Método electrofisiológico para grabaciones de abrazadera de voltaje de células enteras

El objetivo general de este procedimiento es obtener grabaciones de bloqueo de voltaje en células completas a partir de una única célula fotorreceptora para medir las corrientes inducidas por la luz que surgen de la absorción de un solo fotón y de las respuestas repetidas a luz intensa. Este método puede ayudar a abordar temas clave del campo de la transducción sensorial, como la transducción visual tanto en sus mecanismos físicos como iónicos que subyacen a la fototransducción, así como las propiedades de los canales TRP. Las ventajas del uso de esta técnica incluyen el control completo del voltaje de membrana, una relación señal-ruido extremadamente alta y la posibilidad de introducir indicadores específicos para mediciones ópticas.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con el tamaño minúsculo de la preparación y con la necesidad de realizar la disección rápidamente debido a una vulnerabilidad metabólica temporal. Para este procedimiento, críe moscas a una densidad de aproximadamente 20 por frasco. En el momento del experimento, tenga algunos frascos con pupas que estén a punto de cerrarse y que hayan estado en oscuridad constante durante al menos 24 horas.

Dos horas antes de recolectar los adultos, retire cualquier adulto emergido. Siempre manipule las moscas adaptadas a la oscuridad con tejidos bajo iluminación de luz roja. Mientras espera a que emergan las moscas recién eclosionadas, prepare la cámara de registro.

En la parte inferior de la cámara, fije el cubreobjetos utilizando parafina fundida o grasa de silicona de alto vacío para completar el baño. Luego, monte el baño en la platina del microscopio invertido. En el baño, coloque el tubo del sistema de perfusión, el tubo del sistema de succión y el cable de tierra para la configuración de electrofisiología.

Antes de comenzar la disección, prepare algunas soluciones en la parte posterior de una placa de Petri de 60 milímetros. Deposite cuatro gotas separadas de ES sin calcio y una gota de TS. Ahora, utilizando pinzas gruesas, atrape una mosca que haya emergido recientemente por sus alas o cuerpo. Luego, usando pinzas finas, separe la cabeza y transfiera rápidamente la cabeza a la primera gota de ES sin calcio. Bajo un estereoscopio, corte la cabeza por la mitad a lo largo del plano sagital utilizando un segundo par de pinzas finas.

Asegúrese de que ambos ojos permanezcan intactos. Ahora transfiera 1/2 de la cabeza a la segunda gota de ES sin calcio y la otra mitad de la cabeza a la tercera gota de ES sin calcio. Luego, continúe disecando uno de los dos ojos.

Utilizando pinzas finas, retire la mayor cantidad posible del tejido que rodea el ojo para asegurarse de que no se dañe la retina. Luego, sujete firmemente el borde de la córnea con pinzas finas y extraiga la retina. El resultado debe ser una córnea intacta y vacía, separada de una retina intacta.

Las pipetas se mantienen en etanol, por lo tanto, al usar una pipeta de trituración nueva, siempre enjuáguela primero con agua. A continuación, llene la pipeta enjuagada con un pequeño volumen de ES libre de calcio proveniente de la cuarta gota. Luego, mediante aspiración suave con la boca, introduzca la retina aislada en la pipeta.

Evite atrapar burbujas de aire con extrema precaución. A continuación, coloque la retina en la gota de TS. Después, repita el aislamiento de la retina en el segundo ojo para que ambos ahora estén en la gota de TS. Luego, limpie cuidadosamente solo el ES sin calcio del platillo de Petri y agregue seis gotas más de TS sobre la superficie del platillo.

Transfiera ambas retinas a nuevas gotas de TS. Luego, reemplace la pipeta de trituración por una que tenga una abertura de pequeño diámetro. Después de enjuagarla, llene la pipeta con una gota de TS. Con esta pipeta, aspire y expulse rápidamente y de forma repetida ambas retinas para separar algunos omatidios de las células pigmentarias. El TS se volverá turbio durante este proceso.

A continuación, transfiera los restos de ambas retinas a otra gota de TS. Luego, cargue la pipeta con la gota turbia de TS que contiene los ommatidios aislados. Expuje la solución dentro de la cámara de baño. Repita este procedimiento utilizando pipetas de trituración con diámetros cada vez menores hasta que la retina se haya disuelto completamente.

Ahora, espere un minuto. Durante esta pausa, los ommatidios aislados se unirán al fondo de la cámara. Después de un minuto, comience a fluir ES que contenga calcio 1,5 milimolar utilizando el sistema de perfusión.

Mientras se llena la cámara, asegúrese de que el cable de tierra y el tubo de succión estén sumergidos. Deje que la solución fluya durante 60 a 90 segundos antes de continuar. Para comenzar, utilice el objetivo de 40x para inspeccionar cuidadosamente los omatidios en el baño.

Tenga en cuenta que los cuerpos celulares alargados de los fotorreceptores que forman el ommatidio están separados de sus axones pero permanecen viables. Ahora elija un ommatidio adecuado para el experimento. Seleccione aquel que cumpla los siguientes criterios.

La membrana externa debe ser lisa e intacta. El eje largo debe estar casi en ángulo recto con respecto al enfoque del electrodo desde el lado distal. Y el omatidio no debe estar rodeado por ningún tejido excesivo.

Una vez seleccionado, centre el ommatidio en el campo de visión. Ahora llene una pipeta con la solución intracelular adecuada para el experimento. Y conecte la pipeta al porta-electrodos.

Luego, sople dentro del tubo de la pipeta para crear una presión positiva y bloquee la presión cerrando la válvula del tubo. A continuación, inserte la pipeta en la cámara de baño y guíela cerca de la sección distal del ommatidio hasta observar un pequeño hundimiento en la membrana, causado por la presión positiva de la pipeta parcheada. Ahora abra el módulo de prueba de membrana en el software de registro para aplicar pulsos cuadrados continuos de dos milivoltios a una frecuencia de 100 hercios.

A continuación, utilizando los controles del amplificador de parche, ajuste el potencial de unión a cero para establecer la base del pulso cuadrado en corriente cero. Luego abra la válvula para liberar la presión en la pipeta y aspire suavemente para crear presión negativa. La pipeta debería entonces adherirse a la membrana celular.

Una vez que esto ocurra, cierre la válvula para mantener la presión. Ahora verifique la resistencia del electrodo. Debe estar elevada entre 100 y 150 megaohmios.

Luego, libere la presión negativa en la pipeta abriendo nuevamente la válvula. La resistencia ahora debería aumentar bruscamente entre uno y dos gigaohmios, lo que indica que se ha formado un sello C entre la pipeta y la célula. A continuación, utilizando el amplificador de parche, compense la corriente capacitiva de la pipeta.

Para obtener la configuración de célula completa, rompa la membrana celular mediante aspiración bucal. Aplique rápidos y breves impulsos de presión negativa en el electrodo. Al alcanzar la configuración de célula completa, se producirá un aumento repentino en la capacitancia.

Luego, utilizando el amplificador de registro por parche, ajuste el potencial de sostenimiento al voltaje requerido y compense las corrientes capacitivas en la resistencia en serie. Ahora cierre la cortina negra francesa de la jaula de Faraday e inicie el experimento. Después de obtener la configuración de célula completa con una pipeta de parche que contiene el colorante fluorescente Lucifer yellow, puede observarse que solo uno de los fotorreceptores que forman el ommatidio ha sido cargado con el colorante.

Este fotorreceptor también estará aislado eléctricamente de sus vecinos en el ommatidio. Ommatidios con registro en modo voltaje-clamp de célula completa provenientes de moscas de tipo salvaje y de moscas con mutaciones en los genes InaC o InaD mostraron picos cuánticos en respuesta a luz tenue continua. Se observó una terminación lenta de los picos en ambos mutantes en comparación con las moscas de tipo salvaje.

Las respuestas normalizadas a pulsos de luz de 500 milisegundos entregados a 150.000 fotones por segundo ilustran claramente las fisiologías alteradas. Con este preparado, incluso fue posible medir respuestas de salto cuántico en células enteras bajo bloqueo de voltaje a estímulos de luz tenue de un milisegundo de duración. Dichas respuestas a un solo fotón se compararon en moscas del tipo silvestre, mutantes de arrestina y mutantes de ninaC.

Ambos mutantes respondieron con una serie de picos. Respuestas normalizadas a un pulso de luz de 500 milisegundos entregado a 15.000 fotones por segundo. Por lo tanto, la terminación lenta de la respuesta macroscópica se observa en los mutantes de arrestina-2 y ninaC.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar registros de célula completa en células fotorreceptoras de Drosophila. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en una hora si se realiza adecuadamente. Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores comprendan mejor los canales TRP y la señalización de lípidos de inositol, así como el papel de las células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles presentes en los mamíferos, que participan en actividades dependientes de la luz no formadoras de imágenes.