Método electrofisiológico para grabaciones de abrazadera de voltaje de células enteras Drosophila Fotorreceptores

El objetivo general de este procedimiento es obtener registros de pinza de voltaje de celda completa de una sola celda fotorreceptora para medir las corrientes inducidas por la luz que surgen de la absorción de un solo fotón y de las respuestas repetidas a la luz intensa. Este método puede ayudar a abordar temas clave del campo de transducción sensorial, como la transducción visual para los mecanismos físicos e iónicos que subyacen a la fototransducción y las propiedades de los canales TRP. Las ventajas de utilizar esta técnica incluyen el control total de la tensión de membrana y una relación señal-ruido extremadamente alta y la capacidad de introducir indicadores específicos para mediciones ópticas.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con el tamaño diminuto de la preparación y la necesidad de realizar la disección rápidamente debido a la vulnerabilidad metabólica del tiempo. Para este procedimiento, cría moscas a una densidad de aproximadamente 20 por vial. En el momento del experimento, tenga algunos viales con pupas que estén a punto de cerrarse y que hayan estado bajo oscuridad constante durante al menos 24 horas.

Dos horas antes de recoger a los adultos, retire a los adultos encerrados. Manipule siempre las moscas ajustadas a la oscuridad en pañuelos de papel bajo iluminación de luz roja. Mientras espera las moscas recién cerradas, prepare la cámara de grabación.

En el fondo de la cámara, fije el cubreobjetos con parafina derretida o grasa de silicona de alto vacío para completar el baño. A continuación, monte el baño en la platina del microscopio invertido. En el baño, coloque el tubo del sistema de perfusión, el tubo del sistema de succión y el cable de tierra para la configuración de electrofisiología.

Antes de comenzar la disección, prepare algunas soluciones en la parte posterior de una placa de Petri de 60 milímetros. Deposite cuatro gotas separadas de ES sin calcio y una gota de TS. Ahora, con unas pinzas ásperas, atrapa una mosca que se haya cerrado recientemente por las alas o el cuerpo. Luego, con unas pinzas finas, separe la cabeza y transfiera rápidamente la cabeza a la primera gota de ES sin calcio. Bajo un estereoscopio, diseccione la cabeza por la mitad a lo largo del plano sagital con un segundo par de pinzas finas.

Asegúrate de que ambos ojos permanezcan intactos. Ahora transfiera la mitad de la cabeza a la segunda gota de ES sin calcio y la otra mitad de la cabeza a la tercera gota de ES sin calcio. A continuación, proceda a diseccionar uno de los dos ojos.

Con pinzas finas, retire la mayor cantidad posible de tejido que rodea el ojo para asegurarse de que no se cause daño a la retina. A continuación, sujete firmemente el borde de la córnea con unas pinzas finas y saque la retina. El resultado debería ser una córnea vacía e intacta, separada de una retina intacta.

Las pipetas se conservan en etanol, por lo tanto, cuando utilice una pipeta de trituración nueva, enjuáguela siempre primero con agua. Ahora llene la pipeta enjuagada con un pequeño volumen de ES sin calcio a partir de la cuarta gota. A continuación, mediante una suave aspiración bucal, introduzca la retina aislada en la pipeta.

Evite atrapar burbujas de aire con extrema precaución. A continuación, deposita la retina en la gota de TS. A continuación, repita el aislamiento de la retina en el segundo ojo para que ambos estén ahora en la gota TS. A continuación, limpie delicadamente sólo los ES sin calcio de la placa de Petri y añada seis gotas más de TS a la superficie de la placa.

Transfiera ambas retinas en nuevas gotas de TS. A continuación, sustituya la pipeta de trituración por una que tenga una abertura de diámetro pequeño. Después de enjuagarlo, llene la pipeta con una gota de TS. Con esta pipeta, aspire y espira rápida y repetidamente ambas retinas para separar algunos omatidios de las células pigmentarias. El TS se nublará a medida que esto suceda.

A continuación, transfiere los restos de ambas retinas a otra gota de TS. A continuación, cargue la pipeta con la gota TS turbia que contiene los omatidios aislados. Espira la solución en la cámara del baño. Repita este procedimiento con pipetas de trituración de diámetro más pequeño decreciente hasta que la retina se haya disuelto por completo.

Un momento. Durante esta pausa, los omatidios aislados se unirán al fondo de la cámara. Después de un minuto, comience a fluir CE que contenga 1,5 milimolares de calcio utilizando el sistema de perfusión.

A medida que se llena la cámara, asegúrese de que el cable de tierra y el tubo de succión estén sumergidos. Deje que la solución fluya durante 60 a 90 segundos antes de continuar. Para comenzar, use el objetivo 40x para inspeccionar cuidadosamente los omatidios en el baño.

Obsérvese que los cuerpos celulares fotorreceptores alargados que forman el omatridio están separados de sus axones, pero siguen siendo viables. Ahora elija un omatidio adecuado para el experimento. Seleccione cuando cumpla con los siguientes criterios.

La membrana exterior debe ser lisa e intacta. El eje largo debe estar casi en ángulo recto con respecto al enfoque del electrodo desde el lado distal. Y el omatridio no debe estar rodeado por ningún exceso de tejido.

Una vez seleccionado, centre el omatidio en el campo de visión. Ahora llene una pipeta con la solución intracelular adecuada para el experimento. Y redondee la pipeta hasta el portaelectrodos.

A continuación, sople en el tubo de la pipeta para crear una presión positiva y bloquear la presión cerrando la válvula del tubo. A continuación, inserte la pipeta en la cámara de baño y guíela cerca de la sección distal del omatidio hasta que se observe un pequeño hoyuelo en la membrana, que se debe a la presión positiva de la pipeta parcheada. Ahora abra el módulo de prueba de membrana en el software de grabación para aplicar pulsos continuos de voltaje cuadrado de dos milivoltios a una velocidad de 100 hercios.

A continuación, usando los controles del amplificador de abrazadera de parche, establezca el potencial de unión en cero para establecer la base del pulso cuadrado en corriente cero. A continuación, abra la válvula para liberar la presión de la pipeta y aspire suavemente para crear una presión negativa. A continuación, la pipeta debe adherirse a la membrana celular.

Una vez que esto ocurra, cierre la válvula para bloquear la presión. Ahora verifique la resistencia del electrodo. Debe elevarse entre 100 y 150 megaohmios.

A continuación, libere la presión negativa de la pipeta abriendo de nuevo la válvula. La resistencia ahora debería saltar hasta entre uno y dos gigaohmios, lo que indica que se ha formado una C entre la pipeta y la celda. A continuación, utilizando el amplificador de pinza de parche, compense la corriente capacitiva de la pipeta.

Para hacer la configuración de célula completa, rompa la membrana celular mediante aspiración bucal. Cree episodios rápidos, cortos y contundentes de presión negativa en el electrodo. Al obtener la configuración de celda completa, se producirá un aumento repentino en la capacitancia.

Luego, usando el amplificador de abrazadera de parche, ajuste el potencial de retención al voltaje requerido y compense las corrientes capacitivas en resistencia en serie. Ahora cierra la cortina francesa negra de la jaula de Faraday y comienza el experimento. Después de obtener la configuración de la célula completa con una pipeta de parche que contiene el colorante fluorescente, el amarillo Lucifer, se puede ver que solo uno de los fotorreceptores que forman el omatidio se ha cargado con el colorante.

Este fotorreceptor también estará aislado eléctricamente de sus vecinos en el omatidio. Los omatidios sujetados por voltaje de toda la célula de moscas de tipo salvaje y moscas con mutaciones en los genes InaC o InaD mostraron protuberancias cuánticas en respuesta a la luz tenue continua. Se observó una terminación lenta de las protuberancias en ambos mutantes en relación con las moscas de tipo salvaje.

Las respuestas normalizadas a pulsos de luz de 500 milisegundos emitidos a 150.000 fotones por segundo, las fisiologías alteradas se ilustran claramente. Usando la preparación, incluso fue posible medir las respuestas de choque cuántico sujetas de voltaje de toda la celda a una luz tenue breve de un milisegundo. Tales respuestas de fotón único se compararon en moscas mutantes de arrestina de tipo salvaje y mutantes de ninaC.

Ambos mutantes respondieron con una serie de golpes. Respuestas normalizadas a un pulso de luz de 500 milisegundos a 15.000 fotones por segundo. Por lo tanto, la terminación lenta de la respuesta macroscópica se observa en los mutantes arrestina-2 y ninaC.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer grabaciones de células enteras a partir de células fotorreceptoras de Drosophila. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores comprendan mejor los canales TRP y la señalización lipídica del inositol, así como el papel de las células ganglionares de la retina intrínsecamente fotosensibles que se encuentran en los mamíferos y que participan en actividades dependientes de la luz no formadoras de imágenes.