Name: Métodos para clasificar los focos citoplasmáticos como gránulos de estrés de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende a identificar gránulos de estrés en células U-2 OS mediante inmunofluorescencia e hibridación in situ. Este protocolo validado permite distinguir verdaderos gránulos de otros focos citoplasmáticos en estudios de biología celular.

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Damos las gracias a los miembros de los laboratorios Ivanov y Anderson por su útil discusión y comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [GM111700 y CA168872 a PA, NS094918 a PI], el Centro Nacional de Ciencias en Polonia [otorgar UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 a WS]. WS también reconoce al Ministerio de Ciencia y Educación Superior en Polonia (Programa Mobility Plus) ya la Comisión Fulbright Polaco-Americana por el apoyo financiero de su investigación en los Estados Unidos.

1. Preparación de células <ol><li> Añadir cubreobjetos autoclavados a 12 pocillos de una placa de 24 pocillos, como se indica en la Figura 1A ; Esto se puede hacer usando una pipeta Pasteur estéril unida a un vacío para recoger cada cubreobjetos. Golpee suavemente la cubreobjetos en el lado del pozo para liberar la succión, permitiendo que la cubreobjetos caiga en el pozo. </li><li> Placa 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) células de osteosarcoma por pocillo a un volumen final de 500 μl de medio. Mueva la placa de lado a lado y arriba y abajo varias veces para asegurarse de que las células están distribuidas uniformemente. </li><li> Presione suavemente los cubreobjetos con una punta P1000 limpia para asegurarse de que el cubreobjetos está en la parte inferior del pozo y que no hay burbujas debajo de la cubreobjetos. </li></ol> 2. Subrayando las células <ol><li> Al día siguiente, revise visualmente la placa para asegurarse de que las células están uniformemente dispersas y uniformemente confluentes a través de la cubreobjetos, ya que las variaciones entre saLos modelos pueden afectar negativamente a la reproducibilidad de los resultados. Utilice un objetivo de 10X en un microscopio invertido de cultivo de tejidos. </li><li> Precaliente el medio a 37 ° C. Evite aplicar medios fríos o calientes a las células, ya que éstas causan choque en frío o choque térmico, respectivamente. </li><li> Diluir los medicamentos en medios precalentados. Para cada concentración de fármaco diferente, preparar 2 pocillos que contienen 500 μl de medio. Prepare 500 μl adicionales para permitir la pérdida mientras se pipetea. Alícuota 4 tubos, cada uno conteniendo 1,5 mL. <ol><li> Para el arsenito de sodio: a cada pocillo que contenga 500 μl, añadir 1,5 μl de arsenito sódico 100 mM (concentración final: 100 μM) o añadir 0,75 μl de arsenito sódico 100 mM (concentración final: 50 μM). </li><li> Para la vinorelbina: a cada pocillo que contiene 500 μl, añadir 22,5 μl de vinorelbina 10 mM (concentración final: 150 μM) o añadir 18,75 μL de vinorelbina 10 mM (concentración final: 100 μM). NOTA: Arsenito de sodio<html> Es un inductor de gránulos de esfuerzo bien caracterizado y comúnmente utilizado y, por lo tanto, se utiliza clásicamente como control positivo. </li></ol></li><li> Retire y deseche el medio de los pocillos B1 - 4 y C1 - 4. Agregue el medio con medicamentos y espere 60 min (Figura 1A). <ol><li> Añadir 500 μl de medio con arsenito sódico 100 μM a los pocillos B1 y B2. Añadir 500 μl de medio con 50 μM de arsenito de sodio a los pocillos B3 y B4. </li><li> Añadir 500 μl de medio con 150 μM de vinorelbina a los pozos C1 y C2. Añadir 500 μl de medio con 125 μM de vinorelbina a los pozos C3 y C4. </li></ol></li><li> 30 min antes de la fijación, tratar los pocillos en la columna 2 con 5 μl de cicloheximida (1 mg / ml de stock) y los pocillos en la columna 4 con 2 μl de puromicina (1,25 mg / ml de stock). Rocíe suavemente la placa para que se mezcle antes de colocar la placa en la incubadora a 37 ° C. </li></ol> 3. Fijación Celular e Inmunofluorescencia Nt &quot;&gt; NOTA: antes del experimento, asegúrese de que el metanol se enfría a -20 ° C. Hacer tampones, incluyendo solución salina tamponada con fosfato (PBS), 5% de suero de caballo normal (NHS) en PBS y 4% de paraformaldehído ) En PBS. <ol><li> Deseche el medio y lave los pocillos que contengan cubreobjetos con PBS. Dependiendo de los fármacos utilizados, puede ser importante descartar adecuadamente los medios que contienen drogas; Póngase en contacto con la oficina de seguridad ambiental local para obtener instrucciones específicas. Para lavar de manera eficiente, llenar una botella de compresión con PBS, cortar la punta para permitir un flujo suave en lugar de una corriente apretada, y utilizar esto para agregar PBS a cada pozo después de aspirar el PBS original. </li><li> Fijar las células utilizando ~ 250 μ l de 4% PFA durante 15 min a RT bajo agitación suave. Cubra completamente la parte superior del cubreobjetos con PFA; 250 μL debe ser suficiente, pero si no, agregue más. Siempre evite pipetear directamente sobre los cubreobjetos, ya que algunas células (o tratamientos de estrés de las células) pueden alterar el apego, y tLa fuerza de la pipeta puede desalojar las células. </li><li> Retire el PFA y deséchelo correctamente. Póngase en contacto con la oficina local de seguridad ambiental para obtener detalles sobre cómo desechar adecuadamente el paraformaldehído. </li><li> A~nadir ~ 250 μl de metanol (-20 ◦ C) e incubar durante 5 min a TA bajo agitación suave; Esto permeabiliza y aplana las células. </li><li> Retirar y descartar el metanol y bloquear las células mediante la aplicación de ~ 250 μ l de NHS al 5% durante 1 h a RT O / N a 4 ° C. Póngase en contacto con la oficina local de seguridad ambiental para obtener más información sobre cómo desechar adecuadamente el metanol. </li><li> Para los anticuerpos primarios, diluir los anticuerpos en NHS al 5%. NOTA: El uso de múltiples marcadores SG es clave para confirmar si los gránulos observados son SGs de buena fe . El número de marcadores SG que se pueden utilizar depende de los filtros disponibles en el microscopio. Si se dispone de juegos de filtros estándar verde, rojo y rojo distante, utilice G3BP1, eIF4G y eIF3b a una dilución de 1/250. <ol><lI&gt; Para este experimento (12 cubreobjetos a 250 μL cada uno-Total: 3 ml de NHS al 5%), añada 12 μl de cada uno de los siguientes: anti-G3BP1, anti-eIF3b y anti-eIF4G. Incubar los anticuerpos primarios utilizando agitación suave durante al menos 1 h a RT o O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lavar los pocillos 3x con PBS, e incubar cada lavado durante 5 min. </li><li> Para anticuerpos secundarios, diluir todos los anticuerpos secundarios (dilución 1/250) y colorante Hoechst (dilución 1/1000) en NHS al 5%. <ol><li> Para este experimento (12 cubreobjetos a 250 μL cada uno-Total: 3 ml de NHS al 5%), añada 12 μl de cada uno de los siguientes: Cy2-Ratón, Cy3-Conejo y Cy5-Cabra (una dilución 1/250 de cada uno ) Y añadir 3 μl de colorante Hoechst. </li><li> Incubar los cubreobjetos con los anticuerpos secundarios durante 1 h a RT. Durante este y los pasos siguientes, proteja las muestras de la luz cubriendo la placa con una caja o colocando la hoja sobre la tapa de la placa de la cultura de tejido. </li></ol></li><li> Lava elLls tres veces con PBS durante 5 min cada uno. </li><li> Coloque los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio etiquetados utilizando el soporte de montaje. Calentar el medio de montaje en un bloque de calor a 37 ° C durante 10 min; Esto disminuye la viscosidad y facilita la pipeta. Con una punta de corte P200, pipetee 25 μl de medio de montaje por cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio; 4-8 cubreobjetos pueden caber en una diapositiva de cristal, suponiendo que la etapa de microscopio permite esto. Usando fórceps finos, transfiera el cubreobjeto del pozo a la diapositiva, asegurándose de colocar el lado de la celda hacia abajo en el soporte de montaje. Utilizando una punta P200 limpia, presione el cubreobjetos hacia abajo. </li><li> Una vez que todos los cubreobjetos han sido montados, use tejido de laboratorio doblado para limpiar el exceso de medio de montaje presionando el tejido de laboratorio muy firmemente sobre la diapositiva. Utilice una botella de compresión que contenga H2O para eliminar el exceso de medio de montaje y luego repetir la transferencia con el tejido doblado de laboratorio para eliminar el agua. </li></ol> 4. Fluorescencia In Situ &lt;/ Em&gt; Hibridación (FISH) <ol><li> Plato y tratar las células, utilizando los pasos 1 y 2.1-4 como una guía; Sólo es necesario chapar las células en la columna 1, ya que sólo 3 cubreobjetos son necesarios en el siguiente experimento. </li><li> Asegúrese de que todos los tampones están preparados ( es decir, PFA al 4% en PBS, etanol al 70% en agua, 2x Citrato de Sodio Salino (SSC) y NHS al 5%), que el metanol se enfríe a -20ºC y que El horno de hibridación se calienta hasta la temperatura apropiada. </li><li> Lleve a cabo los pasos 3.1-3.3 para lavar y fijar las células. </li><li> Permeabilizar las células mediante la adición de -20 ° C de metanol durante 10 min. </li><li> Retire el metanol e incube los cubreobjetos en etanol al 70%. Colocar la placa a 4 ° C durante la noche. Selle la placa usando parafilm para evitar la evaporación. </li><li> Al día siguiente, eliminar el etanol y rehidratar las células mediante la adición de 500 μ l de 2x SSC. Incubar los cubreobjetos durante 5 min con agitación suave a RT. </li><li> Quite el SSC 2x y añada 500Μl de SSC 2X. Incubar durante 5 min bajo agitación suave. </li><li> Coloque un pedazo de parafilm plano en la parte inferior del horno de hibridación. Pipetear 25 μL de tampón de hibridación sobre el parafilm para cada cubreobjetos. Retire el cubreobjetos del plato de 24 pocillos (en este punto, los cubreobjetos están al lado de la celda hacia arriba) y coloque el cubreobjetos hacia abajo sobre el tampón de hibridación. Hacer esto a 42 ° C o opcionalmente a 65 ° C durante 15 min. NOTA: Completar este paso a 65 ° C desnaturalizará los RNAs celulares; Esto puede mejorar la señal si el poliA está enmascarado por las interacciones con las proteínas. </li><li> Diluir la sonda Biotin-Oligo (dT) (100 ng / μl) en tampón de hibridación a una concentración de 2 ng / μl; 25 μL por cubreobjetos es suficiente. </li><li> Para cada cubreobjetos, pipetee 25 μL de tampón de hibridación que contiene Biotin-Oligo (dT) sobre el parafilm. Recoja el cubreobjetos con una pinza y toque suavemente el borde del cubreobjetos en un tejido de laboratorio para eliminar el excesoTampón de hibridación. Transferir el cubreobjetos al tampón de hibridación con Biotin-Oligo (dT); Recuerde mantener el lado de la celda hacia abajo. </li><li> Coloque los cubreobjetos en una caja de hibridación para limitar la evaporación. Incubar los cubreobjetos con Biotin-Oligo (dT) en tampón de hibridación durante 60 min a 42 ° C. </li><li> Colocar 2 x SSC en el horno de hibridación para permitir que se equilibre a 42 ° C. </li><li> Añadir ~ 500 μl de 2X SSC calentado a los pocillos en el plato de 24 pocillos y usar fórceps para transferir los cubreobjetos al pocillo. Incubar durante 10 min. </li><li> Repetir el paso de lavado anterior dos veces a 42 ° C y después dos veces a TA. </li><li> Complete los pasos 3.5-3.10, asegurándose de usar un fluorocromo de estreptavidina para detectar el Biotin-Oligo (dT) en lugar de un anticuerpo convencional. </li></ol> 5. Ensayo de ribopuromicilación para evaluar el estado translacional <ol><li> Las células U2OS de la placa en cubreobjetos, como se indica en el paso 1, pero sólo la placa un cubreobjetos por condición (en esteCaso, 3 cubreobjetos: no tratado, arsenito de sodio 100 μM y vinorelbina 150 μM) ( Figura 1 A). </li><li> Células de estrés utilizando el protocolo en el paso 2, completando los pasos 2.1-2.4. </li><li> 5 minutos antes de la fijación, añadir 2 μl de puromicina (stock: 1,25 mg / ml, diluir 2 μL en 500 μl para obtener una concentración final de puromicina de 5 μg / ml) y 2,9 μl de emetina (stock: 20 μg / ml; 2,9 μL a la misma solución que ya contiene la puromicina) a cada pocillo que contiene 0,5 ml. </li><li> Completar los pasos 3.1-3.10 como se indicó anteriormente, utilizando un anticuerpo anti-puromicina (dilución 1/1000) para detectar puromicina. Idealmente, use otros dos marcadores SG en los canales restantes. </li><li> Al cuantificar la señal de puromicina, tome todas las imágenes usando la misma exposición. Elija esta exposición utilizando la muestra más brillante (sin tensión) y obtenga una imagen lo más brillante posible sin saturación. NOTA: La intensidad de la señal fluorescente anti-puromicina represMientras que la puromicina sustituye a un aminoácido, se incorpora a la proteína naciente y hace cumplir la terminación prematura de la proteína. </li></ol> 6. Adquisición y análisis de imágenes <ol><li> Cuantificación de Gránulos de Estrés <ol><li> Para cuantificar SGs, adquiera de 3 a 5 imágenes con un total de&gt; 100 células por muestra utilizando un objetivo de 40X. Alternativamente, adquiera imágenes utilizando otros objetivos, pero asegúrese de que se cuenten&gt; 100 células por cubreobjetos y que la ampliación sea lo suficientemente grande para visualizar claramente los gránulos. Hacer esto dividiendo el cubreobjetos en cinco regiones aproximadamente iguales y seleccionando aleatoriamente un campo de cada región ( Figura 1B ); Las imágenes del mismo campo deben incluir todos los canales para evaluar la colocalización de los marcadores. </li><li> Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes, combine los canales. Algún software de la cámara hará automáticamente esto, mientras que otros requieren la fusión manual; Esto se puede hacer conImageJ abriendo todas las imágenes y seleccionando [Image | Color | Combinar canales]. </li><li> Contar manualmente el número total de células contando el número de núcleos, utilizando Hoechst como el marcador de núcleos. Contar manualmente el número de celdas que contienen más de dos SG por celda. NOTA: Por ejemplo, usando una imagen de tres canales combinada que muestra G3BP1 (verde), eIF4G (rojo) y Hoechst (azul), cuente los núcleos (o el número de celdas) usando el canal azul. A continuación, cuente las células SG-positivas como aquellas con dos o más focos amarillos por célula. Los gránulos aparecerán de color amarillo, como el verde de G3BP1 y el rojo de eIF4G aparecen en color amarillo si están colocalizados. </li><li> Determine el porcentaje de células que son SG positivo combinando los datos de las 3-5 regiones independientes y luego calcule: Número de SG positivo / número de núcleos) * 100 = porcentaje de células SG-positivas </li></ol></li><li> Evaluación de la Colocalización por Análisis de Análisis de Línea - Método Manual <ol><li> AbiertoImageJ. Descargalo de forma gratuita desde () </li><li> Abra el gestor de ROI: [Analyze | Herramientas | Gerente de ROI ...]. </li><li> Abra la imagen fusionada en ImageJ: [File | Abierto]. </li><li> Utilizando la herramienta de línea situada en la barra de herramientas ImageJ, añada una línea que pasa por un SG, asegurándose de incluir antes y después del SG. Agregue esta línea al gestor de ROI haciendo clic en [Agregar] en la ventana del gestor de ROI. </li><li> Dividir la imagen fusionada en canales separados para evaluar la localización de cada marcador en el gránulo: [Image | Color | Split Channel]; Esto dividirá la imagen fusionada en tres imágenes en blanco y negro. </li><li> En la imagen en blanco y negro, asegúrese de que la línea está seleccionada; La línea se selecciona si aparece en la imagen. Si no, en la ventana del administrador de ROI, haga clic en la línea en el panel; Esto resaltará la línea en azul en la ventana del gestor de ROI y hará que la línea sea visible en la imagen en blanco y negro. Si la línea todavía no aparece, asegúrese de que &quot;mostrar todo&quot; es chEcked en el gestor de ROI y luego haga clic en la línea en la imagen. </li><li> Analizar la intensidad de la línea: [Analizar | Perfil de trazado]; Esto mostrará la ventana &quot;Perfil de trazado&quot;, que traza la intensidad de la señal a través de la línea. </li><li> En la ventana &quot;Perfil de trazado&quot;, haga clic en [Lista], que abre una ventana que contiene los datos sin procesar del gráfico. Copie todos los datos de esta ventana y péguelos en un archivo de hoja de cálculo. Para ello, seleccione todos los datos de la ventana: [Editar | Seleccionar todo]. Copie la fecha: [Editar | Dupdo]. Abra un archivo de hoja de cálculo y pegue los datos: [Editar | Pegar]. </li><li> Complete los pasos 6.2.6 a 6.2.8 para cada canal por separado. Asegúrese de realizar un seguimiento del canal que se está evaluando. </li><li> En una hoja de cálculo, genere un gráfico de líneas de los resultados. Seleccione las columnas que incluyen datos pulsando [control] y haciendo clic en la letra en la parte superior de cada columna. A continuación, seleccione el gráfico de líneas: [Insertar | Gráfico de líneas]. </li><li> Repita este análisis para multLos gránulos de estrés a través de múltiples experimentos independientes. </li></ol></li><li> Evaluación de la colocalización por análisis de barrido de línea - Plugin de ImageJ <ol><li> Descargue e instale la herramienta de perfil RGB del sitio web de ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Cuando esté correctamente instalado, aparecerá un icono rojo, verde y azul (RGB) en la barra de herramientas. </li><li> Abra la imagen ( por ejemplo, Tiff, JPG) en ImageJ: [Archivo | Abierto]. </li><li> Haga clic en el icono RGB situado en la barra de herramientas de ImageJ. </li><li> Haga clic y arrastre para agregar una línea que se extienda a través de un SG, asegurándose de incluir regiones adyacentes; Una imagen del histograma aparecerá en una ventana emergente. </li><li> Guardar los datos como una imagen: [Archivo | Guardar como | Pelea]. Alternativamente, exporte y luego grafique los datos en otro programa gráfico usando el paso 6.2.8 desde arriba. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+mRNA+translation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li>
<li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNP+granules%3A+Assembly%2C+function%2C+and+connections+with+disease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+ternary+complex+%28eIF2-GTP-tRNA%28i%29%28Met%29%29-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li>
<li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+and+cell+signaling%3A+more+than+just+a+passing+phase%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li>
<li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26(2015).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li>
<li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%2C+P-bodies+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li>
<li>Aulas, A., Van de Velde,, C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS%3A+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?</a> Front Cell Neurosci. 9, 423(2015).</li>
<li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li>
<li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+protein+aggregation+run+amuck%3A+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li>
<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li>
<li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li>
<li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib%2C+a+multikinase+inhibitor%2C+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12(2010).</li>
<li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li>
<li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors%3A+role+of+reoxygenation%2C+free+radicals%2C+and+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li>
<li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li>
<li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li>
<li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li>
<li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li>
<li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li>
<li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li>
<li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+%28RPM%29+applied+to+inert+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li>
<li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li>
<li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li>
<li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li>
<li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li>
<li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+binding+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li>
<li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+%28TDP-43%29+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li>
<li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li>
<li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation%2Fdissolution+to+mTORC1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como evidenciado por estudios inmunohistológicos en múltiples enfermedades, el estrés crónico conduce a la formación de diferentes focos intracelulares. Por ejemplo, la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por agregados intracelulares de proteínas insolubles. La presencia de SG-proteínas asociadas en tales agregados es a menudo la base para concluir que tales focos son SGs. Una conclusión similar se deduce también cuando se observan focos citoplasmáticos con marcador positivo en células tratada...

Las células emplean muchos mecanismos para responder al estrés. Algunas respuestas se producen a nivel post-transcripcional e implican la regulación de la traducción y / o la estabilidad del mRNA 1 , 2 . La detención y degradación de la ARNm de mRNA modulada por estrés se asocian con la formación de focos celulares no membranosos específicos, siendo los más bien caracterizados los Stress Granules (SGs) 3 . Las SGs son focos citoplasmáticos que concentran mRNPs no traducientes en células detenidas en translación que responden al estrés ( por ejemplo, oxidación, choque térmico, inanición de nutrientes e infección viral) 4 . Además de no traducir mRNAs, SGs contienen factores de iniciación de la traducción, RNA-proteínas de unión, y varias proteínas de señalización [ 5] . SGs son biomarcadores de la traducción de proteínas inhibidas y el metabolismo del ARN alterado y se han relacionado con la supervivencia celular y la apoptosis, vía de señalizaciónS, y los procesos nucleares 5 . SGs son entidades dinámicas, y su formación está estrechamente conectado con el estado de la traducción celular [ 6] . A pesar de su aspecto aparentemente sólido, la mayoría de los componentes de la proteína SG transitan rápidamente dentro y fuera, con un tiempo de residencia de segundos. Mientras SGs persistir durante minutos a horas, la mayoría de sus componentes están en rápido flujo. La inhibición de la iniciación de la traducción y el consiguiente desmontaje de los polisomas de translación promueven la formación de SGs; Por lo tanto, SGs están en equilibrio con la traducción de polisomas. Este equilibrio polysome / SG es clave para distinguir los SGs de buena fe de otros focos inducidos por el estrés 6 , 7 . La detención de la iniciación de la traducción implica la conversión de complejos de preiniciación competentes para la traducción que contienen mRNA, factores de iniciación de la traducción (eIF) y subunidades ribosómicas 40S<html> O-llamados 48S complejos) en complejos traslacionalmente estancado (lo que se llama 48S * complejos) que pueden coalescer en SGs 4 , 6 . SGs son promovidos por detención traslacional en dos etapas diferentes antes de la formación del complejo 48S: interferencia con las funciones del complejo eIF4F de unión a la capa ( por ejemplo, dirigida a su subunidad eIF4A) o fosforilación de la subunidad α del factor de iniciación de la traducción eIF2, mediada por una O más de las cuatro quinasas eIF2. La presencia de complejos 48S bloqueados ( es decir subunidades ribosómicas 40S y factores de iniciación de la traducción seleccionados) es un sello distintivo de las SG 8 , 9 . Las SG se han relacionado con varios estados patológicos, como infecciones virales, neurodegeneración, autoinmunidad y cáncer 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Las formas mutadas de varios componentes de SG están asociadas con enfermedades neurodegenerativas ( por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica) en las que las neuronas presentan inclusiones patológicas intracelulares que pueden desempeñar papeles activos en la muerte neuronal 13 . Algunos virus secuestrar componentes SG para inhibir la formación de SG y para mejorar la replicación viral [ 14] . Estudios recientes también vinculan SGs al cáncer 15 ya la supervivencia de las células cancerígenas en tratamientos de quimioterapia y radioterapia 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Si bien estos hallazgos han estimulado un gran interés en la biología de SG, muchos de los informes publicados carecen de controles importantes para distinguir la formación de SGs de buena fe de otros focos inducidos por el estrés. Las SG se describieron inicialmente como focos citoplasmáticos no membranosos compuestos de proteínas de unión a mRNA seleccionadas (RBP), incluyendo el antígeno ntracelular de células T 1 (TIA-1) y la proteína de unión a PolyA (PABP); Factores de iniciación de la traducción; MARN poliadenilado; Y pequeñas subunidades ribosómicas 4 , 6 , 21 , 22 . Tradicionalmente, su composición ha sido determinada por técnicas como la inmunotinción y la expresión ectópica de las proteínas marcadas con fluorescencia 23 , 24 . Debido a su naturaleza altamente dinámica, la inmunolocalización de las proteínas SG y / o ARNm sigue siendo la metodología que define la detección de SGs 23 , 24 . Hasta la fecha, muchas RBP y otras proteínas (más de 120 proteínas distintas) se describen como SG componentes [ 11] . TantasLas proteínas G-localizadas cambian su localización tanto de una manera dependiente del estrés como de una manera independiente y pueden acumularse en otros compartimentos y focos intracelulares, es importante elegir marcadores SG correctos y emplear criterios funcionales para distinguir SG de otros tipos de estrés inducido Focos Bona fide SGs contienen mRNA, factores de iniciación de la traducción, y pequeñas subunidades ribosómicas y están en equilibrio dinámico con la traducción. Este simple flujo de trabajo está diseñado para determinar si los focos inducidos por el estrés son SGs de buena fe . Este flujo de trabajo incluye varios enfoques experimentales utilizando células U2OS, células comúnmente utilizadas para estudiar SGs. Estas células son ideales, ya que tienen un citoplasma grande, son relativamente plana, y se adhieren fuertemente a cubreobjetos de vidrio. Otros tipos de células se pueden utilizar para estudiar SGs, pero es importante tener en cuenta que las diferencias en el tiempo, la concentración de fármacos, y la abundancia de SG-nucleating proteínas pueden alterar la cinética y compoSión. Además, algunas células responden a la fijación de paraformaldehído formando vesículas superficiales de las células, dando entonces un aspecto rizado que causa la localización puntiforme de algunos marcadores SG; Sin un análisis cuidadoso, estos pueden ser clasificados erróneamente como SGs. Esto pone de relieve la necesidad de evaluar todos los criterios necesarios para identificar los focos inducidos por el estrés como SG de buena fe . Vinorelbina (VRB), un cáncer terapéutico que promueve SGs 20 , así como Sodium Arsenite (SA), un robusto y bien caracterizado SG inductor, se utilizan como las tensiones para los experimentos en este protocolo. Canonical SGs contienen múltiples marcadores SG (proteínas y mRNAs) que colocalize en focos citoplasmáticos. Este protocolo utiliza tanto la inmunofluorescencia como la hibridación in situ fluorescente (FISH) para detectar la localización de los marcadores de proteínas y el ARNm poliadenilado 22 , respectivamente. Brevemente, la inmunofluorescencia indirecta utiliza anticuerpos ( i.mi. Anticuerpos primarios) específicos para una proteína dada para detectarla dentro de la célula. Entonces, los anticuerpos secundarios (generalmente específicos de la especie) unidos a los fluorocromos reconocen el anticuerpo primario y revelan la localización de la proteína diana. La microscopía fluorescente se utiliza para detectar la señal localizada dentro de la célula. El uso de anticuerpos producidos en diferentes especies y su detección con anticuerpos secundarios de color diferente permite la detección de la colocalización de múltiples anticuerpos, lo que indica que sus objetivos de proteínas se encuentran en el mismo lugar [ 23] . Es importante seleccionar marcadores que han sido verificados para colocalizar en SGs de buena fe . FISH utiliza una sonda marcada que pares de bases a un ARN o secuencia de ADN específicos [ 25] . Para detectar ARNm, este protocolo utiliza una sonda de oligo (dT) 40 biotinilada que hibrida (o pares de bases) a la cola poliA de mRNA ( es decir, poliA FISH). La sonda biotinilada se detecta entonces utilizando estreptavidina conjugada con fluorescencia, ya que la estreptavidina tiene una alta afinidad por la biotina. Al evaluar SGs, es importante acoplar el poliA FISH con la inmunofluorescencia detectando un marcador SG, como en SGs de buena fe , las dos señales deben colocalize. Usando este protocolo, la colocalización se evalúa de múltiples maneras. En una imagen multicanal ( es decir, RGB: rojo, verde y azul), la colocalización alterará el color de la señal superpuesta ( p. Ej . Color rojo compartido y verde aparecen en color amarillo) 23 . Además, la colocalización se cuantifica gráficamente mediante análisis de barrido lineal, donde la intensidad de cada color se mide a través de una línea dada 8 , 20 . Este protocolo describe dos procedimientos de análisis de exploración de línea utilizando ImageJ 26 . Un procedimiento es manual y pasa por todo el proceso,El otro utiliza una macro, o un programa simple que automatiza los pasos manuales. Es importante pasar por el programa manual para entender el procedimiento macro. Las SG se forman en las celdas donde se reprime la traducción; Por lo tanto, las células con SGs deben mostrar niveles disminuidos de traducción global en comparación con las células no tratadas. Experimentalmente, se usa ribopuromicilación. Puromicina y emetina se añaden a las células durante un breve período de tiempo antes de la fijación, permitiendo que la puromicina se incorpore en polipéptidos que forman activamente, causando la terminación 27 , 28 . El tratamiento con emetina es necesario para evitar la reiniciación 29 . La puromicina puede entonces detectarse usando anticuerpos anti-puromicina, dando una instantánea de la traducción activa. Este método se utiliza porque es rápido, no requiere pre-hambre con un medio que carece de un aminoácido particular (y potencialmente el pretensado de las células), y revela laLocalización subcelular de la traducción de proteínas. Se han utilizado otros métodos, especialmente el uso de análogos de aminoácidos modificados, tales como el análogo de metionina L-azidohomoalaína (AHA), junto con la química &quot;click-it&quot; 30 , para mostrar que las células que contienen SG presentan una traducción mucho menor que las células vecinas 31 . Sin embargo, esta técnica requiere inanición de metionina seguido de marcaje por pulso durante 15-30 min. El hambre por metionina constituye un estrés adicional, mientras que el largo tiempo de etiquetado ( es decir, 15-30 minutos) da como resultado la medición de la traducción acumulativa en lugar de la continua y también permite que las proteínas recién sintetizadas se muevan desde su sitio de síntesis hasta su destino final dentro del celda. Por el contrario, la ribopuromicilación es mucho más rápida y es compatible con cualquier medio, tal como el medio libre de glucosa utilizado para inducir SG a través de la ingesta de glucosa. Los SGs canónicos están en equilibrio dinámicoCon traducción activa de polisomas. Esto puede evaluarse experimentalmente mediante el tratamiento de las muestras con los fármacos que estabilizan o desestabilizar polisomas, por lo tanto, el equilibrio entre la inclinación SGs y polisomas [ 23] . La cicloheximida (o emetina, que se comporta de manera similar) bloquea el alargamiento mediante la &quot;congelación&quot; de los ribosomas en el ARNm, disminuyendo así el grupo de mRNP no polisómicos disponibles capaces de formar SGs. Experimentalmente, esto puede ser utilizado de dos maneras: añadiendo cicloheximida (o emetina) antes del estrés para prevenir la formación de SG o añadiendo cicloheximida (o emetina) después de que se hayan formado los SG, incluso sin eliminar el agente tensor, causando el desmontaje SG, Los complejos de preinitiación se introducen lentamente en la fracción de polisoma. Por el contrario, la puromicina provoca la terminación prematura y promueve el desensamblaje del polisoma, aumentando el grupo de ARNm iniciadores capaces de ensamblarse en SGs. Experimentalmente, el tratamiento con puromicina aumenta el número de SG o disminuye el umbralD en la que se forman en respuesta al estrés graduado oa la dosis de fármaco. Cuando se evalúa el efecto de la puromicina, es importante usar un nivel sub-máximo del fármaco de interés, ya que se espera que la puromicina aumente el efecto del fármaco y aumente el porcentaje de células que presentan SGs - esto no puede ocurrir si el fármaco / Estrés provoca SGs en el 100% de las células inicialmente. Esto contrasta con el tratamiento con cicloheximida, que desensambla SGs y funciona mejor cuando ~ 95% de las células inicialmente muestran SGs de modo que se puede observar y cuantificar con precisión la mayor disminución posible. Este protocolo proporciona un marco para estudiar SGs en células de mamíferos. Los métodos incluyen: (1) tinción inmunofluorescente y análisis ImageJ para evaluar la colocalización de los marcadores clásicos SG asociados eIF4G, eIF3b, y Ras GTPasa-proteína activadora de la proteína de unión 1 (G3BP1) en putativo SGs; (2) hibridación in situ de fluorescencia de oligo (dT) (poliA FISH) para detectar ARNm poliadenilado; (3) tratamiento con cicloheximida y puromicina para determinar si los focos inducidos por el estrés están en equilibrio dinámico con polisomas; Y (4) ribopuromicilación para evaluar el estado de traslación de células que contienen SGs putativas. Juntos, estos ensayos pueden determinar si los focos inducidos por el estrés pueden clasificarse como SGs de buena fe .

<table><tbody><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; HTB-96 y comercio;</td><td>Comúnmente escrito "U2OS" Cultura a 37 &deg; C por debajo del 5% de CO2 en 10% FBS/DMEM</td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Contiene 4,5 g/L de glucosa, piruvato y fenol rojo Suplementado con 10% de FBS, 10 mM de HEPES y penicilina/steptomicina Precalentar la dilución de fármacos previos Suero</td></tr><tr><td>fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td><td>Se utiliza para complementar los medios</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>Se utiliza para complementar la</td></tr><tr><td>estreptomicina de penicilina</td> de los medios <td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>Se utiliza para complementar la</td></tr><tr><td>placa de 24 pocillos</td> de los medios <td>de comunicación Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Pañuelos de papel de laboratorio (toallitas kimtechSCIENCE</td><td></td> <td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos para el crecimiento</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>Esterilizado en autoclave antes de su uso Mantener estéril en la campana de cultivo</td></tr><tr><td>de tejidos (meta)arsenito de sodio &ge; 90% (SA)</td><td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>Disolver en agua a una concentración de 1 M, luego diluir a 100 &micro; M como material de trabajo</td></tr><tr><td>Vinorelbine (VRB)</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td><td>Disolver en agua hasta 10 mM</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>Se utiliza para evaluar el nivel de traslación (ribopuromicilación) -Se utiliza para evaluar la conexión de SG con la traducción activa Diluir en agua hasta 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Clorhidrato de emetina hidrato Sigma</td><td></td><td>E2375</td><td>Se utiliza en combinación con puromicina para evaluar el nivel general de traducción Se utiliza para evaluar la conexión de la SG con la traducción activa -Diluido en agua hasta 10 mg/mL</td></tr><tr><td>de cicloheximida (CHX)</td><td>Sigma</td><td>C4859</td><td>Se utiliza para evaluar la conexión de la SG con la traducción activa Diluir en agua hasta 10 mg/mL</td></tr><tr><td>de solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>Tampón de lavado para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Grado de reactivo de paraformaldehído, cristalino (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Prepare una solución al 4% en PBS caliente en la campana extractora, revuelva hasta que se disuelva Las alícuotas se pueden almacenar a -20 & grados; C durante varios meses Peligroso, uso ventilación Desechar en residuos especiales</td></tr><tr><td>Metanol, ACS</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Preenfriar a -20 & deg; C antes de usar Deseche en los residuos especiales</td></tr><tr><td>Suero de caballo normal (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td><td>Diluir al 5% en PBS Agregue azida de sodio para almacenar a 4 & grados; C Solución de bloqueo para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Etanol, puro, 200 pruebas (100%),USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>Diluir al 70% con agua</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus de</td><td>Fisherbrand Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti G3BP1 para ratones (TT-Y)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>Almacenar en 4 & grados; C 1/100 dilución</td></tr> conejo <tr><td>anti anti eIF4G anticuerpo (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Almacenar en 4 & deg; C 1/250 dilución</td></tr><tr><td>cabra anti eIF3&eta; (N-20) anticuerpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&eta; también se conoce como eIF3b Almacene en 4 & deg; C dilución 1/250</td></tr><tr><td>anti puromicina 12D10 anticuerpo</td><td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>Tienda a 4 & grados; C dilución 1/1.000</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Reconstituir en agua por fabricante' s instrucciones y luego almacene a 4 &deg; C dilución 1/250</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>Reconstituir en agua según el fabricante' s instrucciones luego almacene a 4 & deg; C 1/2.500 dilución</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>Reconstituir en agua según el fabricante' s instrucciones luego almacene a 4 & deg; C dilución 1/250</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 solución</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Incubar con anticuerpos secundarios Solución madre 0,5 mg/mL en dH20, proteger de la luz -Almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Cy3 Estreptavidina</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-084</td><td>Reconstituir en agua por fabricante' s instrucciones, luego almacene a 4 &deg; C 1/250 dilución</td></tr><tr><td>oligo-(dT)40x sonda biotinilada</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>/</td><td>Reconstituir en agua a 100 ng/mL, alícuota y almacenar a -20 &deg; C Diluir en tampón de hibridación 1/50 antes de usar </td></tr><tr><td>Caja de hibridación</td> de pedido personalizado<td>/</td><td>/Haga</td> <td>una cámara de humedad con cualquier caja de portaobjetos de almacenamiento agregando papel humidificado en la parte inferior - precalentar la caja antes de su uso</td></tr><tr><td>20x Tampón SSC</td><td>Thermo fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>Diluir a 2x SSC usando agua libre de RNasa (tratada con DEP) Almacenar en RT Tampón de lavado para FISH</td></tr><tr><td>Tampón de hibridación PerfectHybPlus Sigma</td><td></td><td>H7033-50ml</td><td>Tampón de incubación de bloques y sondas para</td></tr><tr><td>medios de montaje de portaobjetos</td> FISH <td>hecho en casa</td><td>/</td><td>Mezcla 5 g de " soluble en frío" poli(alcohol vinílico) en 20 mL de PBS Mezclar por sonicación, seguido de agitación O/N a RT Añadir 5 mL de glicerol y 0,2 mL de azida sódica al 20 %, y agitar durante 16 h a RT Centrifugación a 20.000 g durante 20 min, desechar el líquido viscoso alícuota de pellets grande , Almacenamiento a largo plazo a -20 ° C, 1 semana a 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Poli(alcohol vinílico)</td><td>Sigma</td><td>P-8136-250G</td><td>Reactivo para hacer vinol</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-100ML</td><td>Reactivo para hacer</td></tr><tr><td>azida sódica de</td> vinol <td>Fisher Scientific</td><td>S2002-5G</td><td>Agente conservante para la solución de bloqueo y vinol Hacer una dilución del 20% en agua</td></tr></tbody></table>

métodos para clasificar los focos citoplasmáticos como gránulos de estrés de mamíferos

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Las células son a menudo desafiadas por cambios ambientales repentinos. Los Gránulos de Estrés (SG), complejos de ribonucleoproteínas citoplasmáticas que se forman en células expuestas a condiciones de estrés, están implicados en diversos aspectos del metabolismo celular y la supervivencia. Las SG modulan las vías de señalización celular, la expresión génica post-transcripcional y los programas de respuesta al estrés. La formación de estos gránulos que contienen mRNA está directamente conectada a la traducción celular. SG se desencadena por la iniciación de la traducción inhibida, y el desmontaje SG se promueve por activación de la traducción o por elongación de la traducción inhibida. Esta relación se pone más de relieve por la composición SG. Los componentes de núcleo SG son complejos de preiniciación de traducción estancados, mRNA, y proteínas RNA-binding (RBPs) seleccionadas. El propósito de la asamblea de SG es conservar la energía celular secuestrando los mRNAs de mantenimiento doméstico traducionalmente estancados, permitiendo la traducción mejorada de proteínas que responden al estrés. En additiSobre los constituyentes del núcleo, tales como complejos de preiniciación de traducción estancada, SGs contienen una plétora de otras proteínas y moléculas de señalización. Los defectos en la formación de SG pueden alterar la adaptación celular al estrés y, por lo tanto, pueden favorecer la muerte celular. Las SG y los gránulos similares que contienen ARN se han ligado a una serie de enfermedades humanas, incluyendo trastornos neurodegenerativos y cáncer, dando lugar al reciente interés en clasificar y definir subtipos de gránulos de ARN. Este protocolo describe ensayos para caracterizar y cuantificar SGs de mamíferos.

Los focos inducidos por el estrés no son necesariamente SGs. Las SG se clasifican como focos citoplásmicos que contienen mRNAs, factores de iniciación de la traducción y proteínas de unión al ARN y están en equilibrio con la traducción activa. El protocolo anterior puede usarse como una plantilla para caracterizar si un esfuerzo dado induce SGs de buena fe . Las SG se colocalizan con otros marcadores SG conocidos, inc...

Los Gránulos de Estrés (SG) son estructuras citoplasmáticas no membranosas que se forman en células expuestas a una variedad de tensiones. SGs contienen mRNAs, proteínas de unión a ARN, pequeñas subunidades ribosómicas, factores relacionados con la traducción, y diversas proteínas de señalización celular. Este protocolo describe un flujo de trabajo que utiliza varios enfoques experimentales para detectar, caracterizar y cuantificar SGs de buena fe .

Métodos para clasificar los focos citoplasmáticos como gránulos de estrés de mamíferos

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

El objetivo general de este protocolo es determinar si los focos identificados dentro del citoplasma son gránulos de estrés auténticos, que son gránulos de ARN que desempeñan funciones importantes en la fisiología celular. La principal ventaja de este protocolo es que evalúa todas las propiedades fundamentales de los gránulos de estrés. Aunque este protocolo se presenta para células de osteosarcoma humano U-2 OS, también puede aplicarse a otros tipos de líneas celulares y células primarias.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no todos los focos inducidos por estrés son granulos de estrés. Nuestro flujo de trabajo comprende todos los experimentos necesarios para distinguirlos. Yo demostraré este procedimiento junto con Anais Aulus.Somos investigadores postdoctorales en el laboratorio de Paul Anderson y Pavel Ivanov. Para comenzar, siembre las células en cubreobjetos colocados en placas de 24 pocillos según se describe en el protocolo escrito. Después de una incubación nocturna, aspire el medio de cultivo de los pocillos B1 a B4 y de C1 a C4 de la placa de 24 pocillos.Añada 500 microlitros del medio suplementado con 100 micromolares de arsenito de sodio a los pocillos B1 y B2, luego añada 500 microlitros del medio suplementado con 50 micromolares de arsenito de sodio a los pocillos B3 y B4. A continuación, añada 500 microlitros del medio que contiene 150 micromolares de vinorelbina a los pocillos C1 y C2. Finalmente, añada 500 microlitros del medio suplementado con 125 micromolares de vinorelbina a los pocillos C3 y C4. Incube la placa durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Después de 30 minutos de incubación, añada a las células en la columna dos cinco microlitros de una solución de cicloheximida de un miligramo por mililitro y a las células en la columna cuatro, dos microlitros de puromicina de 1,25 miligramos por mililitro. Agite suavemente la placa para mezclar las soluciones y regrese la placa al incubador durante 30 minutos adicionales de incubación.Para fijar las células, retire el medio de los pocillos y lave las células con aproximadamente 250 microlitros de PBS. Añada aproximadamente 250 microlitros de una solución tamponada de paraformaldehído al 4% para fijar las células, asegurándose de que la parte superior del cubreobjetos quede completamente cubierta. A continuación, deje la placa en un agitador horizontal a temperatura ambiente durante 15 minutos.A continuación, retire y deseche adecuadamente el paraformaldehído. Añada aproximadamente 250 microlitros de metanol frío con hielo para permeabilizar y aplanar las células. Incube la placa durante cinco minutos adicionales a temperatura ambiente en un agitador rotatorio.Una vez completada la permeabilización, deseche el metanol y bloquee las células aplicando aproximadamente 250 microlitros de un tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, prepare la solución de anticuerpo primario añadiendo 12 microlitros de los anticuerpos contra G3BP1, eIF4G y eIF3B a tres mililitros de tampón de bloqueo. Añada 250 microlitros de la solución de anticuerpos a cada pocillo de la placa de 24 pocillos.Incube la placa en un agitador durante al menos una hora a temperatura ambiente. Después de una hora de incubación, retire la solución de anticuerpo y lave las células con aproximadamente 250 microlitros de PBS durante cinco minutos. A continuación, agregue 12 microlitros de anticuerpos Anti-Mouse Cy2, Anti-Rabbit Cy3 y Anti-Goat Cy5 junto con tres microlitros de colorante hooks a tres mililitros de tampón de bloqueo para preparar la solución de anticuerpo secundario.Añada 250 microlitros de la solución de anticuerpo secundario a cada pocillo y cubra la placa para proteger las muestras de la luz. Incube la placa en un agitador a temperatura ambiente durante una hora. Una vez finalizada la incubación, retire la solución de anticuerpo y lave las células con PBS durante cinco minutos.Caliente el medio de montaje en un bloque térmico a 37 grados Celsius durante 10 minutos para reducir su viscosidad. Luego, utilizando una punta de pipeta de 200 microlitros previamente cortada, coloque 25 microlitros del medio de montaje sobre un portaobjetos etiquetado. Con pinzas finas, transfiera la cubreobjetos desde el pocillo al portaobjetos, invirtiendo su posición de modo que las células queden orientadas hacia el medio de montaje.Utilice una punta P200 limpia para presionar la laminilla hacia abajo. Una vez que todas las laminillas estén montadas, retire el exceso de medio de montaje presionando firmemente un papel de laboratorio contra el portaobjetos. Posteriormente, enjuague el portaobjetos con agua.Y séquelo inmediatamente con papel de laboratorio una vez más. Permeabilice las células prefijadas incubándolas con 250 microlitros de metanol frío a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, agregue aproximadamente 250 microlitros de etanol al 70 % a los pocillos vacíos de la placa y selle la placa con parafilm para evitar la evaporación.Incube la placa a cuatro grados Celsius durante la noche. Después de la incubación nocturna, retire el etanol y rehidrate las células añadiendo 500 microlitros de 2XSSC. Incube las cubreobjetos durante cinco minutos en un agitador a temperatura ambiente.Luego, deseche la solución y agregue 500 microlitros de SSC una vez más. Incube la placa durante cinco minutos adicionales con agitación suave. A continuación, coloque una capa de parafilm en la parte inferior de un horno de hibridación y agregue 25 microlitros de un tampón de hibridación encima.Transfiera el cubreobjetos desde la placa de 24 pocillos, invirtiendo la parte superior para que las células queden frente al tampón de hibridación. Incube los cubreobjetos a 42 grados Celsius durante 15 minutos. Pipetee 25 microlitros de una solución de oligo dT biotinilado sobre el parafilm dentro del horno de hibridación.Luego, utilizando pinzas, tome la laminilla y seque su borde contra un papel de laboratorio para eliminar el exceso de tampón de hibridación. Transfiera la laminilla a la solución de oligo dT biotinilado, asegurándose de que las células queden mirando hacia abajo, e incube a 42 grados Celsius durante 60 minutos. Una vez finalizada la hibridación, agregue aproximadamente 500 microlitros de SSC 2X precalentado a los pocillos de la placa de 24 pocillos.Luego, utilizando pinzas, transfiera la laminilla a la cavidad e incube a 42 grados Celsius durante 10 minutos. Después de teñir adicionalmente las células con la solución de anticuerpos, observe las muestras utilizando un microscopio de fluorescencia. A continuación se presentan imágenes de células U-2 OS no tratadas que no contienen gránulos ni focos teñidos con los marcadores de gránulos de estrés G3BP1, eIF4G y eIF3B.En células U-2 OS tratadas con arsenito de sodio o vinorelbina, se indujo la formación de focos citoplasmáticos que contienen G3BP1, eIF4G y eIF3B. La co-localización de estos marcadores se confirmó mediante análisis de escaneo lineal realizado para cada canal con aumento de magnificación, seguido de la superposición de las gráficas obtenidas. Además, los focos citoplasmáticos identificados en las células tratadas contenían ARNm, como se observó mediante hibridación in situ con sonda de poli A (poly A FISH).La señal de oligo dT co-localizó con la señal de G3BP1, confirmando la identificación de los gránulos de estrés. Una vez dominado, todo este procedimiento puede realizarse en tres días si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar inmunofluorescencia e hibridación fluorescente.Pasos que son fundamentales para la caracterización e identificación correctas de los gránulos de estrés. No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal (PPE) y una ventilación adecuada, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Vonaesch, P. et. al., Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras un desafío bacteriano en células de mamíferos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra la infección de las células epiteliales con la bacteria patógena Shigella flexneri y la respuesta celular del huésped resultante. Las proteínas efectoras bacterianas interrumpen la traducción del huésped, desencadenando la formación de orgánulos sin membrana llamados gránulos de estrés, que reflejan la...

Formación de gránulos de estrés durante la infección por Shigella de células epiteliales cancerosas

Este video muestra un ensayo para caracterizar y cuantificar gránulos de estrés en mamíferos, que consisten en ARNm, proteínas de unión a ARN (RBP) y varias otras proteínas.

Un ensayo de inmunofluorescencia para caracterizar y cuantificar gránulos de estrés en mamíferos

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

Gránulos de estrés (SGS) son gránulos de ARN citoplásmicos que contienen partículas estancadas ribonucleoprotein (RNPs), y importante en la respuesta celular a varios tipos de estrés. Dinámica de SGS puede seguirse en células vivas mediante la visualización de la localización de un componente de etiquetado de SGS en células primarias transfectadas después de estrés.

Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

El objetivo de este protocolo era desarrollar un método que permita a los análisis de genómica funcional de la secreción de mastocitos. El protocolo se basa en la evaluación cuantitativa de la liberación de un gen indicador fluorescente cotrasfected con el gen de interés y análisis en tiempo real de la morfología de los gránulos de secreción.

Investigando mastocitos secretora gránulos; de Biosíntesis de la exocitosis

La amebas social Dictyostelium discoideum se ha establecido recientemente como un sistema para estudiar el mal plegamiento de proteínas y la proteostasis. Aquí, describimos una nueva metodología basada en imágenes para estudiar la agregación de proteínas inducida por la temperatura y la respuesta al estrés celular en D. discoideum.

Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso de imágenes de células vivas con temperatura controlada

Describimos un método para el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación de gránulos de estrés en células de mamíferos después de que las células son desafiadas con bacterias y una serie de diferentes tensiones. Este protocolo puede aplicarse para investigar la respuesta de los gránulos de estrés celular en una amplia gama de interacciones huésped-bacteriana.

Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras el desafío bacteriano de las células de mamíferos

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células de mástil peritoneales murinas. También describimos dos protocolos para su caracterización funcional: una proyección de imagen fluorescente de la concentración de Ca libre2 + intracelular y una prueba de degranulación basado en la cuantificación colorimétrica de la β-hexosaminidasa lanzado.

Aislamiento de mastocitos de peritoneo derivado y su caracterización funcional con Ca2 +-proyección de imagen y pruebas de degranulación

Presentamos un flujo de trabajo de libre disposición construido para la exploración rápida y el análisis preciso de cuerpos celulares en compartimentos celulares específicos en imágenes de microscopía de fluorescencia. Este flujo de trabajo fácil de usar está diseñado en el software de código abierto Icy y también utiliza funcionalidades ImageJ. La canalización es asequible sin conocimientos en el análisis de imágenes.

Analizador de Subestructuras: Un flujo de trabajo amigable para el usuario para la exploración rápida y el análisis preciso de los cuerpos celulares en imágenes de microscopía de fluorescencia

Aquí, caracterizamos las respuestas de estrés proteotóxico celular en el nematodo C. elegans midiendo la activación de los reporteros transcripcionales fluorescentes y diciendo sensibilidad al estrés fisiológico.

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

En este trabajo se describe un protocolo para la cuantificación de modificaciones globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral aislada. El trabajo también contiene el protocolo de aislamiento de microglía que se utilizó para la recolección de datos.

Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

Aprende a identificar gránulos de estrés en células U-2 OS mediante inmunofluorescencia e hibridación in situ. Este protocolo validado permite distinguir verdaderos gránulos de otros focos citoplasmáticos en estudios de biología celular.

Métodos para clasificar los focos citoplasmáticos como gránulos de estrés de mamíferos

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