Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

El objetivo general de este procedimiento es capturar la dinámica de la membrana mediante microscopía electrónica después de la inducción de la actividad neuronal utilizando optogenética y luego congelar las células en puntos de tiempo definidos después de la estimulación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia y biología celular sobre los mecanismos del reciclaje de vesículas sinápticas y también tal vez modelar en una escala de tiempo muy rápida. La principal ventaja de esta técnica es poder visualizar los cambios morfológicos dentro de una célula mediante microscopía electrónica en una escala de tiempo de milisegundos.

El procedimiento será demostrado por Shuo Li, estudiante de posgrado, y Sumana Raychaudhuri, investigadora asociada. Ambos de mi laboratorio. Antes de preparar el fijador, etiquete dos limas criogénicas de mililitros con un lápiz de acuerdo con sus números de muestra.

A continuación, combine todos los reactivos fijadores y alícuota de un mililitro de volúmenes del fijador en cada vial. Después de tapar los tubos, sumerja inmediatamente los fijadores en nitrógeno líquido y guarde los viales en una caja cerrada de espuma de poliestireno. A continuación, llene una unidad de sustitución libre automatizada y un congelador de alta presión con nitrógeno líquido.

A continuación, coloque un pequeño recipiente de acetona en la cámara de muestras de la unidad de sustitución libre y espere hasta que la temperatura de la unidad de sustitución alcance los 90 grados centígrados bajo cero. Para programar el protocolo de estimulación lumínica, haga clic en editar en la ventana de estimulación lumínica del monitor táctil. Se abrirá otra ventana.

Introduzca 15 segundos para la fase oscura. 100 milisegundos para el período. 10 milisegundos para el pulso y uno para el número de períodos para un solo estímulo de 10 milisegundos.

En la pantalla principal, confirme que la casilla de estimulación de luz esté marcada y haga clic en almacenamiento de muestras seguido de editar. En la nueva ventana, use el botón más o menos para seleccionar dos para almacenar dos muestras en cada canal y confirme que se ha elegido el almacenamiento de nitrógeno líquido habilitado. Ahora, bajo un microscopio estereoscópico, coloque una celda de disco de zafiro con el lado hacia arriba en el pocillo de una placa negra del medio.

Seguido de un anillo espaciador de 100 micras. Sumerja un lado de un disco de zafiro en blanco en una solución salina precalentada y coloque el disco sobre el anillo espaciador, con la solución salina hacia abajo. Coloque otro anillo espaciador de 100 micras.

Y un anillo espaciador de 400 micras en la parte superior del último disco de zafiro, y use papel de filtro para eliminar el exceso de líquido. Mientras sostienes las muestras, asegúrate de no atrapar ninguna burbuja de aire entre los discos de zafiro. A continuación, coloque todo el conjunto entre los dos medios cilindros transparentes y cierre la tapa roja superior para iniciar el proceso de congelación.

La cubierta roja volverá a aparecer automáticamente una vez que se complete el proceso de congelación. Cuando todas las muestras se hayan congelado, abra la puerta del dewar de almacenamiento y transfiera el dewar a la mesa de trabajo. Transfiera la cámara de muestras del almacén a una bandeja de muestras especializada llena de nitrógeno líquido.

Y desbloquee la perilla para liberar la copa de muestras. A continuación, utilice un par de pinzas con puntas refrigeradas por nitrógeno líquido para retirar los medios cilindros transparentes del vaso de muestras. Y transfiera con cuidado los platos negros del medio a una taza pequeña que contenga nitrógeno líquido.

Tenga cuidado de mantener las muestras congeladas bajo nitrógeno líquido en todo momento, y de mantener siempre manipuladas las muestras con pinzas preenfriadas. Vuelva a enfriar previamente las pinzas y transfiera rápidamente la primera placa central a la acetona preenfriada. Agitar y golpear suavemente la placa para separar el disco de zafiro de la placa.

A continuación, coloque una lima criogénica abierta de fijador en una cámara de muestras en la unidad de sustitución. Transfiera el disco de zafiro al vial. Y tapone inmediatamente el vial.

Cuando se hayan transferido todas las muestras, configure los parámetros apropiados del programa de sustitución libre e inicie el programa. Al final del programa de sustitución gratuita, use guantes para transferir los archivos criogénicos de la cámara de muestras a una campana química y use una pipeta para agregar acetona a temperatura ambiente a cada vial. Reemplace el lavado en cada vial con acetona fresca de cuatro a seis veces durante un período de una a dos horas.

A continuación, añada resina epoxi al 30% recién preparada a cada vial para una incubación de dos a tres horas a temperatura ambiente en un agitador orbital a 120 rpm. Al final de la incubación, reemplace el 30% de resina epoxi por un 70% de resina epoxi para una incubación de tres a cuatro horas en el agitador orbital. A continuación, utilice unas pinzas para transferir cada disco, con la célula hacia arriba, a la tapa de una cápsula de inclusión y añada un 90% de resina epoxi a los discos para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados.

A la mañana siguiente, transfiera cada disco de zafiro a la tapa de una nueva cápsula de inclusión y llene la tapa con resina 100% epoxi recién preparada. Después de la última incubación de resina 100% epoxi, polimerice las muestras en un horno a 60 grados centígrados durante 48 horas. Cuando las muestras se hayan polimerizado, coloque la primera muestra boca abajo en el microscopio estereoscópico de modo que el disco de zafiro quede en la parte superior del bloque de resina, y utilice una cuchilla de afeitar para eliminar una fina capa de resina de la parte superior de la muestra.

A continuación, utiliza la hoja de afeitar para cortar una línea poco profunda a lo largo del borde del disco para separar el disco de zafiro de la resina epoxi. Y sumerja el disco en nitrógeno líquido durante unos 10 segundos para separar el disco del resto de la resina. Transfiera la resina bajo un microscopio de disección y pegue la muestra con cinta adhesiva a la etapa del microscopio.

Con un aumento de cuatro a 10X, encuentre un área con celdas y use una hoja de afeitar de doble filo para cortar un área de dos por dos milímetros alrededor de la región de interés. A continuación, utilice el superpegamento para montar las células en un bloque ficticio cilíndrico hecho de resina epoxi e incube el bloque a 60 grados centígrados durante una hora. Después de seccionar en un tomo ultra micro, transfiera las muestras a un microscopio electrónico de transmisión para obtener imágenes con un aumento de 930.000X.

En esta imagen, se muestra la fusión de vesículas sinápticas a través de exocitosis registrada 15 milisegundos después del inicio de la luz dentro de la zona activa de una membrana presináptica en una neurona del hipocampo de ratón. 100 milisegundos después del inicio de la luz se puede observar una fosa endocitótica adyacente a la zona activa, lo que ilustra una endocitosis ultrarrápida por parte de la célula nerviosa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo procesar muestras con experimentos de flash y congelación.

Recuerde que trabajar con glutaraldehído, tetróxido de osmio y nitrógeno líquido puede ser realmente peligroso, por lo que asegúrese de usar ropa protectora. Una vez dominado, la parte de congelación de estos procedimientos se puede realizar en un par de horas para 12 muestras, pero el resto de los procedimientos, incluidas las imágenes y el análisis de imágenes, pueden llevar hasta días, semanas o incluso meses, por lo que podrían ser procedimientos realmente largos. Si localizas proteínas, o visualizas su dinámica, también puedes utilizar diferentes protocolos para preservar la antigenicidad, o perlacencia, de las proteínas nacaradas y visualizar su dinámica utilizando estas técnicas.