Glycoproteomics de la matriz extracelular: Un método para el análisis glucopéptidos Intacto El uso de la espectrometría de masas

El objetivo general de este protocolo es analizar la composición de proteínas de la matriz extracelular, incluida la identificación de los sitios de glicosilación y la caracterización composicional de las formas de glicanos en los tejidos cardiovasculares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el proceso de fibrosis tisular, como por ejemplo cómo la glicoslación de una matriz estructural afecta a la fibrosis tisular durante la enfermedad cardiovascular. La principal ventaja de esta técnica es que, a diferencia de los protocolos anteriores que analizan los cambios generales en la glicosilación, permite la caracterización de la glicosilación en sitios particulares de las proteínas de una matriz estructural, proporcionando una herramienta para estudios mecanicistas de seguimiento más específicos.

La Dra. Marika Fava y la Sra. Ferheen Baig de nuestro laboratorio harán una demostración de los procedimientos. Para comenzar este procedimiento, prepare todos los búferes de extracción como se describe en el protocolo de texto. A continuación, use un bisturí para cortar de 20 a 50 miligramos de tejido en tres o cuatro piezas más pequeñas de aproximadamente dos milímetros de tamaño.

Coloque el pañuelo cortado en cubitos en un tubo de 1,5 mililitros y agregue 500 microlitros de PBS helado. Lave el pañuelo cinco veces con 500 microlitros de PBS en cada lavado para minimizar la contaminación de la sangre. Transfiera las muestras lavadas a un tubo de 1,5 mililitros con un tapón de rosca y agregue un volumen de tampón de cloruro de sodio 10 veces el peso del tejido.

Vórtice a velocidad mínima durante una hora a temperatura ambiente. Luego, transfiera el extracto a nuevos tubos de centrífuga y centrifugue a 16.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Lave brevemente los gránulos de tejido resultantes con tampón de cloruro de sodio fresco.

Después de esto, agregue un volumen de tampón SDS 10 veces el peso del tejido y vórtice a una velocidad mínima durante 16 horas a temperatura ambiente. Transfiera el extracto a nuevos tubos de centrífuga y centrifugue a 16.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Lave los pellets resultantes con agua bidestilada.

Añadir un volumen de tampón de clorhidrato de guanidina cinco veces el peso del tejido y el vórtice a máxima velocidad durante 72 horas a temperatura ambiente. Transfiera el extracto resultante a nuevos tubos y centrifugue a 16.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de cuantificar la proteína, alícuota 10 microgramos a un tubo nuevo para cada muestra, para la evaluación de la ocupación del sitio de glicosilación y 50 microgramos a un tubo separado para el análisis directo de glicopéptidos.

Agregue 10 veces el volumen de etanol a cada uno e incube durante la noche a 20 grados centígrados. Al día siguiente, centrifugar las muestras a 16.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet precipitado.

A continuación, utilice un concentrador de vacío para secar los pellets durante 15 minutos a temperatura ambiente. Agregue 10 microlitros de tampón de desglicosilación preparado a cada muestra. Empaque los tubos de muestra dentro de un tubo cónico de 50 mililitros e incube en un ángulo de 45 grados durante dos horas a 25 grados centígrados.

Después de esto, aumente la temperatura a 37 grados centígrados e incube durante 36 horas con una agitación suave. Después de centrifugar a 16.000 veces G durante un minuto, utilice un concentrador de vacío a temperatura ambiente durante 45 minutos para evaporar el agua. Vuelva a suspender las muestras secas con 10 microlitros de agua etiquetada con O-18 que contenga 50 unidades por mililitro PNGase F. Incubar durante 36 horas a 37 grados Celsius bajo agitación constante, luego realice la digestión de tripsina en solución para todas las muestras y proceda con la limpieza de C-18.

Para empezar, añade 200 microlitros de metanol a cada pocillo de la placa de centrifugado C-18 para activar la resina. Centrifugar a 1.000 veces G durante un minuto. A continuación, añada 200 microlitros de 80% de ACN y 0,1% de AGT en agua a cada pocillo y centrifugar a 1.000 veces G durante un minuto.

A continuación, agregue 200 microlitros de una solución que contenga 1% de ACN y 0.1% de TFA en agua a cada pocillo, y centrifugue durante un minuto a 1,000 veces G. Repita la adición de esta solución y la centrifugación dos veces. Después de esto, cargue las muestras en los pocillos de la placa de centrifugación y centrifugue a 1500 veces G durante un minuto. Vuelva a cargar el flujo y repita la centrifugación.

A continuación, añada 200 microlitros de una solución que contenga 1% de ACN y 0,1% de AGT en agua a cada pocillo, y centrifugar a 1500 veces G durante un minuto. Repita la adición de esta solución y la centrifugación dos veces. A continuación, añada 170 microlitros de una solución que contenga 50% de ACN y 0,1% de AGT en agua a cada pocillo y centrifugar a 1500 veces G durante un minuto.

Repita esta adición y centrifugación una vez más. Utilice un concentrador de vacío para secar el eluido combinado a temperatura ambiente durante dos horas. Guarde las muestras secas a 80 grados centígrados hasta que estén listas para usar.

Después de esto, realice el análisis de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida en las muestras destinadas a la evaluación de la ocupación de glucosita. En el caso de las muestras destinadas al análisis directo de glicopéptidos, proceda primero con el etiquetado cero TMT estándar como se describe en el protocolo de texto. Para empezar, añadir a cada 10 microlitros de muestra marcada con TMT zero 50 microlitros de tampón aglutinante proporcionado.

A continuación, alícuota 50 microlitros de suspensión de resina de captura de glico homogénea en nuevos tubos de 1,5 mililitros y centrífuga durante un minuto a 2500 veces G.Retire el sobrenadante y añada 60 microlitros de la muestra y la solución tampón de unión a los tubos que contienen los gránulos de resina utilizando una pipeta para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos mientras se agita a 1200 RPM. Después de centrifugar durante dos minutos a 2.000 veces G, transfiera el sobrenadante a nuevos tubos.

Después de esto, agregue 150 microlitros de tampón de lavado a cada tubo de resina usando la pipeta para mezclar y comenzar el proceso de lavado. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos mientras se agita a 1200 RPM. Después de centrifugar a 2500 veces G durante dos minutos, transfiera cada sobrenadante al tubo de almacenamiento de sobrenadante correspondiente para completar el lavado.

Repite este proceso de lavado dos veces más. A continuación, agregue 75 microlitros de tampón de elución y mezcle con una pipeta. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos mientras se agita a 1200 RPM.

Centrifugar a 2500 veces G durante dos minutos y transferir cada sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Añadir 75 microlitros de tampón de elución utilizando una pipeta para mezclar y luego repetir la incubación y centrifugación de las muestras. Transfiera cada eluido al tubo correspondiente.

Después de centrifugar el eluido combinado durante dos minutos a 2500 veces G, transfiera cada sobrenadante a un nuevo tubo para asegurar la eliminación completa de la resina. Después de esto, use un concentrador de vacío para secar el eluido durante dos horas a temperatura ambiente. Resuspender los glicopéptidos secos en 15 microlitros de 2%ACN y 05%TFA en agua bidestilada.

A continuación, realice el análisis de espectrometría de masas como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, las proteínas de la MEC del tejido cardiovascular se preparan para la cromatografía líquida, el análisis de espectrometría de masas en tándem de la composición de la MEC, así como el análisis de glicopéptidos indirectos y directos. La estrategia principal se basa en incubaciones secuenciales con cloruro de sodio, SDS y clorhidrato de guanadina, seguidas de análisis de glicopéptidos indirectos o directos.

La eficiencia de la extracción se monitorea en geles de acrilamida bis-tris con tinción de plata para su visualización. De los tres extractos ejecutados, la mayoría de las glicoproteínas de la MEC se encuentran en las alícuotas del clorhidrato de guanadina. Las glicoproteínas ECM están decoradas con cadenas de glicanos glicamina grandes y repetitivas junto con oligosacáridos ligados a N y O cortos y diversos.

La eficiencia de la desglicosilación se observa con la adición de enzimas que digieren los glicanos glicoseminicos y enzimas que se dirigen a oligosacáridos más pequeños ligados a N y O. A continuación, las glicoproteínas se identifican por la presencia de asparaginas desamidadas marcadas con oxígeno 18 dentro de las secuencias NXT o NXS. Aquí se muestra un espectro de masas representativo en tándem de HCD para un péptido de decorina con una asparagina desamidada en la posición dos 11.

A continuación, se utiliza la fragmentación de HCD ETD para analizar el extracto de ECM enriquecido con glicoproteínas. El espectro de masas en tándem ETD permite la caracterización de la composición de glicanos. Una vez dominada, esta técnica debería tomar aproximadamente de dos a tres semanas.

Esta glicoproteómica nos permite explorar la fisiología y la patología de la función de la fibrosis no solo en los cambios en la proteómica, sino también en la composición de los azúcares del pensamiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras para un estudio de glicosilación de proteínas por espectrometría de masas. Aunque este método puede proporcionar información sobre las enfermedades cardiovasculares, también se puede aplicar a otras patologías en volumen fibrosis, como las enfermedades respiratorias o el cáncer.