproximadamente un mililitro de la muestra de sangre a un tubo criogénico de 1,5 mililitros, evitando la formación de burbujas. Almacene esta muestra de sangre completa a menos 80 grados Celsius hasta su posterior genotipificación y coincidencia de tejidos. A continuación, centrifugue la muestra de sangre restante a 1000 × g durante 30 minutos para obtener el plasma sanguíneo.Después de centrifugar, recolecte y divida el plasma en alícuotas de un mililitro en tubos criogénicos de 1,5 mililitros. Almacene las muestras a menos 80 grados Celsius para su uso en futuros análisis de biopsia líquida. Ingrese los datos del listado de muestras de pacientes, junto con la información del paciente y el diagnóstico, extraídos de la historia clínica del paciente, en la base de datos del biorepositorio.Finalmente, registre la localización de las muestras desidentificadas en la base de datos del biobanco y traslade las muestras al laboratorio de investigación. Inmediatamente después, transfiera las muestras de tejido a tubos de 1,5 mililitros, previamente llenados con soluciones de extracción adecuadas, asegurándose de que el tejido quede completamente sumergido. Almacene las muestras a menos 80 grados Celsius hasta su posterior procesamiento.Se presentan aquí las imágenes de blotting Western representativos de marcadores conocidos del carcinoma de células escamosas, mucina uno, FHL-uno y p40, obtenidos para tejido normal adyacente y una muestra tumoral. La calidad del ARN aislado de muestras de Mohs se evaluó primero mediante electroforesis en gel, seguida de un análisis de integridad del ARN. Los valores del número de integridad del ARN obtenidos para muestras normales y tumorales indican que se obtuvo ARN de alta calidad e intacto.Los perfiles de citometría de las bandas se representaron como unidades de fluorescencia frente al número de nucleótidos para muestras representativas de ARN de tejido tumoral y tejido normal de pacientes. Un explante de tejido de carcinoma de células escamosas se visualizó mediante microscopía de contraste de fases y se observó que era un cultivo mixto de queratinocitos y fibroblastos, que podría ser subcultivado o utilizado para el desarrollo futuro de líneas celulares. Finalmente, en cortes de tejido de carcinoma de células escamosas, se observó tinción positiva para el marcador de transición epitelial a mesenquimatosa.Una vez dominado, este protocolo extenderá el flujo de trabajo estándar del personal clínico a menos de 30 minutos, si se realiza adecuadamente. La mayoría de los pasos los realiza el personal clínico existente después de finalizar la atención al paciente. Al intentar este protocolo, es importante mantener un registro preciso, vinculando las muestras con la historia clínica y el diagnóstico del paciente.Dado que esta información a menudo es necesaria para aplicaciones posteriores, esta técnica ayudará a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la dermatología desarrollen biopsias líquidas y biomarcadores en carcinomas de células escamosas y melanoma. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implementar un biobanco basado en la clínica para muestras de cáncer cutáneo, generadas como parte de la práctica diaria.

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Investigación

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