Name: Fraccionamiento de Membranas Cerebrales: Un Ex Vivo Enfoque para evaluar la localización de proteínas subsinápticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende el método de fraccionamiento de membranas cerebrales para estudiar la localización de proteínas subsinápticas en cerebro de ratón. Esta técnica permite aislar compartimentos pre, post y extrasinápticos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo contó con el apoyo del Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 y PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats ), Y FC pertenecen al grupo de investigación acreditado &quot;Neurofarmacología y Dolor&quot; (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251), y el Grupo de Investigación acreditado Neurofarmacología y Dolor (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . El trabajo también contó con el apoyo del Programa de Visitantes Especiales-Ciência sem Fronteiras de CAPES (Brasil) a FC

Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales (CEEA) de la Universidad de Barcelona, ​​de acuerdo con las directrices descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 11 y siguiendo la ley 86/609 / CCE, FELASA y ARRIVE. Por lo tanto, los ratones se alojan en jaulas estándar, con acceso ad libitum a alimentos y agua, y se mantienen en condiciones estándar controladas (12 horas de ciclo oscuro / ligero a partir de las 7:30 AM, 22ºC y 66% de humedad). 1. Obtención de sinaptosomas cerebrales de ratón utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa Nota: Este método se informó previamente 10 . <ol><li> Preparar un nuevo tampón de aislamiento (IB), pH 7,4; Sacarosa 2 M; Sacarosa 1 M / CaCl _ { 2 } 0,1 mM; Y CaCl _ { 2 } 0,1 mM (véase la Tabla 1 ). Enfriar las soluciones sobre hielo. </li><li> SaCrifice cinco ratones por dislocación cervical. Decapitar y eliminar rápidamente el cerebro de cada animal. Diseccionar la región cerebral de interés (es decir, el hipocampo, 0,25-0,35 g de tejido fresco) y colocarlo en un tubo de vidrio Potter-Elvehjem de 5 mL sobre hielo con 1 mL de IB. </li><li> Homogeneizar el tejido usando un agitador homogeneizante (10 golpes a 700-900 rotaciones por minuto), preferentemente en un baño de hielo para evitar el calentamiento de la muestra. </li><li> Colocar el tejido homogeneizado (1 ml) en un tubo de 15 ml que contiene 6 ml de sacarosa 2 M y 2,5 ml de CaCl2 0,1 mM a 4 ° C. Mezcle lentamente invirtiendo el tubo. Nota: La adición de calcio es esencial para mantener las interacciones adhesivas entre los organelos y así preservar la estructura de las diferentes &quot;densidades&quot;. </li><li> Colocar la solución en un tubo de centrífuga de 12 ml y añadir lentamente 2,5 ml de sacarosa 1 M / CaCl2 0,1 mM en la parte superior de cada tubo para formar el gradiente de sacarosa. Nota: etiquetar la posición oF la interfaz de gradiente en el tubo de centrífuga utilizando un marcador permanente. </li><li> Pesar y equilibrar los tubos de centrífuga con solución IB dentro de sus soportes de acero correspondientes y con sus tapas de cierre. </li><li> Centrifugar los tubos durante 3 h a 100.000 x gy 4 ° C usando una centrífuga de rotor de cubo oscilante. Llenar completamente el rotor con todos los soportes de acero (incluso vacío, si es necesario). </li><li> Deseche la capa superior que contiene mielina. Con una pipeta Pasteur, recoja el anillo blanco entre la interfase de sacarosa 1,25-M y 1-M correspondiente a la fracción de sinaptosomas. </li><li> Diluir los sinaptosomas con 9X su volumen utilizando IB en un tubo de centrífuga. </li><li> Pesar y equilibrar los tubos de centrífuga con solución IB dentro de sus soportes de acero correspondientes y con sus tapas de cierre. </li><li> Centrifugar los tubos durante 30 min a 15.000 x g y 4 ° C utilizando una centrífuga de rotor de cuchara oscilante. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspenderE pellet con 1,1 ml de solución IB. Recoger 100 μL de esta solución sinaptosomal y centrifugar durante 5 min a 11.000 x g y 4 ºC. </li><li> Resuspender el sedimento sinaptosomal en dodecil sulfato sódico al 5% (SDS) y almacenar esta muestra a -20 ºC. Nota: Esta muestra corresponderá a la fracción sinaptosómica total para un análisis de Western blot posterior. La fracción sinaptosomal restante (~ 1 ml) puede ser congelada a -20 ºC hasta su uso o procesada para el posterior fraccionamiento subsináptico. Los sinaptosomas o sinapsis purificadas representan entre 1 y 2% del volumen total del hipocampo 12 . </li></ol> 2. Pre-, Post- y Extrasynaptic-aislamiento <ol><li> Preparar 2x tampón de solubilización fresco, pH 6,0; 1x tampón de solubilización, pH 6,0; Tampón de solubilización, pH 8,0; Y CaCl _ { 2 } 0,1 mM (véase la Tabla 1 ). Enfriar las soluciones sobre hielo. Nota: El pH de estas soluciones debe ser accuratelY ajustado para lograr un buen fraccionamiento subsináptico. </li><li> Se diluye lentamente la fracción sinaptosomática resuspendida de 1 ml (véase el paso 1.12) con 5 ml de CaCl2 0,1 mM. </li><li> Añadir el mismo volumen (5 ml) de tampón de solubilización 2x ​​enfriado con hielo, pH 6,0, e incubar durante 50 min en hielo bajo alta agitación en un vaso de precipitados sobre hielo. Nota: Mientras que el 1% de Triton X-100 a pH 6.0 solubiliza todas las proteínas de la membrana plasmática, preserva las proteínas dentro de los contactos sinápticos o uniones ( es decir, estructuras pre y postsinápticas) 4 . </li><li> Coloque la solución en un tubo de centrifugación. Pesar y equilibrar los tubos con volúmenes equivalentes de CaCl2 0,1 mM y solución tampón de solubilización 2x, pH 6,0, dentro de sus correspondientes soportes de acero y con sus tapas de cierre. </li><li> Centrifugar los tubos durante 30 min a 40.000 x g y 4 ° C utilizando una centrífuga de rotor de cuchara oscilante. El sobrenadante resultante representa la fracción extrasináptica,Y el gránulo corresponde a las uniones sinápticas ( es decir, fracciones pre y postsinápticas). </li><li> Se concentra el sobrenadante que contiene la fracción extrasináptica hasta un volumen final de 200 μL utilizando un tubo de filtro de 15 ml de 10 K centrifugado a 4.000 xg y 4 ºC. </li><li> Se precipita la fracción extrasináptica concentrada resultante (200 μl) con 5 volúmenes (1 ml) de acetona pre-enfriada (-20 ° C) durante la noche a -20 ° C. </li><li> Al día siguiente, centrifugar la fracción extrasináptica durante 30 min a 18.000 x gy -15 ° C. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante de acetona y secar el gránulo para eliminar cualquier traza de acetona. </li><li> Finalmente, resuspenda el sedimento que contiene las proteínas extrasinápticas con 200 μl de SDS al 5%. Sonicate el pellet, si es necesario. </li><li> Sin interrumpirla, lavar cuidadosamente el gránulo que contiene las fracciones pre y postsinápticas con 2 mL de tampón de solubilización 1x, pH 6,0. Deseche el búfer. </li><li> ResuspenderEl gránulo con 10 ml de tampón de solubilización 1x, pH 8,0, usando una pipeta Pasteur de vidrio. Nota: Mientras que el 1% de Triton X-100 a pH 8.0 solubiliza la especialización presináptica, preserva la densidad postsináptica insoluble 4 . </li><li> Incubar la suspensión durante 50 minutos sobre hielo bajo alta agitación en un vaso de precipitados sobre hielo. </li><li> Coloque la solución en un tubo de centrifugación. Pesar y equilibrar los tubos con 1x solución tampón de solubilización, pH 8,0, dentro de sus correspondientes soportes de acero y con sus tapas de cierre. </li><li> Centrifugar los tubos durante 30 min a 40.000 x g y 4 ° C utilizando una centrífuga de rotor de cuchara oscilante; El sobrenadante resultante corresponde a la fracción presináptica y el precipitado a la fracción postsináptica. </li><li> Procesar el sobrenadante que contiene la fracción presináptica, como se describe en los pasos 2.6-2.9. </li><li> Resuspender el sedimento que contiene la fracción postsináptica con 200 μl de SDS al 5%. Sonicate el pellet, iF necesario. </li></ol> 3. Analizar las muestras por inmunoblot para validar el fraccionamiento de membrana <ol><li> Determine la cantidad de proteína en cada fracción ( es decir, las fracciones total, extra, pre y post-sináptica) usando el ensayo de proteína de ácido bicinconínico. </li><li> Tomar 20 μg de proteína de cada fracción y diluirla hasta un volumen final de 50 μL en tampón de muestra de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Hervir durante 5 min a 100 ºC. </li><li> Separar las proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE al 10%, con un gel concentrador al 4% en condiciones reductoras. Electrofóresis a voltaje constante de 80 V hasta que el colorante entre en el gel inferior y luego aumente el voltaje a 120 V. </li><li> Transferir las proteínas a una membrana de PVDF y bloquear con solución de bloqueo IB durante 45 min a temperatura ambiente bajo agitación continua. </li><li> Incubar la membrana durante la noche a 4 ºC con el anticuerpo primario indicado ( es decir, anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-sinaptofisina, o anti-GPR37) diluida en solución de bloqueo IB bajo agitación continua. </li><li> Lavar la membrana tres veces (10 min cada una) con solución de lavado IB para eliminar el anticuerpo primario no unido. </li><li> Incubar con el anticuerpo secundario indicado durante 90 minutos en condiciones de oscuridad a temperatura ambiente bajo agitación continua. </li><li> Lavar la membrana tres veces (10 min cada una) con solución de lavado IB para eliminar el anticuerpo secundario no unido. </li><li> Incubar la membrana con sustrato quimioluminiscente (preparar la mezcla en condiciones oscuras y siguiendo la proporción 1: 1 de la solución A y B proporcionada por el fabricante). </li><li> Analizar la membrana en un dispositivo de detección quimioluminiscente. </li></ol>

<ol><li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="https://archive.org/details/textbookofphysio1897fost">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).</li>
<li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+fine+structure+of+the+nervous+system%22">The fine structure of the nervous system</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22357909">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li>
<li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presynaptic+particle+web%3A+ultrastructure%2C+composition%2C+dissolution%2C+and+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li>
<li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li>
<li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+adenosine+A%281%29+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li>
<li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li>
<li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1%2C+P2X2%2F3%2C+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1%2C+P2Y2%2C+and%2For+P2Y4+Receptors+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li>
<li>Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits%3A+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li>
<li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+parkinson%27s+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus%3A+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li>
<li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+Report%3A+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li>
<li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%25+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart%3A+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li>
<li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li>
<li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li>
<li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li>
<li>Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li>
<li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li>
<li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pael+receptor%2C+endoplasmic+reticulum+stress%2C+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9(2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado aquí constituye una poderosa herramienta bioquímica para el estudio de la distribución subsináptica de proteínas específicas dentro de cualquier región del cerebro. Sin embargo, existen algunos inconvenientes inherentes a la técnica que merecen ser destacados aquí. Por ejemplo, una de las principales limitaciones es la cantidad relativamente grande de tejido necesaria para purificar una cantidad razonable de proteína con el fin de realizar el análisis de inmunotransferencia de todas las fracciones...

La transmisión sináptica se basa en la integridad física de la sinapsis, concepto que fue concebido ya en 1897 por Foster y Sherrington 1 . Por lo tanto, la comprensión de la distribución de componentes clave de neurotransmisión ( por ejemplo, canales iónicos, receptores, etc. ) es esencial para elucidar la función sináptica, tanto en condiciones normales como patológicas. La microscopía electrónica (EM) ha contribuido enormemente a la noción ultraestructural actual de las sinapsis prototípicas del sistema nervioso central (SNC). De esta manera, EM ha establecido finamente las diferencias entre densidades pre y postsinápticas, que están separadas por una hendidura de una distancia bastante uniforme (~ 25 nm) 2 . Curiosamente, el aparato postsináptico exhibe un espesamiento denso de electrones relativamente continuo por debajo de su membrana plasmática, la denominada densidad postsináptica, o PSD2. Por el contrario, en el aparato presináptico,La red cytomatrix discontinua se dispone justo debajo de la membrana plasmática, que es esencial para la alineación y acoplamiento de las vesículas sinápticas a la zona activa 3 de la membrana plasmática. Por lo tanto, EM constituye el método experimental dorado para examinar la distribución de proteínas dentro de las sinapsis estructuralmente preservadas del SNC. Sin embargo, la información proporcionada por las micrografías electrónicas es estática. De hecho, las evidencias acumuladas muestran que las sinapsis in vivo son extremadamente dinámicas, experimentando cambios estructurales dramáticos tras la transmisión sináptica sostenida. Además, la morfología y composición de las sinapsis puede cambiar a lo largo de diferentes regiones del SNC y al desarrollo, maduración, envejecimiento y el desarrollo de condiciones neuropatológicas. En general, un protocolo centrado en el aislamiento de proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos en condiciones fisiológicas representa una herramienta valiosa para un estudio más completo del funcionamiento sináptico. <p cAquí, describimos este tipo de enfoque experimental complementario, que permite el enriquecimiento bioquímico preparativo de los diferentes compartimentos de la membrana sináptica, a saber, los dominios de membrana extra, pre y postsináptica. Este método de fraccionamiento de membrana, descrito por primera vez por Philips et al . (2001) 4 , se basa en un cambio de pH que debilita las interacciones adhesivas que ocurren dentro del aparato pre y postsináptico. En primer lugar, utilizando detergentes suaves a pH 6,0, es posible discernir la unión adherente que sostiene el aparato pre y postsináptico y que se mantiene desde el dominio de la membrana extrasináptica, que se solubiliza y por lo tanto se puede extraer de los contactos sinápticos. Posteriormente, elevar el pH de 6,0 a 8,0 en presencia de detergentes suaves debilita la resistencia de la unión de adherentes que mantiene la zona presináptica activa estrechamente unida a la densidad postsináptica. Por lo tanto, el compartimiento presináptico es tanLubilizado y se puede separar de la densidad postsináptica, que se conserva en su mayor parte porque la concentración de detergente utilizado no favorece su solubilización 4 . Curiosamente, la eficiencia de fraccionamiento, eventualmente superior al 90%, puede ser confirmada por diferentes marcadores subsinápticos: i ) la proteína 25 asociada sinaptosomal (SNAP-25), de la zona activa presináptica; Ii ) sinaptofisina, de la fracción extrasináptica ( es decir, fuera de la zona activa e incluyendo microsomas); Y iii ) proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95), a partir de la densidad postsináptica. En particular, este método de fraccionamiento de membrana cerebral se ha utilizado con éxito. En consecuencia, se ha podido determinar con precisión la localización subsináptica de diferentes receptores, tales como los receptores 5 de ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), el receptor A1 de adenosina (A 1 R) 6 ,Receptor A 2A de adenosina (A 2A R) 7 , receptores P2 de trifosfato de adenosina (ATP) 8 , subunidades nicotínicas de receptor de acetilcolina 9 y receptor GPR37 asociado con la enfermedad de Parkinson 10 . Sin embargo, una serie de limitaciones pueden impedir la evaluación adecuada de la distribución sináptica de una proteína neuronal particular. Por lo tanto, en este procedimiento, no sólo describimos completamente el protocolo completo, sino que también destacamos algunos puntos críticos a considerar, como la cantidad bastante grande de tejido necesario, el bajo rendimiento proteínico y el requisito obligatorio para validar la eficiencia de Cada separación antes de realizar el experimento definido.

<table><tbody><tr><td>sacarosa</td><td>pancreática qu&iacute; mica SL, Barcelona, España</td><td>1.316.211.211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, España</td><td>2,112,211,210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, España</td><td>1.313.961.210</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa Set III</td><td>Millipore, Darmstadt, Alemania</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, España</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, España</td><td>1.311.651.604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Leche</td><td></td><td></td><td></td>en polvo desnatada</tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, España</td><td>1.216.591.211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, España</td><td>1,314,941,210</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, España</td><td>1.316.781.211</td><td></td></tr><tr><td>Basic 20 pH</td><td>Crison, Alella, España</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Homogeneizador Adaptable</td><td>VWR, Radnor, PA, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos ultratransparentes (14x89mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td>344059</td><td>Los tubos deben llenarse casi por completo cuando se utilizan para evitar el colapso debido a la ultracentrifugación.</td></tr><tr><td>Filtros centrífugos Amicon Ultra-15 Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Alemania</td><td></td> Centrífuga UFC901008 <td></td></tr><tr><td>5430R</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonificador 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, España</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio desechables Pasteur 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, EE. UU</td><td>. 612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Balanza compacta EK-610</td><td>A& D, Tokio, Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>GR 200 Precision Balance</td><td>A& D, Tokio, Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Anticuerpo casero anti-GPR37 producido y validado en el Laboratorio Francisco Ciruela.</td><td></td><td>Anticuerpos primarios utilizados a una concentración final de 0,250 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-sinaptofisina</td><td>Abcam, Cambridge, Reino Unido</td><td></td><td>Anticuerpos primarios diluidos 1:10.000</td></tr><tr><td>HRP conjugados en cabra anti-ratón IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.</td><td></td><td>Anticuerpo secundario diluido 1:10.000</td></tr><tr><td>HRP anti-conejo anti-conejo IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.</td><td></td><td>Anticuerpo secundario diluido 1:30.000</td></tr></tbody></table>

fraccionamiento de membranas cerebrales: un<em&gt; ex vivo</em&gt; enfoque para evaluar la localización de proteínas subsinápticas

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

La evaluación de la composición y función de las proteínas sinápticas constituye un desafío importante en la neurociencia. Sin embargo, no es fácil evaluar la neurotransmisión que ocurre dentro de las sinapsis porque está altamente regulada por interacciones proteína-proteína dinámicas y eventos de fosforilación. Por consiguiente, cuando se utiliza cualquier método para estudiar la transmisión sináptica, un objetivo principal es preservar estas modificaciones fisiológicas transitorias. Aquí, presentamos un protocolo de fraccionamiento de membrana cerebral que representa un procedimiento robusto para aislar proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos. En otras palabras, el protocolo describe una metodología bioquímica para llevar a cabo el enriquecimiento de proteínas de los compartimentos presinápticos, postsinápticos y extrasinápticos. En primer lugar, los sinaptosomas, o terminales sinápticas, se obtienen a partir de neuronas que contienen todos los compartimentos sinápticos por medio de un gradiente discontinuo de sacarosa. De la nota, la calidad de esta preparación inicial de la membrana sináptica es cRitical Posteriormente, el aislamiento de los diferentes compartimentos subsinápticos se logra con solubilización ligera usando detergentes suaves a condiciones de pH diferenciales. Esto permite la separación por gradiente y centrifugaciones isopicnicas. Por último, el enriquecimiento de proteínas en los diferentes compartimentos subsinápticos ( es decir, las fracciones de membrana pre, post y extrasináptica) se valida mediante el análisis de inmunotransferencia utilizando marcadores de proteínas sinápticas bien caracterizados (SNAP-25, PSD-95 y sinaptofisina, Respectivamente), lo que permite una evaluación directa de la distribución sináptica de cualquier proteína neuronal en particular.

La metodología descrita ha sido ampliamente utilizada para el análisis subsináptico de las proteínas neuronales en general y para el aislamiento y caracterización bioquímica de los receptores sinápticos 5 , 6 , 7 , 8 , 9 en particular. Curiosamente, el resultado representativo mostrado aquí demuestran la utilidad de este proce...

Aquí, presentamos un protocolo de fraccionamiento de membrana cerebral que representa un procedimiento robusto para aislar proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos.

Fraccionamiento de Membranas Cerebrales: Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque para evaluar la localización de proteínas subsinápticas

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos del cerebro de ratones. Describir la distribución de los componentes de la transmisión cinética es esencial para comprender la función sináptica tanto en condiciones normales como patológicas. Evidencias acumuladas muestran que las sinapsis in vivo son extremadamente dinámicas y pueden experimentar cambios estructurales drásticos que permiten mantener la transmisión sináptica.Las sinapsis han sido estudiadas clásicamente mediante microscopía electrónica. Este método de fraccionamiento de membranas se basa en la combinación de ablación láser utilizando detergentes suaves bajo diferentes condiciones de pH, seguido de una centrifugación de fracción de segundo. En resumen, se extrae el cerebro de un ratón y se disecciona cuidadosamente el hipocampo en un recipiente frío colocado sobre hielo triturado.Los hipocampos se recogen en un tubo de vidrio Potter-Elvehjem que contiene tampón de aislamiento frío con hielo. Posteriormente, el tejido recolectado se homogeniza utilizando un agitador homogenizador. A continuación, el tejido homogenizado se mezcla con una solución de sac

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En el fraccionamiento subcelular situ de células de mamíferos en cubreobjetos microscopio permite la visualización de la localización de la proteína.

En Fraccionamiento subcelular situ de células mamíferas adherentes y no adherentes-

Este procedimiento muestra cómo aislar del cerebro del ratón adulto las membranas de las mitocondrias ER-asociados o mams y los glucoesfingolípidos fracciones enriquecidas microdominio de MAM y preparaciones mitocondriales.

Las mitocondrias asociadas ER membranas (MAM) y glicoesfingolípidos microdominios enriquecidos (GEMS): Aislamiento de cerebro de ratón

El tráfico de membrana neuronal controla dinámicamente la membrana plasmática y la disponibilidad de proteína significativamente impactos neurotransmisión. Hasta la fecha, ha sido un desafío para medir el tráfico endocítica neuronal en las neuronas adultas. Aquí se describe un método altamente efectivo, cuantitativa para medir los cambios rápidos en la superficie de la proteína expresión ex vivo en rodajas de cerebro agudas.

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

Este artículo detalla el enriquecimiento de las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica por ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa. También se describe la preparación posterior de las proteínas de densidad post-sináptica. Preparaciones de proteínas son adecuados para el Western Blot o análisis DIGE 2D.

Preparación de sináptica Membrana plasmática y proteínas postsináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa

La identificación de moléculas y vías que controlan la plasticidad sináptica y la memoria sigue siendo un desafío importante en la neurociencia. Aquí, se describe un flujo de trabajo que aborda la cuantificación relativa de las proteínas sinápticas supuestamente involucradas en la reorganización molecular de las sinapsis durante el aprendizaje y la consolidación de la memoria en un paradigma de aprendizaje auditivo.

Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje

Endocitosis de vesículas sinápticas se detectan por microscopia ligera de pHluorin fusionado con la proteína de la vesícula sináptica y por microscopia electrónica de la absorción de la vesícula.

Medición de endocitosis vesícula sináptica en neuronas Hippocampal cultivadas

Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsive para la depresión severa. ECS a nivel mundial estimula la actividad en el hipocampo, a sinaptogénesis y plasticidad sináptica. Aquí, describimos los métodos para la inducción de ECS en ratas y para el fraccionamiento subcelular de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en proteínas sinápticas.

Electroconvulsiva convulsiones en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en densidad Postsynaptic proteínas

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un análisis cuantitativo del nivel de Asociación de la membrana plasmática para fluorescencia etiquetada periférica asociada a proteina. El método se basa en la descomposición computacional de membrana y citoplasmático componente de señal observado en células con marcador fluorescente membrana plasmática.

Determinación de la membrana plasmática particionado en proteínas asociadas periféricamente

Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Este protocolo describe el método crioAPEX, en el que una proteína de membrana etiquetada con APEX2 puede ser localizada por microscopía electrónica de transmisión dentro de la ultraestructura celular óptimamente conservada.

El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

Este protocolo presenta un método robusto y detallado para obtener sinaptosomas altamente puros, vesículas sinápticas y otras fracciones sinápticas del cerebro del ratón. Este método permite la evaluación de procesos sinápticos, incluyendo el análisis bioquímico de la localización y función de proteínas con resolución compartimental.

Fraccionamiento subcelular para el aislamiento de componentes sinápticos del cerebro murino

Aprende el método de fraccionamiento de membranas cerebrales para estudiar la localización de proteínas subsinápticas en cerebro de ratón. Esta técnica permite aislar compartimentos pre, post y extrasinápticos.

Fraccionamiento de Membranas Cerebrales: Un

Explorar más videos