Name: Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprende la técnica flash-and-freeze para capturar dinámicas de membrana en neuronas de hipocampo de ratón con microscopía electrónica. Este método permite visualizar fusión de vesículas sinápticas y endocitosis con resolución de milisegundos.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de la Johns Hopkins University (SW). Agradecemos a la Escuela Johns Hopkins de instalación de medicina microscopio por su apoyo técnico. Agradecemos a Erik Jorgensen y Christian Rosenmund y los miembros de sus laboratorios para el desarrollo de la técnica. Agradecemos a M. Wayne Davis para el diseño del dispositivo inicial. Agradecemos a Paul Wurzinger, Cveta Tomova y Delgermaa Luvsanjav por su asistencia técnica. Agradecemos también a Natalie R. Hamilton y Grant F. Kusick para su lectura crítica del manuscrito.

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Publicación de acceso abierto de este artículo fue patrocinado por Leica Mikrosysteme GmbH.

El enfoque de &quot;flash-y-congelación&quot; visualiza dinámica de la membrana mediante la inducción de un evento celular particular con la optogenética y mediante la congelación de las células en los puntos de tiempo definidos después de la estimulación 19. En esta demostración, se utilizó canalrodopsina, un canal catiónico sensible a la luz, para estimular las neuronas y capturó la fusión y la recuperación de las vesículas sinápticas en los terminales sinápticas. En los últimos años, muchas herramientas optogenéticos se han desarrollado 22, 23, todos los cuales son compatibles con flash-y-congelación. Por ejemplo, el tráfico de orgánulo puede ser inducida mediante heterodimerización inducida por la luz de criptocromo y CIB1 24. Del mismo modo, la composición lipídica de la membrana plasmática puede ser alterado por la translocación inducida por la luz de las fosfatasas phosphoinositide a la membrana plasmática 25. Además, pequeñas, compuestos sensibles a la luz como ch azobencenoconformación ange dependiendo de las longitudes de onda de iluminación. Este cambio conformacional se puede utilizar para activar los canales activados por ligando o para cambiar la composición de lípidos en la membrana 26, 27. compuestos enjaulados también se pueden utilizar para inducir la actividad celular. Sin embargo, el LED se utiliza en la configuración actual no puede producir suficiente energía para uncaging; Por lo tanto, otras optimizaciones del sistema son probablemente necesario. Sin embargo, las aplicaciones de estas herramientas activable por luz son eventos celulares flexibles-muchos pueden ser inducidas por un destello de luz. &quot;Flash-y-congelación&quot; puede capturar la dinámica de membrana resultantes. Hay dos principales limitaciones para el método de &quot;destello y congelación&quot;. En primer lugar, se capta &quot;instantáneas&quot; de un evento en particular de diferentes células. En otras palabras, no es posible seguir la dinámica de la membrana en una celda durante un período de tiempo. Por lo tanto, para la reconstrucción de cualquier celular, inclusot, uno debe adquirir y analizar un gran número de imágenes de cada muestra y en cada punto de tiempo. Además, en las neuronas, un número aún mayor de las imágenes es necesario, ya que la fusión de las vesículas sinápticas solamente tiene lugar en 20 - 30% de las sinapsis en las neuronas del hipocampo del ratón 18, 28. El análisis de un gran conjunto de datos de este tipo requiere enormes cantidades de tiempo. En el futuro, la adquisición y análisis de imágenes necesitan ser automatizado para hacer el enfoque más eficiente 29, 30. La segunda limitación es impuesta por la naturaleza de la técnica de congelación de alta presión. Cuando las células se congelan, agua celular reorganiza para formar cristales de hielo si la velocidad de congelación es inferior a 100 K / s 21. Estos cristales de hielo pueden penetrar en las membranas o concentrarse solutos para alterar la presión osmótica local, dando como resultado la rotura de las membranas. Para evitar los cristales de hielo, high presión (~ 2,000 atm) se aplica a los especímenes. Debido al efecto de super-enfriamiento, una velocidad de congelación de 100 K / s es suficiente para evitar que el agua de formación de cristales de hielo a esta presión 21. En teoría, especímenes tan gruesa como de 500 micras se pueden congelar sin cristales de hielo, pero aproximadamente 200 micras es probable el límite práctico, como formas cúbicas de hielo tienden a formar en el tejido de espesor, comprometiendo la morfología. Cuando el procesamiento de muestras más gruesas que 5 m, el uso de un crio-protector adecuado, tal como BSA, es necesario. Sin embargo, BSA va a cambiar la osmolaridad de la solución y puede afectar la respuesta fisiológica de las células. Por lo tanto, se requieren extensos experimentos de control para validar el uso de BSA en sistemas particulares. Los cristales de hielo también se pueden formar después de la congelación de alta presión si los especímenes se retiran accidentalmente desde el baño de nitrógeno líquido. Por lo tanto, es crítico para mantener los especímenes en el nitrógeno líquido en todo momento y para el uso de fórceps preenfriado amanipularlos. Cuando la planificación de experimentos, los tres puntos siguientes deben ser considerados. En primer lugar, la intensidad máxima de la luz (la línea de 460 nm) es 5,5 a 8,0 mW / mm 2. Si esta intensidad es suficiente para inducir la actividad debe ser verificado con imágenes de células vivas en un microscopio de fluorescencia antes de los experimentos de inflamación y liofiliza. En segundo lugar, los experimentos deben realizarse a temperatura fisiológica. La etapa del congelador de alta presión se calienta hasta 37 ° C para los experimentos con las neuronas del hipocampo del ratón 31. Por último, los puntos de tiempo deben ser elegidos cuidadosamente para capturar la dinámica de la membrana. Los estudios iniciales indicaron que la endocitosis es completa después de 100 ms de estimulación. Por lo tanto, los tres puntos de tiempo adicionales (15, 30, y 50 ms) también fueron examinados para seguir la dinámica de la membrana 17, 18. Estos puntos de tiempo fueron necesarios para visualizar caso el tráfico de membranas durante la transmisión sináptica. Sin embargo, el requisito para el número de puntos de tiempo son diferentes en cada evento celular. Por lo tanto, algunos puntos de tiempo deben ser muestreados antes de iniciar la recogida de datos de gran tamaño.

Visualización dinámica de la membrana y proteínas dentro de una célula es un paso clave hacia la comprensión de la biología celular de procesos particulares. eventos de tráfico dinámico se pueden capturar usando la luz o microscopía de fluorescencia. Sin embargo, el contexto subcelular está en gran parte ausente en este tipo de imágenes porque las estructuras subcelulares no puede ser completamente &quot;pintadas&quot; por colorantes o sondas fluorescentes y resueltas espacialmente y espectralmente 1, 2. Por otro lado, si bien la microscopía electrónica puede delinear la arquitectura subcelular con exquisito detalle, no puede capturar la dinámica celular, ya que las muestras deben fijarse antes de la imagen. Así, es típicamente no es suficiente para entender completamente la dinámica celular usando solamente una modalidad de imagen. Para superar las limitaciones de la luz y microscopía electrónica, se han desarrollado técnicas de microscopía correlativos. Correlativa de luz y microscopía electrónica(CLEM) visualiza dinámica intracelular utilizando microscopía de luz y estructuras subcelulares subyacentes con microscopía electrónica. En CLEM, las células que participan en varios procesos, tales como la citocinesis y la endocitosis 3, 4, 5, 6, son-live imagen y luego procesados para microscopía electrónica. Aunque CLEM captura ciertos aspectos de la dinámica intracelulares, hay cuatro factores que limitan la utilidad de este enfoque. En primer lugar, la resolución temporal está limitada por la rapidez con la que las células pueden inmovilizarse, que típicamente toma s - min debido a la lenta difusión y la reacción de fijadores 7. En segundo lugar, se observa la arquitectura subcelular post facto 8; Por lo tanto, los cambios morfológicos dinámicas no pueden ser capturados utilizando este enfoque. En tercer lugar, las micrografías de fluorescencia y de electrones no se pueden alinear con precisión debido a sh tejidorinkage causada por la deshidratación durante la preparación de la muestra para microscopía electrónica 9, 10. En cuarto lugar, eventos como la citocinesis y la endocitosis no tienen lugar al mismo tiempo en todas las células 5, 11, y por lo tanto, una célula particular que se dedica en caso deben ser identificados a partir de una gran población de células. Este proceso es a menudo laborioso. Por lo tanto, un nuevo método es necesaria para inducir eventos particulares en cada célula y para capturar la dinámica celular resultantes por la rápida inmovilización de células en puntos de tiempo definidos. Recientemente, varios se han desarrollado herramientas para inducir particulares dinámica celular utilizando la luz (optogenética). Canalrodopsina es un canal de catión sensible a la luz, no selectivo aislado de Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Cuando se expresa en canalrodopsina neuronal membranas, un breve destello de luz induce una afluencia de iones de sodio en neuronas y desencadena una acción potencial 14, 15. El potencial de acción se propaga entonces en los terminales sinápticos, donde las vesículas sinápticas se fusionan en cuestión de milisegundos 16, 17, 18 Por lo tanto, canalrodopsina induce la actividad neuronal. Para seguir dinámica de la membrana en las terminales sinápticas, las neuronas deben ser inmovilizados en puntos de tiempo definidos después de la estimulación con precisión ms. Para capturar dinámica de la membrana después de la inducción de la actividad neuronal, que acoplamos la estimulación de luz con alta presión de congelación 17, 18, 19. Congelación de alta presión permite la inmovilización casi instantánea de las células con la formación de cristales de hielo reducida 20. Los cristales de hielo can romper las membranas y perturbar la arquitectura subcelular 21. Variando los intervalos de tiempo entre la estimulación y la congelación, el tráfico de membrana dentro de los terminales sinápticos fue capturado después de la inducción de un potencial de acción. Aquí, demostramos procedimientos experimentales usando un congelador de alta presión comercializado que las parejas un control temporal ms de estimulación de la luz con la congelación de alta presión. A diferencia de otros instrumentos que requieren un dispositivo externo para controlar la estimulación de luz y la congelación, la estimulación de luz está totalmente integrado en este sistema y se puede aplicar con precisión ms 19. Este proceso implica varios pasos. 1) las neuronas del hipocampo de ratón se cultivan en discos de zafiro e infectadas con lentivirus que lleva un vector de expresión para canalrodopsina 18. 2) Las neuronas son estimuladas y se congelaron a puntos de tiempo definidos después de la estimulación. 3) El agua vitrificada es sustitutod con un disolvente orgánico, mientras que los lípidos y las proteínas son reticulados por fijadores para preservar la arquitectura intracelular. 4) Las muestras se infiltraron y embebidos en resina epoxi. 5) secciones ultrafinas se recogen usando un ultramicrotomo. 6) Las secciones finas se forman imágenes en un microscopio electrónico de transmisión. 7) de adquisición y análisis de imágenes se llevan a cabo a ciegas con respecto a los puntos de tiempo o genotipos. La dinámica celular se pueden determinar a través de la reconstrucción de imágenes con resolución temporal 17, 18. Preparación de la muestra (pasos 2 - 5 más arriba) requiere una semana, pero el análisis de la imagen subsiguiente requiere meses a un año.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Sustitución por Congelación e Inclusión a Baja Temperatura para Microscopía Óptica y Electrónica -AFS II</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congelador de alta presión - EM-ICE</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>EM ICE es un congelador de alta presión especializado que permite un control preciso de la estimulación de la luz y la congelación.</td></tr><tr><td>Osmómetro</td><td>Gonotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotomo UC7</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horno</td><td>Azul M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar Personna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>EMS</td><td>16530</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>EMS</td><td>RT19132</td><td>Tóxico, abierto solo bajo cubierta química certificada</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>EMS RT10016</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Emdmillipore</td><td>391340-250GM</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>49159-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>746436-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td>Sigma 21115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>J.T.Baker</td><td>2444-01</td><td></td></tr><tr><td>Resina epoxi líquida Eponate 12</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>Resina epoxi de bisfenol A Araldita 502</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido succínico de dodecenil (DDSA)</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>Bencil dimetil amina (BDMA)</td><td>Ted Pella</td><td>18241</td><td></td></tr><tr><td>Cápsula de inclusión especial (BEEM)</td><td>EMS</td><td>70021</td><td></td></tr><tr><td>Rejilla de cobre</td><td>Ted Pella</td><td>1GC12H Acetato</td><td></td></tr><tr><td>de polivinilo ( Pioloform F)</td><td>Ted Pella</td><td>19244</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Polysciences</td><td>21447-25</td><td></td></tr><tr><td>Cianoacrilato de etilo (superpegamento)</td><td>Scotch</td><td>170497</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Themo scientific</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Thermo scientific</td><td>10569-044</td><td>Debe calentarse a 37 &deg; C antes</td></tr><tr><td>de usar FBS (Suero Fetal Bovino)</td><td>Thermo scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Thermo scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-desoxiuridina (FUDR)</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher</td><td></td><td>S175223 Debe lavarse con ácido</td></tr><tr><td>Disco de zafiro</td><td>Technotrade</td><td>616-100</td><td></td></tr><tr><td>Acetic ácido</td><td>Emdmillipore</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lisina (PDL)</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Cola de rata colágeno</td><td>Thermo scientific</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Fisher</td><td>10888022</td><td>Debe calentarse a 37 &deg; C antes</td></tr><tr><td>de usar L-alanil-L-glutamina (Glutamax)</td><td>Fisher</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento libre de seraum&nbsp; (B-27)&nbsp;</td><td>Solución</td><td></td> salina balanceada de Fisher 17504044 <td></td></tr><tr><td>Hanks (HBSS)</td>La unidad activa de LS003126 <td>Thermo scientific</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td></td><td>debe calcularse para cada lote</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina</td><td>Sigma</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>NBQX</td><td>Tocris</td><td>03-731-0</td><td></td></tr><tr><td>Bicculine</td><td>Tocris</td><td>01-091-0</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman I</td><td></td> Microscopio electrónico de transmisión GE <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Philips CM20</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

flash-y-freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con microscopía electrónica

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Las células cambian constantemente su arquitectura membrana y distribución de las proteínas, pero es extremadamente difícil de visualizar estos eventos a una resolución temporal y espacial del orden de ms y nm, respectivamente. Hemos desarrollado una técnica resuelta en el tiempo microscopía electrónica, &quot;flash-y-congelación&quot;, que induce eventos celulares con optogenética y visualiza la dinámica membrana resultante mediante la congelación de las células en los puntos de tiempo definidos después de la estimulación. Para demostrar esta técnica, expresamos canalrodopsina, un canal catiónico sensible a la luz, en las neuronas del hipocampo del ratón. Un destello de luz estimula la actividad neuronal e induce la liberación de neurotransmisores desde las terminales sinápticas a través de la fusión de las vesículas sinápticas. La estimulación de las neuronas optogenético se acopla con la congelación de alta presión para seguir los cambios morfológicos durante la transmisión sináptica. El uso de un instrumento comercial, capturamos la fusión de las vesículas sinápticas y la recuperación de la synamembrana de la vesícula PTIC. Para visualizar la secuencia de eventos, grandes conjuntos de datos se generaron y analizaron a ciegas, ya que los cambios morfológicos fueron seguidos en diferentes células en el tiempo. Sin embargo, flash-y-congelación permite la visualización de dinámica de la membrana en las micrografías electrónicas con resolución temporal ms.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, se realizó &quot;flash-y-Freeze&quot; experimentos en las neuronas del hipocampo de ratón que expresan canalrodopsina. Estas neuronas se congelaron sea de 15 ms o 100 ms después del inicio de la iluminación. Hemos demostrado anteriormente que la exocitosis y la endocitosis de las vesículas sinápticas se producen en las terminales sinápticas en los 15 ms y 100 ms de tiempo de puntos, respectivamente 18. Estos eventos fueron capturados con éxito en los momentos apropiados (Figura 2), lo que sugiere que los experimentos de flash-y-Freeze pueden llevar a cabo con éxito en el congelador de alta presión especializado elegido (véase la Tabla de Materiales). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" /> Figura 1. carga de la muestra y la programación en la alta presión del congelador. A) mesa de carga de muestra de un alto-pcongelador resión. La placa intermedia, que se muestra en el recuadro para el detalle estructural, se coloca en un CLEM holder para la carga de la muestra. Uno de los semicilindros se coloca en la parte inferior de la tabla de carga de muestra, y el otro está unido con un clip a la cubierta superior. Una vez que se carga la muestra, la placa media se empuja hacia delante a la media-cilindro inferior y la tapa está cerrada para iniciar la congelación. B) conjunto de muestras. El disco de zafiro que contiene neuronas se coloca en el pocillo de la placa media, con el lado de células hacia arriba. Un anillo 100 m se coloca directamente encima del disco de zafiro el interior del pozo. A continuación, un disco de zafiro vacío sumergido en solución salina fisiológica se coloca con la cara hacia abajo solución. Las burbujas de aire deben ser evitados. Finalmente, un anillo de 100 micras y un anillo de 400 micras se colocan ajustadamente anteriormente. Cualquier exceso de líquido se elimina con papel de filtro. C) Una sección transversal de una cápsula de la incrustación con el disco de zafiro sumergido en resina epoxi. el Sappdisco contratar se coloca en la parte inferior de la cápsula, con el lado de la célula hacia arriba y cubierto con resina epoxi para la infiltración y la incrustación. D) Programación del congelador de alta presión para una sola, 10 ms estímulo. Las muestras se congelan 90 ms después de que el pulso de luz. E) Programación del congelador de alta presión durante 10 estímulos a 20 Hz. Las muestras se congelan 5 ms después del último pulso de luz. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" /> La Figura 2. La visualización de la exocitosis y la endocitosis en el ratón las neuronas del hipocampo. Las neuronas del hipocampo se estimularon una vez y se congelaron a los tiempos indicados. Las micrografías electrónicas muestran la exocitosis de vesículas sinápticas A) y endocitosis ultrarrápida <strong&gt; B). PSD, Densidad post-sináptica. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Hemos desarrollado una nueva técnica de microscopía electrónica, &quot;Flash-y-congelación&quot;, que permite la visualización de la dinámica de la membrana con ms resolución temporal. Esta técnica combina la estimulación optogenético de neuronas con la congelación de alta presión. Aquí, demostramos los procedimientos y describimos los protocolos en detalle.

Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

El objetivo general de este procedimiento es capturar la dinámica de la membrana mediante microscopía electrónica tras la inducción de la actividad neuronal usando optogenética, seguida del congelamiento de las células en puntos de tiempo definidos tras la estimulación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia y biología celular sobre los mecanismos de reciclaje de vesículas sinápticas y también, quizás, modelarlos a una escala de tiempo muy rápida. La principal ventaja de esta técnica consiste en poder visualizar cambios morfológicos dentro de una célula mediante microscopía electrónica a una escala de tiempo de milisegundos.El procedimiento será demostrado por Shuo Li, una estudiante de posgrado, y Sumana Raychaudhuri, una asociada de investigación. Ambas del laboratorio de mi grupo. Antes de preparar el fijador, etiquete dos viales criogénicos de un mililitro con un lápiz según sus números de espécimen.Luego combine todos los reactivos fijadores y alícuote un mililitro de volumen del fijador en cada vial. Después de tapar los tubos, sumerja inmediatamente los fijadores en nitrógeno líquido y almacene los viales en una caja de poliestireno cerrada. A continuación, llene una unidad automatizada de sustitución criogénica y un congelador de alta presión con nitrógeno líquido.Luego, coloque un recipiente pequeño con acetona en la cámara de la muestra de la unidad de sustitución libre y espere hasta que la temperatura de la unidad de sustitución alcance menos 90 grados Celsius. Para programar el protocolo de estimulación luminosa, haga clic en editar en la ventana de estimulación luminosa del monitor táctil. Se abrirá otra ventana.Ingrese 15 segundos para la fase oscura, 100 milisegundos para el período, 10 milisegundos para el pulso y uno para el número de períodos para un único estímulo de 10 milisegundos.En la pantalla principal, confirme que la casilla de estimulación luminosa esté marcada y haga clic en almacenamiento de muestras seguido de editar. En la nueva ventana, utilice el botón más o menos para seleccionar dos y almacenar dos muestras en cada canal, y confirme que esté seleccionada la opción de nitrógeno líquido para almacenamiento. Ahora, bajo un microscopio estereoscópico, coloque un disco de zafiro con la cara celular hacia arriba en el pocillo de una placa negra media.Seguido de un anillo espaciador de 100 micrones. Sumerja un lado de un disco de zafiro en blanco en una solución salina precalentada y coloque el disco sobre el anillo espaciador, con el lado de la salina hacia abajo. Coloque otro anillo espaciador de 100 micrones.Y un anillo espaciador de 400 micrones encima del último disco de zafiro, y utilice papel de filtro para eliminar cualquier exceso de líquido. Mientras sostiene las muestras, asegúrese de no atrapar burbujas de aire entre los discos de zafiro. Luego, coloque el conjunto completo entre los dos cilindros semitransparentes y cierre la tapa roja superior para iniciar el proceso de congelación.La tapa roja volverá a subir automáticamente una vez que el proceso de congelación haya finalizado. Cuando todas las muestras hayan sido congeladas, abra la puerta del depósito de almacenamiento y transfiera el depósito a la superficie de trabajo. Transfiera la cámara de especímenes del depósito de almacenamiento a una bandeja de muestra especializada llena de nitrógeno líquido.Y desbloquee el botón para liberar el recipiente de la muestra. Luego, use un par de pinzas con puntas enfriadas con nitrógeno líquido para retirar los cilindros semitransparentes del recipiente de la muestra. Y transfiera cuidadosamente las placas negras centrales a un pequeño recipiente que contenga nitrógeno líquido.Tenga cuidado de mantener las muestras congeladas bajo nitrógeno líquido en todo momento y de manipularlas siempre con pinzas previamente enfriadas. Enfríe nuevamente las pinzas y transfiera rápidamente la primera placa central al acetona previamente enfriado. Agite y golpee suavemente la placa para separar el disco de zafiro de la placa.Luego, coloque un frasco criogénico abierto con fijador en una cámara de espécimen en la unidad de sustitución. Transfiera el disco de zafiro al vial. Y tape inmediatamente el vial.Una vez que se hayan transferido todas las muestras, configure los parámetros adecuados del programa de sustitución libre e inicie el programa. Al finalizar el programa de sustitución libre, use guantes para transferir los viales criogénicos desde la cámara de muestras a una campana química y utilice una pipeta para agregar acetona a temperatura ambiente a cada vial. Reemplace la solución de lavado en cada vial con acetona fresca de cuatro a seis veces durante un período de una a dos horas.Luego, agregue resina epoxi recién preparada al 30 % a cada vial para una incubación de dos a tres horas a temperatura ambiente en un agitador orbital a 120 rpm. Al final de la incubación, reemplace la resina epoxi al 30 % con resina epoxi al 70 % para una incubación de tres a cuatro horas en el agitador orbital. Luego, use pinzas para transferir cada disco, con la cara celular hacia arriba, a la tapa de una cápsula de inclusión y agregue resina epoxi al 90 % a los discos para una incubación nocturna a cuatro grados Celsius.A la mañana siguiente, transfiera cada disco de zafiro a la tapa de una cápsula de inclusión nueva y llene la tapa con resina epoxi al 100% recién preparada. Después de la última incubación con resina epoxi al 100%, polimerice las muestras en un horno a 60 grados Celsius durante 48 horas. Cuando las muestras hayan polimerizado, coloque la primera muestra boca abajo sobre el microscopio estereoscópico de modo que el disco de zafiro quede en la parte superior del bloque de resina, y use una cuchilla de afeitar para eliminar una capa delgada de resina de la parte superior de la muestra.A continuación, utilice la cuchilla de afeitar para cortar una línea superficial a lo largo del borde del disco y separar el disco de zafiro de la resina epoxi. Sumerja el disco en nitrógeno líquido durante unos 10 segundos para separar el disco del resto de la resina. Transfiera la resina bajo un microscopio estereoscópico y sujete la muestra a la platina del microscopio.Utilizando un aumento de cuatro a 10X, localice un área con células y use una cuchilla de doble filo para cortar un área de dos por dos milímetros alrededor de la región de interés. Luego, use pegamento instantáneo para montar las células sobre un bloque cilíndrico falso hecho de resina epoxi e incube el bloque a 60 grados Celsius durante una hora. Después de seccionar en un ultramicrótomo, transfiera las muestras a un microscopio electrónico de transmisión para obtener imágenes con un aumento de 930.000X.En esta imagen, se muestra la fusión de vesículas sinápticas mediante exocitosis registrada 15 milisegundos después del inicio de la luz dentro de la zona activa de una membrana presináptica en una neurona del hipocampo de ratón. 100 milisegundos después del inicio de la luz, puede observarse una fosa endocitótica adyacente a la zona activa, lo que ilustra la endocitosis ultrarrápida por parte de la célula nerviosa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo procesar muestras con experimentos de flash y congelación.Recuerde que trabajar con glutaraldehído, tetraóxido de osmio y nitrógeno líquido puede ser realmente peligroso, por lo que asegúrese de usar ropa protectora. Una vez dominada, la parte de congelamiento de este procedimiento puede realizarse en un par de horas para 12 muestras, pero el resto del procedimiento, incluyendo la obtención de imágenes y el análisis de imágenes, puede tardar días, semanas o incluso meses, por lo que podría tratarse de un procedimiento muy largo. Si localiza proteínas o visualiza sus dinámicas, también puede utilizar diferentes protocolos para preservar la antigenicidad o la perlacidad de las proteínas perladas y visualizar sus dinámicas mediante estas técnicas.

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Investigación

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Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

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