Repetida Medición de la actividad muscular respiratoria y ventilación en el ratón modelos de enfermedad neuromuscular

El objetivo general de este procedimiento es medir repetidamente la actividad de los músculos respiratorios y la ventilación durante la progresión de la enfermedad. Tras la implantación quirúrgica de un dispositivo de telemetría con electrodos de electromiografía insertados en músculos seleccionados. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave sobre cómo los músculos respiratorios accesorios compensan la función diafragmática deteriorada tras una enfermedad o lesión.

La principal ventaja de esta técnica es que la ventilación y la actividad de los músculos respiratorios pueden medirse en el mismo ratón libre de comportamiento durante toda la progresión de la enfermedad. Este método puede proporcionar información sobre el diagnóstico y tratamiento de la ELA, pero también puede aplicarse a otros modelos de enfermedades neuromusculares o lesiones de la médula espinal. Comience preparando los electrodos EMG.

Utilice tijeras reservadas para manipular cables para recortar los extremos distales, de modo que queden aproximadamente tres centímetros de cable para alcanzar el músculo objetivo. Luego, use un escalpelo para retirar 0.5 centímetros del recubrimiento de plástico sin cortar el cable en sí. A continuación, use herramientas para manipular cables para estirar los extremos de los cables a cuatro o cinco veces su longitud original.

Recorte el alambre expuesto de los electrodos para que tengan una longitud de 0,5 centímetros. Luego, prepare tapas para los electrodos para cubrir los extremos del alambre, cortando tubos de 0,25 centímetros de la cubierta plástica previamente retirada. Después de anestesiar al ratón, realice una compresión del dedo del pie y una compresión de la cola para asegurarse de que el ratón esté completamente anestesiado por la ausencia de reacción.

Luego, traslade el ratón al equipo quirúrgico y coloque el cono nasal para mantener la anestesia durante la cirugía. Aplique una pomada oftálmica lubricante para prevenir que los ojos se sequen durante la cirugía. Corte las uñas de la pata ipsilateral al sitio quirúrgico para reducir la posibilidad de que el ratón arranque los electrodos o cause heridas al rascarse durante el proceso de curación.

Afeite al ratón para exponer un sitio quirúrgico entre la oreja y el hombro. Luego, alterne la limpieza del sitio quirúrgico, primero con desinfectante y después con isopropanol. Para comenzar la implantación, jale la extremidad anterior hacia el pie ipsilateral para desplazar caudalmente la escápula, proporcionando acceso quirúrgico a los músculos escaleno y trapecio.

Utilice fórceps curvos romos para sujetar la pata delantera ipsilateral al sitio quirúrgico y sujete la pata con cinta adhesiva. Después de ponerse un par nuevo de guantes quirúrgicos, use el bisturí para realizar una incisión oblicua de dos centímetros entre el hombro y la oreja. Luego, con un fórceps de laminectomía en cada mano, retire el tejido adiposo y separe los músculos trapecio y platisma para exponer la fascia que recubre los músculos esternocleidomastoideo y escalenos.

Utilice el músculo esternocleidomastoideo pálido y el nervio frénico como puntos de referencia para identificar los músculos escalenos. Tenga en cuenta que el nervio frénico discurre paralelo a los músculos escalenos, mientras que el esternocleidomastoideo se encuentra inferior. Los músculos escalenos se extienden oblicuamente desde las vértebras cervicales hasta las costillas por debajo del músculo trapecio.

Se insertarán electrodos biopotenciales en el músculo escaleno anterior, que puede identificarse como el músculo que discurre adyacente al nervio frénico. A continuación, cree un bolsillo para el transmisor insertando las puntas de unas tijeras separadoras de tejido bajo la piel del ratón y abriéndolas hasta formar un bolsillo ligeramente más grande que el ancho del transmisor. Lave el bolsillo con solución salina estéril tibia.

Luego inserte el transmisor con el lado más plano contra el músculo. Coloque el transmisor de modo que quede plano y los cables salgan del bolsillo paralelos entre sí, y no retorcidos. Pase los electrodos desde el transmisor hacia los músculos escaleno y trapecio, de forma que los dos conjuntos de electrodos biopotenciales queden planos y paralelos entre sí.

A continuación, use la pinza de laminectomía para separar el escaleno anterior de los músculos circundantes. Luego, inserte una aguja de calibre 25 a través del músculo escaleno perpendicularmente a las fibras musculares. Introduzca un electrodo en la punta de la aguja y luego retire la aguja del músculo, dejando el electrodo insertado en el músculo hasta el aislamiento del alambre.

Registre qué electrodos de color se insertan en cada músculo. Aplique una gota de adhesivo de cianoacrilato sobre una aguja de calibre 21 para facilitar la aplicación del pegamento en los electrodos. A continuación, coloque el adhesivo sobre el extremo expuesto del alambre cerca del músculo en el lugar donde se inserta el electrodo.

Deslice rápidamente el casquillo conductor sobre el alambre de modo que no quede alambre expuesto entre el casquillo y el músculo. Recorte el exceso de alambre distal al casquillo y aplique una gota de adhesivo de cianoacrilato sobre el extremo del casquillo conductor y el alambre. Deje tiempo suficiente para que el pegamento polimerice antes de soltarlo.

A continuación, inserte el electrodo de polaridad opuesta paralelo al primero en el mismo músculo, de la misma manera. Este electrodo debe estar a uno o dos milímetros de distancia del primer electrodo. Repita el procedimiento para insertar electrodos en el músculo trapecio, ubicado justo anterior al músculo escaleno, como se muestra aquí.

A continuación, verifique que los cables estén sujetos en su lugar y que haya suficiente holgura en los cables para que el animal realice movimientos corporales sin tirar de ellos. Luego, retire suavemente la cinta que sujeta la extremidad anterior. Vuelva a colocar el tejido adiposo sobre el músculo y utilícelo para cubrir los cables insertados.

A continuación, separe suavemente las solapas de piel para alinear la incisión. Prense una porción de las solapas de piel juntas con pinzas curvas y aplique una pequeña línea de adhesivo de cianoacrilato a lo largo de esta línea. Inyecte 0.1 mililitros de carprofeno por vía subcutánea para aliviar el dolor posoperatorio mientras el animal aún está bajo anestesia.

Retire el animal del cono nasal y colóquelo en una jaula limpia dentro del incubador precalentado hasta que el animal despierte y se mueva por la jaula voluntariamente. Coloque el ratón en la cámara de pletismografía durante al menos una hora para que se aclimate antes de registrar el EMG y la pletismografía. Antes de la grabación pero después de la calibración, encienda el transmisor colocando un imán potente a menos de 2,5 cm del animal implantado.

Una luz roja en la parte frontal del receptor indicará cuándo el transmisor está encendido. Inicie la adquisición utilizando el menú desplegable etiquetado como Adquisición y seleccione Iniciar adquisición. Aunque la duración de la grabación puede variar según el experimento, una grabación típica de pletismografía y EMG dura de una a tres horas.

Una vez finalizada la adquisición, apague el transmisor con un imán y devuelva al animal a su jaula de alojamiento. A continuación se muestran trazas de WBP y EMG de los músculos escapular y trapecio de un ratón SOD-1(G93A) presintomático en el día 98 postnatal. Los periodos en los que el animal está en reposo se utilizan para el análisis.

El cuadro rojo muestra trazas de EMG en reposo sin episodios de EMG, característicos de un ratón presintomático. Las trazas fuera del cuadro rojo muestran picos grandes e irregulares en las trazas de pletismografía y en la actividad muscular y trazas de EMG, típicos cuando un animal se está moviendo. Esta imagen muestra trazas de WBP y EMG del músculo trapecio de un ratón sintomático SOD-1(G93A) en el día 126 postnatal, cuando hay un episodio de EMG presente mientras el ratón está en reposo.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 35 minutos si se lleva a cabo correctamente. Tras seguir este procedimiento, los animales implantados pueden utilizarse para evaluar la eficacia de fármacos para mejorar la actividad de los músculos respiratorios accesorios en modelos de enfermedad o lesión.