Glycoproteomics de la matriz extracelular: Un método para el análisis glucopéptidos Intacto El uso de la espectrometría de masas

El objetivo general de este protocolo es analizar la composición de proteínas de la matriz extracelular, incluyendo la identificación de sitios de glicosilación y la caracterización composicional de las formas de los glicoconjugados en tejidos cardiovasculares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el proceso de fibrosis tisular, como cómo la glicoestilación de una matriz estructural afecta la fibrosis tisular durante la enfermedad cardiovascular. La principal ventaja de esta técnica es que, a diferencia de protocolos previos que analizan cambios globales de glicosilación, permite la caracterización de la glicosilación en sitios específicos de proteínas de la matriz estructural, proporcionando una herramienta para estudios mecanicistas de seguimiento más dirigidos.

Las demostraciones de los procedimientos serán realizadas por la Dra. Marika Fava y la Sra. Ferheen Baig de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare todos los tampones de extracción según se describe en el protocolo escrito. A continuación, use un escalpelo para cortar entre 20 y 50 miligramos de tejido en tres o cuatro fragmentos más pequeños de aproximadamente dos milímetros de tamaño.

Coloque el tejido picado en un tubo de 1,5 mililitros y agregue 500 microlitros de PBS frío con hielo. Lave el tejido cinco veces utilizando 500 microlitros de PBS para cada lavado con el fin de minimizar la contaminación por sangre. Transfiera las muestras lavadas a un tubo de 1,5 mililitros con tapa de rosca y agregue un volumen de tampón de cloruro de sodio 10 veces superior al peso del tejido.

Vortexee a velocidad mínima durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, transfiera el extracto a nuevos tubos de centrífuga y centrifugue a 16.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Lave brevemente los pellets de tejido resultantes con tampón fresco de cloruro de sodio.

Después de esto, agregue un volumen de tampón SDS 10 veces el peso del tejido y mezcle mediante vortex a velocidad mínima durante 16 horas a temperatura ambiente. Transfiera el extracto a nuevos tubos de centrífuga y centrifugue a 16.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Lave los pellet resultantes con agua doblemente destilada.

Añada un volumen de tampón de clorhidrato de guanidina cinco veces superior al peso del tejido y vortexee a velocidad máxima durante 72 horas a temperatura ambiente. Transfiera el extracto resultante a nuevos tubos y centrifugue a 16.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Después de cuantificar la proteína, alícuota 10 microgramos a un tubo nuevo para cada muestra, para la evaluación de la ocupación del sitio de glicosilación, y 50 microgramos a un tubo separado para el análisis directo de glicopéptidos.

Añada 10 veces el volumen de etanol a cada muestra e incube durante la noche a 20 grados Celsius. Al día siguiente, centrifugue las muestras a 16.000 × g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet precipitado.

Luego, utilice un concentrador de vacío para secar los pellets durante 15 minutos a temperatura ambiente. Añada 10 microlitros de tampón desglicosilante preparado a cada muestra. Coloque los tubos de muestra dentro de un tubo cónico de 50 mililitros e incube a un ángulo de 45 grados durante dos horas a 25 grados Celsius.

A continuación, aumente la temperatura a 37 grados Celsius e incube durante 36 horas con agitación suave. Después de centrifugar a 16.000 ×g durante un minuto, utilice un concentrador al vacío a temperatura ambiente durante 45 minutos para evaporar el agua. Re_suspenda las muestras secas con 10 microlitros de agua marcada con O-18 que contenga 50 unidades por mililitro de PNGasa F. Incube durante 36 horas a 37 grados Celsius bajo agitación constante, luego realice la digestión con tripsina en solución para todas las muestras y proceda con la purificación en C-18.

Para comenzar, agregue 200 microlitros de metanol a cada pocillo de la placa de centrifugación C-18 para activar la resina. Centrifugue a 1,000 ×g durante un minuto. Luego, agregue 200 microlitros de ACN al 80% y TFA al 0,1% en agua a cada pocillo y centrifugue a 1,000 ×g durante un minuto.

A continuación, agregue 200 microlitros de una solución que contiene 1% ACN y 0,1% TFA en agua a cada pocillo y centrifugue durante un minuto a 1.000 × g. Repita la adición de esta solución y la centrifugación dos veces. Después de esto, cargue las muestras en los pocillos de la placa de centrifugación y centrifugue a 1.500 × g durante un minuto. Recargue el flujo atravesante y repita la centrifugación.

Luego, agregue 200 microlitros de una solución que contiene 1% ACN y 0,1% TFA en agua a cada pocillo y centrifugue a 1500 × g durante un minuto. Repita la adición de esta solución y la centrifugación dos veces. A continuación, agregue 170 microlitros de una solución que contiene 50% ACN y 0,1% TFA en agua a cada pocillo y centrifugue a 1500 × g durante un minuto.

Repita esta adición y centrifugación una vez más. Utilice un concentrador al vacío para secar el eluato combinado a temperatura ambiente durante dos horas. Almacene las muestras secas a 80 grados Celsius hasta que estén listas para usar.

Después de esto, realice un análisis de espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida en las muestras destinadas a la evaluación de la ocupación del sitio de glicosilación. Para las muestras destinadas al análisis directo de glicopéptidos, proceda primero con la etiquetado estándar TMT cero según se describe en el protocolo escrito. Para comenzar, agregue a cada 10 microlitros de muestra etiquetada con TMT cero 50 microlitros del tampón de unión proporcionado.

A continuación, alícuote 50 microlitros de suspensión homogénea de resina de captura de glico a nuevos tubos de 1,5 mililitro y centrifugue durante un minuto a 2500 ×g. Retire el sobrenadante y añada 60 microlitros de la muestra y la solución de tampón de unión a los tubos que contienen los pellet de resina utilizando una pipeta para mezclar. Incube a temperatura ambiente durante 20 minutos agitando a 1200 RPM. Tras centrifugar durante dos minutos a 2000 ×g, transfiera el sobrenadante a nuevos tubos.

A continuación, agregue 150 microlitros de tampón de lavado a cada tubo de resina utilizando la pipeta para mezclar y comenzar el proceso de lavado. Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos agitando a 1200 RPM. Después de centrifugar a 2500 ×g durante dos minutos, transfiera cada sobrenadante al tubo de almacenamiento de sobrenadante correspondiente para completar el lavado.

Repita este proceso de lavado dos veces más. A continuación, agregue 75 microlitros de tampón de elución y mezcle con una pipeta. Incube a temperatura ambiente durante cinco minutos agitando a 1200 RPM.

Centrifugar a 2500 × g durante dos minutos y transferir cada sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Añadir 75 microlitros de tampón de elución utilizando una pipeta para mezclar y luego repetir la incubación y la centrifugación de las muestras. Transferir cada eluido al tubo correspondiente.

Después de centrifugar el eluato combinado durante dos minutos a 2500 ×g, transfiera cada sobrenadante a un tubo nuevo para asegurar la eliminación completa de la resina. A continuación, use un concentrador al vacío para secar el eluato durante dos horas a temperatura ambiente. Reconstituya los glicopéptidos secos en 15 microlitros de ACN al 2% y TFA al 0,5% en agua doblemente destilada.

Luego, realice el análisis por espectrometría de masas según se describe en el protocolo escrito. En este estudio, las proteínas de la matriz extracelular procedentes de tejido cardiovascular se preparan para el análisis por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem de la composición de la matriz extracelular, así como para el análisis indirecto y directo de glicopéptidos. La estrategia principal se basa en incubaciones secuenciales con cloruro de sodio, SDS y clorhidrato de guanidina, seguidas de análisis indirecto o directo de glicopéptidos.

La eficiencia de la extracción se monitorea en geles de acrilamida bis-tris con tinción de plata para su visualización. De las tres muestras analizadas, la mayoría de las glucoproteínas de la MEC se observa en las alícuotas de clorhidrato de guanidina. Las glucoproteínas de la MEC están decoradas con cadenas de glicosaminoglucanos grandes y repetitivas, junto con oligosacáridos N y O-ligados cortos y diversos.

La eficiencia de la desglicosilación se observa con la adición de enzimas que digieren glicanos de glicosaminoglicanos y enzimas que atacan oligosacáridos N y O enlazados más pequeños. Las glicoproteínas se identifican entonces por la presencia de asparaginas desamidadas marcadas con oxígeno 18 dentro de los secuones NXT o NXS. Aquí se muestra un espectro de masas en tándem HCD representativo para un péptido de decorina con una asparagina desamidada en la posición dos 11.

La fragmentación HCD ETD se utiliza entonces para analizar el extracto de ECM enriquecido en glicoproteína. El espectro de masas en tándem ETD permite la caracterización de la composición del glicano. Una vez dominada, esta técnica debería tomar aproximadamente de dos a tres semanas.

Esta glicoproteómica nos permite explorar la fisiología y la patología de la función de la fibrosis, no solo en los cambios en la proteómica, sino también en la composición de los azúcares modificados. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión sobre cómo preparar muestras para un estudio de la glicosilación de proteínas mediante espectrometría de masas. Aunque este método puede proporcionar información sobre enfermedades cardiovasculares, también puede aplicarse a otras patologías con fibrosis, como enfermedades respiratorias o cáncer.