Técnica laparoscópica para la Recolección de serie del hígado y los ganglios linfáticos mesentéricos en macacos

El objetivo general de este procedimiento laparoscópico mínimamente invasivo es mejorar la evaluación de los efectos de la translocación microbiana desde el tracto gastrointestinal mediante la recolección de ganglios linfáticos mesentéricos y biopsias hepáticas en múltiples puntos temporales, al tiempo que se mejora el bienestar animal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del VIH sobre las consecuencias inmunológicas de la infección y la translocación microbiana en los ganglios linfáticos mesentéricos y el hígado, y la patología de estos tejidos. La principal ventaja de esta técnica es que permite tomar muestras en múltiples puntos temporales de un estudio con un impacto mínimo en el animal o en los parámetros que se están evaluando.

Este método puede proporcionar muestras críticas para avanzar en nuestra comprensión del VIH. También se puede aplicar a otros modelos en los que la inflamación gastrointestinal y la translocación microbiana son importantes. El procedimiento será realizado por el Dr. Jeremy Smedley y la Dra. Cassie Moats, cirujanos veterinarios del Centro Nacional de Investigación de Primates de Washington.

Después de preparar un macaco para la cirugía como se indica en el protocolo de texto, cúbralo con un paño fenestrado estéril. A continuación, con una cortina de cámara estéril, cubra herméticamente la cámara digital y conéctela a la torre. Conecte el visor rígido con el cabezal de la cámara.

A continuación, conecte un cable de luz estéril al visor rígido y conéctelo a la fuente de luz. Por último, monte un tubo de insuflación estéril en el insuflador. Para comenzar la laparoscopia, coloque una hoja de 15 bisturíes aproximadamente de uno a dos centímetros a la izquierda del ombligo y haga una incisión de aproximadamente 5 milímetros en la piel que llegue a los músculos abdominales.

Con la mano no dominante, levante la pared abdominal en el lado craneal de la incisión. Luego, con la otra mano, introduzca a través de la incisión la punta de una aguja en varo inclinada hacia la cabeza del animal. Sostenga la aguja en varo por el eje y empújela firmemente hasta que atraviese la pared abdominal y la resistencia contra la aguja disminuya en la cavidad abdominal.

A continuación, conecte el tubo del insuflador de CO2 a la aguja y abra la llave de paso para liberar el gas en la cavidad abdominal. Crea un neumoperitoneo alcanzando una presión de hasta 10 a 12 milímetros de mercurio. Ahora que el abdomen está completamente insuflado, coloque la hoja del bisturí 15 sobre el abdomen craneal izquierdo, aproximadamente de dos a cuatro centímetros caudal hasta la última costilla, y haga una incisión en la piel de aproximadamente cinco a siete milímetros.

A continuación, inserte a través del corte un conjunto de cánula de trocar de cinco milímetros. Introduzca el conjunto a una profundidad de uno a dos centímetros, dirigiéndolo aproximadamente a 45 a 60 grados caudomedialmente. Luego, con un movimiento giratorio, deslice la cánula hacia adelante alcanzando una profundidad de 1,5 a tres centímetros para enroscar la cánula en el abdomen.

Después, retira el trocar. Desconecte el tubo insuflador de la aguja varo y, a continuación, apague la llave de paso. Conecte el tubo a la cánula y abra la llave de paso para mantener el neumoperitoneo.

Una vez comprobado que la presión se mantiene con éxito, retire la aguja en varo. A continuación, a través de la cánula, inserte el endoscopio rígido en la cavidad abdominal. Bajo el control de la cámara, profundice la incisión cutánea que queda después de la extracción de la aguja en varo, cortando los músculos abdominales y el peritoneo.

Por último, coloque al animal con las patas elevadas aproximadamente de 15 a 30 grados por encima de la cabeza. Para recolectar una biopsia del ganglio linfático mesentérico, introduzca una sonda sólida en la cavidad abdominal a través de la incisión preparada. Coloque la sonda entre el epiplón y el intestino y, con un movimiento suave de barrido, exponga el intestino del epiplón para visualizar el mesenterio que se esconde debajo.

Continúe moviendo la sonda de la dirección caudal a la craneal para alejar el epiplón del campo operatorio. Luego, con la sonda, mueva el colon descendente hacia la pared abdominal. Examine el mesenterio con la sonda para localizar los ganglios linfáticos mesentéricos ubicados a lo largo del colon y los vasos mesentéricos.

Una vez que se identifique el ganglio linfático, reemplace la sonda en la cavidad abdominal con pinzas de trinquete Maryland y agarre el mesenterio adyacente al ganglio. Tire del mesenterio hacia la incisión y retire el endoscopio de la cánula. A continuación, apague el insuflantador y deje la llave de paso de la cánula abierta para liberar el gas del abdomen, lo que facilitará la exteriorización del mesenterio.

A continuación, tire del mesenterio a través de la incisión. Agarre el mesenterio exteriorizado con pinzas para asegurar el acceso a través de la incisión. Palpar u observar el mesenterio para identificar el ganglio linfático que debería aparecer como un nódulo más firme o un área más gris.

A continuación, utilizando hemostáticos curvos, haga una abertura de tres a cinco milímetros en el mesenterio adyacente al ganglio y diseccione sin rodeos las uniones al tejido. Si es necesario, ligar la vasculatura con una sutura de monofilamento no absorbible 4-0 y, con el bisturí, diseccionar el ganglio linfático. Luego, coloque la biopsia en medio RPMI 1640 sobre hielo.

Por último, libere el mesenterio e insufle el abdomen una vez más para permitir la retirada del tejido hacia la cavidad abdominal. Vuelva a colocar la mesa en posición horizontal. Para recolectar una biopsia de hígado, inserte una cánula roscada en la cavidad abdominal a través de la incisión utilizada para la recolección de ganglios linfáticos.

Luego, usando la cánula, deslice el endoscopio rígido dirigido hacia la cavidad abdominal craneal para visualizar el hígado. Bajo el control de la cámara, introducir pinzas de biopsia a través de la cánula previamente utilizada para insuflar la cavidad abdominal. Coloque las pinzas por debajo del margen designado del lóbulo hepático de modo que sus mandíbulas miren hacia el tejido, y abra las pinzas permitiendo que el margen caiga en las mandíbulas.

Después de ajustar su posición, cierre las pinzas y mantenga la presión durante aproximadamente 20 a 30 segundos. A continuación, extraiga la muestra tirando suavemente de las pinzas a través de la cánula. Coloque la biopsia en medio RPMI sobre hielo.

Finalmente, asegúrese de que no se observe ninguna hemorragia en el sitio de la biopsia y cierre las incisiones. Aquí se presentan los rendimientos celulares obtenidos de biopsias de ganglios linfáticos mesentéricos y de hígado recolectadas de dos mecascos femeninos sanos en dos puntos de tiempo diferentes. Como se esperaba, las biopsias de ganglios linfáticos produjeron un número significativamente mayor de células aisladas en comparación con las biopsias de hígado.

Independientemente del tejido de origen, más del 85% de las células aisladas eran viables. A continuación, se analizaron las muestras de células aisladas para las poblaciones de leucocitos CD45+ y linfocitos CD45+CD3+. Los ganglios linfáticos mesentéricos tenían mayores frecuencias de leucocitos CD45+ y linfocitos CD3+ en comparación con las células derivadas del hígado.

La caracterización detallada de las poblaciones aisladas mostró que los ganglios linfáticos mesentéricos contenían proporciones significativamente mayores de células T CD3+ y células T CD4+, así como un número elevado de células T CD8+. Por el contrario, el hígado estaba significativamente enriquecido en leucocitos CD14+. Ambos órganos mostraron abundancias similares de células CD20+B.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 a 40 minutos. Por lo general, los animales se recuperan de la anestesia, se activan y comen en un par de horas, y las incisiones son tan pequeñas que pueden ser difíciles de ver desde el lado de la jaula. Al intentar este procedimiento, es importante mantener a los animales en una condición corporal que facilite el éxito.

La grasa significativa del mesenterio puede ser un obstáculo desafiante, ya que oscurece los ganglios y aumenta la fritura y el sangrado. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la flebotomía, la biopsia de ganglios linfáticos periféricos, la endoscopia del tracto gastrointestinal superior e inferior y la biopsia rectal para evaluar las respuestas inmunitarias sistémicas y mucosas, el estado de los microbios y las barreras epiteliales, así como las cargas virales. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores de nuestro laboratorio exploraran longitudinalmente las poblaciones microbianas en la inflamación en tejidos de macacos que antes solo estaban disponibles mediante necropsia.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para el VIH, ya que la translocación microbiana es una de las principales causas de inflamación que impulsa la patogénesis del VIH. La evaluación de esto en serie puede proporcionar objetivos potenciales y permitir la evaluación de intervenciones terapéuticas. No olvide que trabajar con macacos infectados con virus puede ser extremadamente peligroso.

Se deben tomar precauciones como la capacitación adecuada para los riesgos biológicos, incluido el herpesvirus macacoqueño 1, el equipo de protección personal adecuado, los kits para mordeduras y arañazos y el seguimiento médico adecuado.