Name: Un método para la producción de proteínas recombinantes en células de insecto mCD1d. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprende a producir proteínas recombinantes en células de insecto High Five mediante infección con baculovirus. Este método permite generar tetrameros de mCD1d para estudios de inmunología del desarrollo y reconocimiento de células NKT.

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I. Descongelar las células Tome el frasco de helado de TN5 las células, y descongelar en un baño de agua a 37 ° C. Añadir 5 ml de medio de insectos Express (Invitrogen, número de catálogo-10486) en el frasco de 25 cm TC 2. Tenga en cuenta que Express cinco viene sin glutamina, necesita agregar 10 ml de estreptococos pluma 100X glutamina o glutamina solo a 1 lt medios de comunicación. Añadir TN5 células en ella y se incuba durante 30 minutos en una incubadora de 27 ° C. Luego, se aspira el medio con DMSO suavemente sin molestar a las células unidas al fondo del frasco. Añadir 5 ml de medio fresco. II. Crecimiento y expansión de las células Monitorizar las células todos los días. Cuando frasco es de casi el 70% confluentes, llevar a las células en suspensión por golpear el frasco en ambos lados y la transferencia de las células de 175cm 2 frasco mediante la adición de 21 ml de insectos a medio expresar y 5 ml de cultivo celular. Cada frasco T175 debe tener alrededor de 25-30ml medio como un volumen final. Dividir frasco confluente (aproximadamente 1 millón / ml conc.) 1 / 4 o 1 / 5, según sea necesario. No deje crecer demasiado las células. Cuente el número de pasajes que se han separado de las células. No crecen en el paso número 30, ya que puede causar el envejecimiento de las células resultantes lisis celular. Al alcanzar el volumen deseado en la concentración de 1 millón / ml, infectar las células. Yo por lo general crecen de 2 a 2,5 litros, que por lo general asciende a setenta y dos frascos de 175 cm y aprox. 25 a 30 ml frasco /, o cinco matraces Erlenmeyer de 1 litro y aprox. 400 ml a 500 ml cada frasco Nota: puede crecer en las células T-175 frasco de sello de tapón o matraz Erlenmeyer Corning. Crecimiento de las células en matraces Erlenmeyer es más rápido y más fácil. III. Titulación del virus por el método de dilución de punto final <ol><li> Placa de 3000-5000 células por pozo en el fondo plano placa de 96 pocillos en 200ul de medio expreso SFM cinco. Vamos a colocar las células a 27 ° C durante al menos 30 minutos. </li><li> Hacer series de dilución de las acciones de baculovirus. Uno debe hacer dilución 1 / 10 en una línea de 96 y placa inferior U, con 250ul por pocillo. Diluciones se hacen en medio de la ordenación forestal sostenible expreso Cinco. </li><li> Con una pipeta multicanal, la transferencia de una cantidad fija (por lo general 20 ul) de diferentes diluciones de las células. </li><li> La cultura a 27 ° C durante 7 días. Para evitar la evaporación de las filas de borde, envuelva los bordes de la placa con parafilm. </li><li> Después de 7 días, verifique la placa y determinar la dilución de virus que da una infección en un 50% - la mitad de los pozos en esta concentración de virus están infectados). A continuación, utilice una fórmula para calcular el título, que se expresa en ufp / ml (PFU-unidades formadoras de placa). La fórmula se encuentra en los manuales de la mayoría de los baculovirus. </li></ol> IV. Infectando las células Es muy importante saber el título exacto del virus. Añadir la cantidad necesaria de virus. Para la preparación del stock viral de las células deben estar infectadas a una multiplicidad de infección (MOI), de no más de 1 (1pfu a 1High Cinco celular) MOI superior lleva a la producción de mutaciones virales. Para la producción de proteínas, la cantidad normal es de 10.5 MO1. Ejemplo: El título de baculovirus mCD1d = 1x108 ufp / ml Añadir MOI = 1 (para amplificar el virus) = 20X10 ^ 6 células / frasco / 1x10 ^ 8 ufp / ml = 200 ul / frasco MOI = 5 a 10 (para la producción de proteínas) = ​​1 ml a 2 ml por 20x10 ^ 6 células / frasco El día 4 después de la infección, mirar las células infectadas. Deben ser individual, salchichas flotantes, se inflaman y forman. V. Recuperación de los sobrenadantes Tomar el medio de los frascos de infectados, y la transferencia de 250 ml botellas de color azul tapa Falcon Spinning. Pueden ser esterilizados en autoclave y reutilizado. Llenar las botellas de manera uniforme y centrifugar las células en Sorvall GSA rotor a 200 rpm, 20 minutos, 4 ° C. Recoger el sobrenadante y proceder para una mayor purificación. VI. Purificación de proteínas recombinantes mCD1d <ol><li> Diálisis y concentración en tampón fosfato de sodio 150 mM (pH 7,4) </li><li> De Ni-NTA agarosa cromatografía, eluir la proteína mCD1d + b2m con 150 mM de fosfato sódico 200 mM Immidazole </li><li> Ejecutar columna de la desalación con 20 mM Tris-HCl pH 8 buffer para deshacerse de Immidazole </li><li> Ejecutar cromatografía de intercambio aniónico con columna MonoQ para eliminar los contaminantes restantes. </li><li> Concentrado a 1mg/ml utilizando YM 30 concentrador (Millipore) </li><li> Biotynlation BirA enzimática de mCD1d acuerdo con el protocolo del fabricante (avidez) </li><li> La biotina libre se elimina por la columna S200 (Chromatograpy de exclusión de tamaño) con tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4. Un promedio de 2 a 3 mg de proteína biotynlated se podría obtener de dos litros de sobrenadante </li><li> Producción de un tetrámero-GalCer CD1d. </li></ol> Para cargar molécula CD1d con un GalCer, soluble biotynlated CD1d-b2m se incubaron durante la noche a temperatura ambiente, con tres veces superior a molar de un GalCer, disuelto en Tween 0,5% y el 20 en PBS, O.9% de cloruro de sodio. Tetrámeros se generan por la mezcla de uno-GalCer monómeros cargados CD1d con 4 veces superior a molar del PE - estreptavidina conjugada y la incubación durante 4 horas a temperatura ambiente. Almacenar a 48 ° C.

<ol><li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).</li>
<li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> Nature. 434, 520-525 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).</li>
<li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+family%3A+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).</li>
<li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+tetramers%3A+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).</li>
</ol>

En este procedimiento, se muestra cómo iniciar, crecer, infectar células de insecto y cómo el título de la baculovirus uso de estas células. Los aspectos más importantes de este procedimiento son el mantenimiento de las células y saber el título exacto de baculovirus. Una vez que se han generado CD1 tetrámeros, que puede ser utilizado como una herramienta poderosa para el análisis de glicolípido las células T reactivas. Sistemas de baculovirus también se utilizan ampliamente para producir proteínas recombinantes, incluyendo tetrámeros de MH...

<table><tbody><tr><td>Express Five SFM</td><td> Medio sin suero</td><td>Invitrogen</td><td>10486025</td><td></td></tr><tr><td>High Five TM</td><td> Células de insecto</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina Pen strep</td><td>Antibióticos</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Matraz TC de 25 cm2</td><td> Plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>Matraz TC de 175 cm2</td><td> Matraz con sello de tapón</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-8</td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer</td><td> Matraz para cultivo celular</td><td>Fisher Scientific</td><td>07 200 672</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador YM 30</td><td>30,000 MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC 903096</td><td></td></tr><tr><td>Equipo FPLC</td><td></td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzima y tampón BrA</td><td> Kit de biotinilación</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Columna de agarosa Ni-NTA</td><td>Columna para purificación de proteínas con etiqueta His</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columna de desalación</td><td> Para eliminar la sal de la proteína</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columna MonoQ</td><td>Cromatografía de intercambio aniónico</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columna S200</td><td> Cromatografía de exclusión por tamaño</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alpha-Galcer</td><td> Glicolípido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina-PE</td><td> Para conjugar proteínas</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S-866</td><td></td></tr></tbody></table>

un método para la producción de proteínas recombinantes en células de insecto mcd1d.

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteínas constituyen una tercera clase de moléculas presentadoras de antígeno. Son glicoproteínas de superficie celular, expresado en aproximadamente 50 kDa glicosilada cadenas pesadas que son covalentemente asociados con beta2-microglobulina. Se unen los lípidos en lugar de péptidos. A pesar de su estructura confirma la similitud de las proteínas CD1 a MHC de clase I y clase II que presentan las moléculas de antígeno, la ranura mCD1d es relativamente estrecha, profunda y altamente hidrofóbica y tiene dos bolsillos vinculante en lugar de los bolsillos de varios superficiales descritas para las clásicas MHC- codifican moléculas presentadoras de antígeno. Con base en sus secuencias de aminoácidos, como un surco hydrobphobic proporciona un ambiente ideal para la unión de antígenos lipídicos. El T asesinas naturales (NKT), las células utilizan su TCR de reconocer glicolípidos obligado o presentados por CD1d. Las células T reactivas a los lípidos presentados por CD1 han estado involucrados en la protección contra las enfermedades infecciosas y autoinmunes y el rechazo del tumor. Por lo tanto, la capacidad de identificar, purificar y hacer un seguimiento de la respuesta de CD1-reactiva de células NKT es de gran importancia. La generación de tetrámeros de alfa galactosil ceramida (a-GalCer) con CD1d tiene una visión significativa sobre la biología de las células NKT. Tetrámeros construido a partir de otras moléculas CD1 también se han generado y los nuevos reactivos han expandido enormemente el conocimiento de las funciones de las células T reactivas de lípidos, con uso potencial en el control de la respuesta a las vacunas basadas en lípidos y en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes y otras los tratamientos.

Un método para preparar las células de insectos y las infectan con el baculovirus con el propósito de la producción de proteínas recombinantes proteinand mCD1d generar tetrámeros mCD1d.

Un método para la producción de proteínas recombinantes en células de insecto mCD1d.

Las proteínas CD1 constituyen una tercera clase de moléculas presentadoras de antígenos. Son glucoproteínas de la superficie celular que se expresan como glucoproteínas glicosiladas de aproximadamente 50 kDa...

Hola, soy Ashra Corona del laboratorio del Dr. Mitch Kronenberg en el Departamento de Inmunología del Desarrollo del Instituto La Jolla para Alergia e Inmunología. Hoy les mostraré cómo preparar células de insecto High Five e infectarlas con VIR con el fin de generar tetrámeros de MA CD1D. Los tetrámeros de CD1D son utilizados por nuestro laboratorio y por otros para el reconocimiento de células NKT.El sistema VIR se utiliza ampliamente para producir proteínas recombinantes, incluyendo los temblores de la clase C del MS tipo dos TE. Por lo tanto, el procedimiento que se mostrará tiene una aplicabilidad mucho más amplia. Este procedimiento implica iniciar y cultivar células de insecto High Five, infectar las células con reovirus que portan el ADNc de CD1D, cosechar el sobrenadante mediante centrifugación tras cuatro días de infección, lisar y concentrar la proteína en tampón de fosfato sódico 150 milimolar, pH 7,4, purificar la proteína de CD1D de ratón mediante columnas de níquel y agarosa, e intercambio iónico por el método Romme, concentrar la proteína CD1G de ratón hasta 1 mg por mL utilizando un concentrador YM30, seguido de la biotinilación enzimática de la CD1D de ratón según el protocolo AVID D y la eliminación de biotina libre mediante una columna S200.Y finalmente, la producción de geles alfa de CD1D tetraméricos. Aunque todo el procedimiento incluye todos estos pasos, hoy solo les mostraremos cómo manipular estas células e infectarlas con virus con el fin de generar más tetrameros de CD1D. Comencemos.Antes que nada, me gustaría mostrarle cómo cultivar las células de insecto TN cinco; la línea celular High Five se originó a partir de células ováricas del gusano cogollero. Se utilizan en este protocolo porque crecen en medio libre de suero, son adaptables al cultivo en suspensión y producen altos niveles de proteína recombinante en cinco ml de medio InsectExpress en matraces para cultivo celular de 25 centímetros cuadrados. Obsérvese que el medio InsectExpress no contiene glutamina.Por lo tanto, necesitamos agregar 10 ml de un concentrado de glutamina pen estreptococo al 100x, o glutamina sola, a un litro de medio. Ahora voy a tomar el vial congelado de células de insecto High Five, descongelarlo inmediatamente en un baño de agua a 37 grados Celsius, agregar las células de insecto High Five al matraz e incubar durante 30 minutos a 27 grados Celsius. Luego, aspirar el medio para eliminar el medio que contiene DMSO, con cuidado y sin perturbar las células adheridas al fondo del matraz.Ahora necesitamos agregar cinco ml de medio fresco al frasco después del hawing; ahora necesitamos expandir las células antes de la infección con vir. Monitoree las células todos los días cuando el frasco esté casi al 70 % de confianza. Ponga las células en suspensión golpeando el frasco en ambos lados.Transfiera las células a un matraz cuadrado de 75 centímetros agregando 25 ml de medio insect express y cinco ml de matraz de división para cultivo celular. Divida de uno a cuatro o de uno a cinco según sea necesario. No permita que las células sobrepasen el crecimiento; cuente el número de pases que ha realizado al dividir las células.No exceda el número de pase 30 porque podría provocar el envejecimiento de las células, lo que resulta en lisis celular. Las células deben dividirse cada dos días. Si se dividen, la proporción es de uno a cinco.Cuando alcance el volumen deseado a la concentración de un millón de células por ml para infectar células, generalmente cultivo hasta dos litros, lo que suele equivaler a 71 matraces de escala de 75 centímetros con aproximadamente 25 ml por matraz, o cuatro matraces ER de un litro con aproximadamente 500 ml por matraz. Cultivar células en matraces ER es mucho más rápido; use 100 ml de cultivo y 400 ml de medio Express Five SFM y crezca en agitador a 125 rpm a una temperatura de 27 grados Celsius hasta alcanzar un millón de células por ml en el volumen deseado. Antes de infectar las células, me gustaría mostrarle cómo titular el virus belo y lo haremos a continuación. Para titular el virus, siembre de 3000 a 5000 células por pocillo.Pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo plano en 200 microlitros de medio SFM InsectExpress. Deje que las células sedimenten a 27 grados Celsius durante al menos 30 minutos. Realice la dilución seriada del stock de Avius.Se debe realizar una dilución seriada en una placa de 96 pocillos. Placa inferior utilizando 250 microlitros por pocillo. Las diluciones se realizan en medio SFM exprés cinco.Utilizando una pipeta multicanal, transfiera una cantidad fija, generalmente 20 microlitros de diferentes diluciones, a las culturas celulares en un incubador a 27 grados Celsius durante siete días para evitar la evaporación de las filas periféricas. Envuelva los bordes de la placa con cinta adhesiva después de siete días. Revise la placa y determine qué dilución del virus produce una infección del 50 %.Luego, utilice una fórmula para calcular la titulación, que se expresa en PFU por ml. La fórmula está incluida en la mayoría de los manuales de virus belo. Después de obtener el virus, para infectar las células con la finalidad de producir proteínas, la multiplicidad de infección debe estar entre cinco y 10.Por ejemplo, si el título del virus belo de CD1D de ratón es de cien millones de unidades formadoras de placas por ml y tenemos 20 millones de células por frasco, necesitamos añadir de uno a dos ml del virus belo para infectar las células. Las células deben infectarse durante cuatro días. Al cuarto día después de la infección, las células deben estar desprendidas, flotando, hinchadas y formando agregados similares a salchichas.Ahora es el momento de recuperar el sobrenadante. Tome el medio del matraz infectado y transfiéralo a botellas cónicas de 250 ml con tapa azul para centrifugación. Estas pueden esterilizarse en autoclave y reutilizarse.Llene los frascos de manera uniforme y envíelos a centrifugar las células con un rotor GSA a 2000 RPM durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Recopile el sobrenadante y continúe con la purificación adicional. Acabo de mostrarle cómo iniciar, cultivar e infectar las células de insecto High Five y titular el virus Balo.Utilizando estas células, los aspectos más importantes de este procedimiento son cómo mantener las células y cómo conocer el título exacto de los baus. Una vez que se han generado los temblores de CD 1D, pueden utilizarse como una herramienta poderosa para el análisis de linfocitos T reactivos frente a glicolípidos. Este procedimiento para manipular y teñir el virus balo puede utilizarse también para muchas otras proteínas recombinantes.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Biología

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