Name: Mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el Estudio de Gut Hormone secreción y Imágenes de células vivas de células enteroendocrinas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células intestinales murinas mixtas para estudiar la secreción de péptidos intestinales y realizar imágenes de células enteroendocrinas en vivo. Este método permite investigar vías de señalización celular.

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GLP-1 inmuno-ensayos se realizaron por el Laboratorio de Ensayo Core bioquímica en el Hospital de Addenbrooke. Este trabajo, a lo largo de los años, ha apoyado por el Wellcome Trust (actualmente subvenciones activas 106262 / Z / 14 / Z y 106263 / Z / 14 / Z) y el Consejo de Investigación Médica (MRC) (subvenciones MRC_MC_UU_12012 / 3 y MRC_MC_UU_12012 / 5).

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por la Universidad de Cambridge y el Bienestar de los Animales de Revisión Ética cuerpo y se ajustaban a los Animales (Procedimientos Científicos) Act 1986 Modificación del Reglamento (SI 2012/3039). 1. Preparación de antemano <ol><li> Colocar una alícuota de matriz de membrana basal (BMM) (~ 200! L) en hielo para descongelar. NOTA: El BMM se solidifica a temperatura ambiente (TA). </li><li> de Pre-caliente 50 ml Dulbecco estéril de alta glucosa medio Eagle modificado (DMEM) (sin adiciones) y ~ 40 ml de medio de cultivo estéril (DMEM de alta glucosa suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina y 0,1 mg / ml de estreptomicina (P / S), y 2 mM L-glutamina) en 50 tubos de centrífuga ml en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> calcio Pre-enfriamiento y tamponada con fosfato salino (PBS) que contiene magnesio. </li><li> Pesar 15 mg de colagenasa (XI bruto), añadir a un tubo de centrífuga de 50 ml y mantenerlo en hielo. <ol><li&gt; PRECAUCIÓN: La colagenasa es perjudicial. Esto causa irritación de la piel (H315) y la irritación ocular grave (H319). Puede provocar síntomas de alergia o asma o dificultades respiratorias si se inhala (H334). Puede causar irritación respiratoria (H335). Use equipo protector personal adecuado, evitar la formación de polvo y evitar la inhalación del polvo. Asegurar una ventilación adecuada. </li></ol></li></ol> 2. Colección de Tejidos <ol><li> Añadir ~ 20 ml de medio L-15 a un tubo de centrífuga de 50 ml y colocarlo en hielo. </li><li> La eutanasia a un ratón por dislocación cervical, u otro método de calendario aprobado 1. NOTA: Intestinal tejido se obtiene típicamente a partir de ratones en un fondo C57BL6. Sin embargo, otros fondos genéticos también se han utilizado por ejemplo 129 / SvEv 15. Experimentos de imagen requieren el uso de ratones indicadores fluorescentes por ejemplo GLU-Venus 1. El tejido se obtiene a partir de ratones adultos (2-6 meses) de ambos sexos. Los ratones se alojaron en individuajaulas con acceso ad libitum a agua y pienso normal LLY-ventilado. Sin embargo, los experimentos para probar el efecto de una dieta alta en grasas, por ejemplo, en función de las células enteroendocrinas 16 puede llevarse a cabo si es compatible con una licencia de proyecto. </li><li> Diseccionar y eliminar suavemente intestino de ratón (de píloro para comenzar de recto) utilizando fórceps y tijeras de disección. Almacenarlo en medio L-15 en hielo hasta que esté listo para su uso. </li></ol> 3. Preparación del tejido <ol><li> Coloque el tejido intestinal en una placa de Petri de 10 cm que contiene suficiente PBS para cubrir el tejido. Tomar 10 cm de tejido deseado (por ejemplo, intestino delgado superior, los mejores 10 cm, distales al píloro). </li><li> Enjuague contenido intestinal utilizando una pipeta Pasteur de plástico y enfriado PBS. <ol><li> El uso de pinzas, delicadamente agarre un extremo del segmento intestinal y coloque la punta de una pipeta Pasteur en ella. Enjuague contenidos con PBS enfriado. Repetir desde ambos extremos hasta que el majodad de los contenidos ha sido purgada. Transferencia a una placa de Petri que contiene limpio fresco refrigerado PBS. </li></ol></li><li> El uso de pinzas, extraer el tejido adiposo y el mesenterio, teniendo cuidado de no salga de la capa de músculo al mismo tiempo. </li><li> Peel la capa muscular off &quot;como un calcetín&quot; bajo un microscopio de disección usando dos conjuntos de pinzas finas. NOTA: Este paso no es esencial, pero es muy recomendable. Hay maneras alternativas de eliminación de la capa muscular a la descrita aquí. Por ejemplo, el intestino se puede cortar abierto longitudinalmente primero, antes de la eliminación de la capa muscular. <ol><li> Encontrar un punto de partida en el extremo más proximal del tejido donde hay una aleta visible del músculo. Tire suavemente de distancia una pequeña cantidad de capa muscular todo el camino alrededor del intestino. NOTA: Para evitar el desgarro de la capa muscular o el epitelio intestinal, reducen la fuerza de tensión por apriete una superficie más grande en lugar de utilizar la tips de las pinzas finas. </li><li> Sujetar el intestino y la mayor cantidad de colgajo de músculo como sea posible, tire suavemente aparte y empezar a despegar la capa muscular de todo el intestino. Para evitar que se rompa tanto la capa muscular y el epitelio, mantener el reajuste de la posición de los fórceps para mantenerlos juntos. De esta manera, eliminar la capa muscular de toda la longitud del segmento intestinal y descarte. </li></ol></li><li> Cortar el intestino abierto longitudinalmente y lavado por agitación en una placa de Petri limpia, con fresco refrigerado PBS. Repetir si es necesario para eliminar cualquier quimo o moco restante. </li><li> Tejido de carne con una hoja de bisturí quirúrgico para lograr cuadrados de ~ 1-2 mm 2 y añadir estos a ~ 20 ml PBS enfriado en un tubo de centrífuga de 50 ml utilizando una pipeta Pasteur. Para evitar piezas de tejido se pegan a la pipeta, cortar la punta y mojar la pipeta triturando con PBS. </li><li> Agitar suavemente el tubo para lavar adicionalmente las piezas de tejido. Permitir que el tejido se asiente y vierta o pipette de la mayoría de la PBS y repetir con PBS fresco hasta que el PBS se ve claro. </li></ol> 4. Preparación de la placa / placas revestidas-BBM y la digestión Medium NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en una campana de cultivo de tejido (con pasos de incubación en 37 ° C baño de agua). <ol><li> Preparar una solución de BMM 2% en DMEM enfriado (sin adiciones). Durante el trabajo, mantener la solución en hielo. Para una solución de 2%, añadir 140 l descongeló BMM a 7 ml de DMEM (suficiente para preparar una única placa de 24 pocillos). <ol><li> Añadir 250! L 2% de solución de BMM por pocillo (placa de 24 pocillos) o por vaso plato de formación de imágenes inferior. </li><li> Incubar placas recubiertas / platos durante al menos 30 min en una incubadora a 37 ° C para permitir la polimerización adecuada de la BMM. </li></ol></li><li> Añadir la DMEM 50 ml pre-calentado (sin adiciones) a la colagenasa 15 mg (de los pasos 1.2 y 1.4) para formar una solución 0,3 mg / ml y se invierte para disolver. <ol><li> Ence completamente disuelto, utilizando una jeringa de 20 ml, se filtra la solución de colagenasa a través de un filtro estéril de 0,2 micras en una nueva estéril de 50 ml tubo de centrífuga. Etiquetar esto como el medio digestión. </li></ol></li></ol> La digestión 5. Tejido <ol><li> Retire las piezas de tejido de la PBS usando una pipeta serológica ml 10 y añadir a un tubo estéril de 50 ml de centrífuga que contiene DMEM estéril enfriada (sin adiciones), remolino y luego eliminar DMEM. NOTA: Para evitar el tejido se pegue a la pipeta serológica, mojó por trituración con DMEM antes del contacto con el tejido. </li><li> &#39;Digest 1 y 2: Eliminación de residuos celulares y células individuales <ol><li> Añadir 7 medio digestión ml a las piezas de tejido y dar al tubo de un remolino. </li><li> Incubar durante 5 min en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Agitar suavemente (no agitar) el tubo durante ~ 3 s. </li><li> Permitir que el tejido se asiente y desechar el medio de digestión, reservando unapequeño volumen para ser evaluada bajo el microscopio. NOTA: Especialmente cuando se inicia, es muy recomendable para inspeccionar un pequeño volumen de cada &#39;digerir&#39; (~ 30 l) bajo el microscopio para medir el progreso del proceso de la digestión. Si se observan muchas criptas en esta etapa, el temblor puede ser demasiado vigorosa. Para las imágenes representativas de los diferentes estadios lo &#39;digest&#39; tienen la apariencia típica, consulte la Figura 1. </li><li> Repita los pasos 5.2.-5.2.4 (con medio fresco digestión). </li></ol></li><li> &#39;&#39; Las digestiones 3 a 5: La colección de fragmentos de las criptas <ol><li> Añadir 7 ml medio de digestión de los tejidos. </li><li> Incubar durante 10 min a 37 ° C. <ol><li> Durante la incubación, agitar cada 5 minutos durante 10-12 s. NOTA: El temblor es más vigoroso que el temblor de &#39;digiere&#39; 1 y 2. </li></ol></li><li> Permitir que el tejido no digerido se asiente y recoger el medio de digestión en un tubo de centrífuga de 15 ml. Sitejido se recoge accidentalmente junto con el medio, deje que se asiente, quitar usando una pipeta serológica de 10 ml y transferir de nuevo al tubo de centrífuga de 50 ml que contiene el tejido no digerido. </li><li> Centrifugar recogió el medio / sobrenadante a TA durante 3 min a 100 x g. </li><li> Descartar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en 5 ml de medio de cultivo pre-calentado por trituración suave y dejar de lado. </li><li> Inspeccionar un pequeño volumen de la suspensión celular bajo el microscopio (véase la Nota de la Etapa 5.2.4). NOTA: Lo ideal es que los fragmentos de las criptas comienzan a aparecer en &#39;digerir&#39; 3 junto con los restos celulares y células individuales. &#39;Digests&#39; 4 y 5 contienen un número significativamente mayor de fragmentos de cripta con los restos celulares reducida (Figura 1). Ajuste agitación intensidad como necesario, es decir si el tejido no está digiriendo y fragmentos de las criptas no aparecen, agitar con más fuerza. </li><li> Repita los pasos 5.3.1-5.3.6 hasta 5 &#39;digiere&#39; han sidocompletado o hasta que la mayoría del tejido se ha digerido (a 6º de digestión puede ser necesaria). </li><li> Una vez que todos los sobrenadantes de &#39;digiere&#39; 3-5 (o 3-6) se han recogido, se centrifuga la sobrenadantes digieren a TA durante 3 min a 100 x g. </li><li> Para los experimentos de secreción, se combinan los sobrenadantes de &#39;digiere&#39; 3-5 (o 3-6) antes de la centrifugación. NOTA: Se necesita menos tejido para experimentos de imagen, por lo tanto elegir el sobrenadante de digestión que es el más limpio (ausencia de restos de células y las células individuales) con el mayor número de fragmentos de las criptas. Esto es típicamente &#39;digerir&#39; 4 o 5. </li><li> Descartar el sobrenadante y suavemente volver a suspender el sedimento por trituración hasta que no hay grumos son visibles. Vuelva a suspender el sedimento en medio de cultivo pre-calentado suplementado con 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 (para evitar la anoikis 17). Usar 5 ml para los experimentos de secreción y 2 ml de medio de cultivo para los experimentos de formación de imágenes. </li><li> Filtrarsuspensión de células a través de un filtro de 100 mm (para eliminar cualquier tejido no digerido). Ejecutar un más 2 ml de medio de cultivo pre-calentado a través del filtro para lavar (volumen total: 7 ml y 4 ml para la secreción y formación de imágenes, respectivamente). NOTA: El filtrado no es esencial, sin embargo, los fragmentos de tejido más grandes no tienden a adherirse a la placa / platos. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> Figura 1: Imágenes representativas de &#39;digiere&#39; de método de cultivo intestinal pequeña primario. (A) material típico de &#39;digiere&#39; 1 y 2 que contiene principalmente células individuales y los restos celulares. (B) Un ejemplo de productos de &#39;digerir&#39; 3. Las flechas negras indican fragmentos de las criptas que aparecen en el material de digerir. (C) típica de &#39;digerir&#39; 4 o 5. Panel (D) representa agruparon digerir el material de&#39;digiere&#39; 3-5 pasa a través de un filtro de 100 micras para eliminar los fragmentos de tejido no deseados más grandes observados en (C). Todas las imágenes fueron tomadas usando un microscopio invertido digital con un objetivo 20X. Barras de escala = 100 m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 6. culturas Chapado intestinal (enriquecidos para células de las criptas) <ol><li> Eliminar el exceso de solución de BMM de plato o platos, y añadir 250! L de medio de cultivo pre-calentado por la secreción también. NOTA: Proyección de imagen platos se dejan sin medio así que vaya al siguiente paso con rapidez para evitar que el plato se sequen. </li><li> Plate 250! L de suspensión de células por pocillo (placa de 24 pocillos) o por vaso plato inferior. <ol><li> Plate gota a gota en un movimiento lento &#39;zig-zag&#39; a través del pozo. Permitir a fragmentos de las criptas se asienten durante ~ 5 min antes de mover la placa a the incubadora. NOTA: Este debe fomentar una distribución uniforme de las criptas / células dentro del pozo. </li></ol></li><li> Incubar la placa o platos durante la noche a 37 ° C y 5% de CO2. NOTA: Una monocapa &#39;irregular&#39; debería haber formado. Para una imagen representativa de las culturas Después de tres lavados, véase la Figura 2A. </li><li> platos de imagen &#39;inundación&#39; con 2 ml de medio de cultivo pre-calentado por plato. NOTA: Estos platos serán adecuadas para obtener imágenes de hasta ~ 72 h después de chapado. culturas colon suelen durar más tiempo, hasta 7 días. Las células que no se han adherido pueden ser eliminados por una etapa de lavado. Los cultivos primarios son ahora listo para ser utilizado para los experimentos. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe el aislamiento y cultivo de células del intestino delgado murino mixtos para permitir el estudio de la secreción de péptido intestinal y formación de imágenes de células individuales de células enteroendocrinas etiquetados. Para aumentar la probabilidad de los pequeños cultivos intestinales tener éxito, es importante que el protocolo se lleva a cabo lo más rápidamente posible (idealmente, a menos de 3 h de cosechar el tejido) y que el tejido se mantiene en un medio enfriado con hielo o tampón antes con el proceso de la digestión, para limitar la muerte celular. Si bien no es esencial, especialmente para culturas del colon, se recomienda encarecidamente la eliminación de la capa muscular en el intestino delgado. El protocolo de cultivo del intestino delgado se ha normalizado tanto como sea posible. Sin embargo, es importante tener en cuenta que ningún proceso de digestión es idéntico. Hay muchos pasos durante este protocolo donde la variabilidad se puede introducir en una base de día a día por ejemplo, el grado de eliminación de músculo, el tamaño de tél &#39;picada&#39; piezas de tejido, la fuerza de agitación, la potencia de un lote particular de colagenasa etc. Es por lo tanto, de suma importancia para inspeccionar alícuotas de cada uno de los diferentes &#39;digiere&#39; bajo el microscopio para evaluar el progreso del proceso de digestión y adaptar la agitación y el número de consecuencia &#39;digiere&#39;. Se recomienda agitar con más suavidad, para empezar y, en caso de restos de la cripta no son evidentes a partir de &#39;digerir&#39; 3 en adelante, para empezar a temblar con más fuerza. A partir de nuestra experiencia, las células neuroendocrinas no proliferan en cultivo y por lo general se pierden de pequeños cultivos intestinales dentro de 4 días. Sin embargo, esto permite el tiempo suficiente para llevar a cabo experimentos de secreción de péptido intestinal (típicamente lleva a cabo durante 2 h, 18-24 h después de la galvanoplastia) para probar estímulos fisiológicos y / o agentes farmacológicos. Los experimentos que requieren una incubación durante la noche antes del experimento secreción también son factibles por ejemplo,en el caso de pre-tratamiento con toxina pertussis 15. La técnica de cultivo primario que se presenta aquí es un método bien establecido, como lo demuestra el volumen de producción de la investigación que se ha producido en los últimos años. El modelo de cultivo primario se ha utilizado para estudiar la secreción de una variedad de péptidos intestinales, incluyendo GLP-1 1, GIP 18 y PYY 19, en respuesta a diversa de nutrientes y no nutrientes 14, 20 estímulos e inhibidores. Además, la misma técnica se ha aplicado con éxito para el cultivo de células intestinales humanas 21. A menudo, una combinación del método de cultivo celular primario junto con un modelo experimental adicional, por ejemplo. ex vivo o in vivo pueden proporcionar la mayor penetración 6. En particular y en contraste con otros métodos, esta técnica tiene imaplicaciones portantes más allá de la medición de la liberación de péptido intestinal. Hemos demostrado que pequeños cultivos intestinales primarios derivados de reportero ratones transgénicos son herramientas poderosas para el interrogatorio de vías de señalización intracelular acoplados a destripar la secreción del péptido, usando por ejemplo los sensores de AMPc Ca 2 + y, GCaMP3 11, 13 y Epac2camps 14, respectivamente, así como técnicas electrofisiológicas 12. Como con todos los modelos in vitro, los cultivos intestinales primarias tienen ciertas limitaciones inherentes, incluyendo la pérdida de la polaridad de las células epiteliales en cultivo, así como la pérdida de suministro de sangre y la inervación. Es difícil estimar el impacto potencial de estas condiciones artificiales en la función de las células enteroendocrinas. Sin embargo, los datos obtenidos a partir de cultivos primarios a menudo han sido traducible en el in vivo setting (por ejemplo, efectos de los ácidos grasos de cadena corta en GLP-1 secreción 15). Los cultivos primarios intestinales son una técnica versátil con muchas aplicaciones potenciales. Ya han proporcionado una visión mecanicista importante en la regulación de la secreción del péptido intestinal.

El objetivo general de este método consiste en aislar y cultivar células intestinales mixta murinos para permitir el estudio de la secreción del péptido intestinal y imágenes de células vivas de las células neuroendocrinas. Una primera versión de este procedimiento se publicó originalmente en 2008 por Reimann et al. 1 y desde entonces ha formado la base de otras 20 publicaciones de nuestro grupo. Para este manuscrito, se optó por centrarse en pequeños cultivos intestinales, ya que son más difíciles de establecer que las culturas del colon. Células enteroendocrinas secretan una gran variedad de péptidos intestinales incluyendo péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), dependiente de la glucosa péptido insulinotrópico (GIP), colecistoquinina (CCK) y el péptido YY (PYY) 2. Estos péptidos intestinales tienen importantes papeles fisiológicos en la orquestación de las respuestas posprandial como la ralentización de tránsito intestinal, la potenciación de la liberación de insulina estimulada por la glucosa y la inducción de saciedad. GLP-1 miméticos unand fármacos que inhiben su degradación actualmente tienen licencia para el tratamiento de diabetes tipo 2 y hay evaluación continua del potencial terapéutico de la estimulación de la secreción endógena de este péptido 3. Una mejor comprensión de la fisiología enteroendocrina y los mecanismos por los que la secreción es ya sea estimulado o inhibido es, por lo tanto, de importancia crítica. Gut secreción del péptido puede ser estudiada usando una variedad de in vitro y ex vivo modelos experimentales, cada uno con ventajas y desventajas (para una revisión integral reciente también cubre el uso de modelos in vivo ver Svendsen et al. 4). Técnicas ex vivo tales como el intestino 5 y cámaras de Ussing aislados y perfundidos 6 Actualmente se están utilizando para explorar la secreción de péptido intestinal en respuesta a varias sustancias. La principal ventaja de estos métodos, comoen comparación con los cultivos primarios, es que el entorno inmediato de las células enteroendocrinas permanece en gran parte intacta y de manera importante, se conserva la polaridad de las células. Por lo tanto, es posible obtener información con respecto a qué celda superficie un secretagogo está actuando en 6. Sin embargo, estos son típicamente técnicas de bajo rendimiento y la calidad de los datos derivados de ellos depende en gran medida de la integridad y viabilidad del tejido intestinal, lo que inevitablemente disminuirá con el tiempo. Organoides intestinales ahora están siendo cada vez más utilizados como modelos in vitro para el estudio de la función celular enteroendocrina y desarrollo 7. Organoides, que pueden ser derivados de ambos murino y el tejido humano, tienen la ventaja de formar estructuras &#39;cripta-como&#39; 3D que mantienen la polaridad celular en cultivo. Sin embargo, las células enteroendocrinas-organoides derivados tienen todavía que ser completamente caracterizados y su similitud con L cel nativols sigue siendo en gran parte desconocido. Los cultivos primarios tienen la ventaja de ser un paso más cerca de la configuración fisiológica, como células enteroendocrinas no se mantienen y se diferencian en condiciones artificiales para períodos prolongados de tiempo. Un método de cultivo primario alternativo que ha sido empleado para la evaluación de la secreción de péptido intestinal es el aislamiento de las células intestinales de rata fetal (SCIIF) 8. Sin embargo, la cultura de tejido intestinal de adultos se ha reunido con menos éxito y se han observado algunas diferencias en la capacidad de respuesta de SCIIF vs células intestinales murinos adultos (por ejemplo, glucosa 8). Líneas celulares Enteroendocrinas-como (por ejemplo GluTAG, STC-1 y NCI-H716) se han utilizado tradicionalmente para distinguir directo vs. efectos indirectos sobre las células enteroendocrinas y para diseccionar los mecanismos moleculares subyacentes de acoplamiento estímulo para la secreción; ver Kuhre et al </em&gt;. 9 para la producción de péptido y la secreción por las líneas celulares inmortalizadas &#39;similares a células L&#39;. Esto ha sido necesario como células neuroendocrinas, dispersos a lo largo del tracto gastrointestinal, constituyen menos del 1% de las células epiteliales intestinales 10 y células clasificadas, en nuestras manos, no sobreviven en la cultura 1. Las líneas celulares se mantienen herramientas útiles debido al hecho de que son una población de células en gran medida homogénea que es propicio para manipulaciones genéticas tales como la silenciación del gen. En consecuencia, es fácil para investigar el papel de las proteínas que no se pueden orientar farmacológicamente, cuando los ratones transgénicos no están disponibles. Sin embargo, las líneas celulares no siempre son modelos válidos de células primarias. Si bien hay muchas similitudes, los resultados de los cultivos primarios en ocasiones han resaltados diferencias en las vías de señalización activadas por ciertos nutrientes en las células L primaria en comparación con células GluTAG, por ejemplo (por ejemplo. Peptonas &lt;SUP = &quot;xref&quot;&gt; 11). Fundamentalmente, en combinación con ratones transgénicos indicadores fluorescentes, el modelo de cultivo primario permite el examen detallado de células enteroendocrinas primarios individuales en el nivel intracelular. Células L etiquetados fluorescentemente en cultivos primarios se han utilizado por nuestro grupo para el parche de sujeción 1, 12 estudios, y de una sola célula de calcio 11, 13 y de formación de imágenes monofosfato-FRET de adenosina cíclico 14 estudios, que han dado avances significativos en el campo de enteroendocrina fisiología. El siguiente protocolo se ha optimizado para la realización de experimentos de secreción, utilizando una placa de 24 pocillos o para la preparación de hasta 16 platos de formación de imágenes, a partir de una sección de 10 cm del intestino delgado a partir de un solo ratón adulto. El protocolo puede ser modificado fácilmente para el estudio de las células del colon mediante el aumento de los tiempos de digestión y coconcentración llagenase.

<table><tbody><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Costar</td><td>3524</td><td>Para experimentos de secreción</td></tr><tr><td>Bombesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4272</td><td>Control positivo (experimento de imagen de calcio)</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, 15 mL, estériles</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td>Para la preparación/digestión de tejidos</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, 50 mL,</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430828</td><td>Para la preparación/digestión de tejidos</td></tr><tr><td>Colagenasa XI (cruda)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>Para la composición del medio de digestión</td></tr><tr><td>Espejo dicroico</td><td>Cairn</td> <td>Research-Para</td> <td>experimentos de imagen</td></tr><tr><td>DMEM Glucosa alta (4500 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6546</td><td>Para disolver matrigel (mantener a 4 & deg; C). Para preparar el medio de digestión, precalentar a 37 ° C.</td></tr><tr><td>Filtro de emisión (ancho de banda 510-560 nm)</td><td>Cairn</td> <td>Research-Para</td> <td>experimentos de imagen</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>Para la confección de medio de cultivo</td></tr><tr><td>Pinzas/Pinzas</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT520</td><td>Para disección/extracción del intestino</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td>Control positivo (experimento de secreción)</td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio (35 mm)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Para experimentos de imagen Pinza</td></tr><tr>de<td>alta precisión (110 mm)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>3480641 (5 SA)</td><td>Para eliminar la capa muscular</td></tr><tr><td>Cámara CCD digital de alta resolución</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-ER</td><td>Para experimentos de imagen</td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Control positivo (experimento de secreción)</td></tr><tr><td>L-15 Medio (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Para la recolección de tejido, mantener en hielo</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Para la confección del medio</td></tr><tr><td>de cultivo Matrigel&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Matriz de Membrana Basal, para el recubrimiento de placas y platos</td></tr><tr><td>MetaFluor&nbsp;</td><td>Dispositivos moleculares (suministrados por Cairn Research)</td><td>-Software de imágenes de</td> <td>relación de fluorescencia</td></tr><tr><td>Ratones (C57BL6)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>C57BL/6J</td><td>Ratones de fondo utilizados para la cría. También se puede utilizar para experimentos de secreción</td></tr><tr><td>Ratones (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td><td>en</td> <td>casa-Para</td> <td>experimentos de imágenes y secreciones de calcio</td></tr><tr><td>Microscopio (EVOS XL Core)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>Para fotomicrografías de cultivos</td></tr><tr><td>Microscopio&nbsp;</td>Microscopio invertido <td>Olympus</td><td>IX71</td><td>con objetivo de aceite 40X utilizado para experimentos de imagen</td></tr><tr><td>Monocromador</td><td>Cairn</td> <td>Research-Para</td> <td>experimentos de imagen</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4234</td><td>Para la limpieza</td></tr><tr><td>de tejidos PBS que contienen Ca2+ y Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>Para lavar pañuelos, mantener en hielo</td></tr><tr><td>Penicilina & Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Para la confección de placas</td></tr> de <tr><td>Petri de medio de cultivo (100 mm x 20 mm)</td><td>Corning</td> CLS430167 <td>Para la limpieza de tejidos y la eliminación de la capa muscular</td><td>Cloruro</td></tr><tr><td>de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td>Control positivo (experimento de imágenes de calcio)</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT554</td><td>Para disección/extracción de intestino</td></tr><tr><td>Filtro de células estériles 100 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>Para filtrar la suspensión de células de cripta antes de la colocación en placas</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí quirúrgico n.º 22 (estéril, inoxidable)</td><td>Swann Morton</td><td>0308</td><td>Para cortar tejidos en cubitos</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa, Minisart NML (0,2 y micro; m tamaño de poro)</td><td>Sartorius</td><td>16534-K</td><td>Para solución de colagenasa esterilizadora por filtro (medio de digestión)</td></tr><tr><td>Jeringas, 20 mL, desechables, estériles, Luer slip</td><td>BD 300613</td><td></td><td>Para solución de colagenasa esterilizadora por filtro (medio de digestión)Lámpara de</td></tr> <tr><td>arco de xenón 75W</td><td>Cairn Research-Para</td><td></td> <td>experimentos de imagen</td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato Tocris</td><td></td><td>1254</td><td>Inhibidor de ROCK, prepare 10 mM de solución madre en agua estéril (use 1:1,000 en el medio de cultivo final)</td></tr></tbody></table>

mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el estudio de gut hormone secreción y imágenes de células vivas de células enteroendocrinas

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

El intestino es el mayor órgano endocrino del cuerpo, con las células enteroendocrinas secretoras de hormonas situados a lo largo de la longitud del epitelio gastrointestinal. A pesar de su importancia fisiológica, las células enteroendocrinas representan sólo una pequeña fracción de la población de células epiteliales y en el pasado, su caracterización ha presentado un reto considerable que resulta en una dependencia de los modelos de línea celular. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento y cultivo de células del intestino delgado murino mixtos. Estos cultivos primarios se han utilizado para identificar las vías de señalización que subyacen a la estimulación y la inhibición de la secreción de péptido intestinal en respuesta a una serie de nutrientes y neuropéptidos, así como agentes farmacológicos. Además, en combinación con el uso de ratones transgénicos indicadores fluorescentes, hemos demostrado que estos cultivos primarios se convierten en una herramienta poderosa para el examen de las células enteroendocrinas fluorescentemente etiquetado en el ennivel intracelulares, utilizando métodos tales como fijación de parche y de calcio de una sola célula y formación de imágenes cAMP-FRET.

El uso de etapas de digestión de serie permite la obtención de una preparación relativamente limpia de fragmentos de las criptas a ser plateado para los experimentos. Los primeros dos digestiones de eliminar las células principalmente individuales y restos de células a partir del material de digestión (Figura 1A). Durante la tercera digestión, los fragmentos de las criptas aparecen en el material digerido (Figura 1B). Digiere 4 y 5 rendimiento de un mayor número de fragmentos de cripta con un menor número de células individuales (Figura 1C). Filtrar el material reunido de las digestiones 3-5 elimina grandes piezas de tejido no digerido, que pueden ser perjudiciales para el cultivo, la producción de una preparación fragmento cripta limpio (Figura 1D). Después de 18-24 h de cultivo, se observaron monocapas de pequeñas células intestinales primarios (Figura 2A). Utilizando cultivos generados a partir de ratones transgénicos que expresan específicamente la calCIUM sensor fluorescente, GCaMP3, bajo el control del promotor de proglucagón 11, células L son fácilmente identificables y intercaladas dentro de la cultura (Figura 2B). En pequeñas culturas intestinal primaria, compuestos que dirigen el G q -Ca 2 + i y cAMP i dependiente de vías estimulan la secreción de GLP-1 (para la metodología experimento secreción ver Reimann et al. 1). Bombesina (BBS, 100 nM) y co-aplicación de forskolina y 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (F / I, 10? M cada uno) desencadenaron una de 2 y 11 veces, la estimulación de GLP-1 de liberación relativa a basal, respectivamente (Figura 2C). la expresión en células L específico de GCaMP3 permite la identificación de y la supervisión en tiempo real de movilización de calcio en células L individuales. Tanto 100 nM bombesina (BBS) y cloruro de potasio 30 mM (KCl) estimularon aumentos transitorios de calcio intracelular indicativas de la G conocido q &lt;/ sub&gt; - y las vías-electrógenos acoplados en células L primarios (Figura 2D). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> Figura 2: Los datos representativos derivados de pequeños cultivos intestinales primarios. Imágenes de ejemplo de pequeños cultivos intestinales primarias mixtas utilizadas para la secreción (A) y los experimentos de imagen (B) post 24 h de chapado. (A) Imagen tomada de una placa de 24 pocillos, utilizando un microscopio invertido digital con un objetivo 4X. Barra de escala = 500 m. (B) Uso de GLU-Cre x ratones ROSA26 GCamP3, células L en el campo de visión (células verdes) fueron identificadas por la fluorescencia de GCaMP3. La barra de escala representa 50! m. (C) la secreción de GLP-1 se midió en respuesta a la bombesina (BBS, 100 nM) y la forskolina / 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (F / I, 10? M cada uno). Porcentaje GLP-1 secreción se calculómediante la medición de los niveles de GLP-1 en los sobrenadantes y los lisados ​​celulares. Los datos representan las medias ± SEM de n = 3 para cada condición. (D) la fluorescencia GCaMP3 (reflejando calcio citosólico) de las dos células descritas en (B) monitorizados en tiempo real en respuesta a cloruro de potasio (KCl, 30 mM) y BBS (100 nM). formación de imágenes de células individuales se realizó utilizando un microscopio de fluorescencia invertida con un objetivo de inmersión en aceite 40X. GCaMP3 se excita a 475/10 nm, usando una lámpara de arco de xenón de 75 W y un monocromador controlado por software de imágenes de fluorescencia. La emisión se grabó con una cámara digital de alta resolución de dispositivo de carga acoplada (CCD) utilizando un espejo dicroico y un filtro de ancho de banda de 510-560 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe el aislamiento y cultivo de células del intestino delgado murino mixtos. Estos cultivos primarios intestinales permiten la investigación de vías de señalización subyacentes secreción de péptido intestinal usando un número de técnicas.

Mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el Estudio de Gut Hormone secreción y Imágenes de células vivas de células enteroendocrinas

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

El objetivo general de este método es aislar y cultivar células intestinales murinas mixtas para permitir el estudio de la secreción de péptidos intestinales y la obtención de imágenes en células vivas de células enteroendocrinas. Desarrollamos originalmente este método para posibilitar la caracterización in vitro de células enteroendocrinas. Las células enteroendocrinas monitorean el contenido intestinal y regulan la homeostasis corporal.Pero han sido difíciles de estudiar ya que están dispersadas a lo largo del epitelio intestinal. Las calcis descritas aquí son particularmente útiles cuando se combinan con marcado fluorescente genético de las células enteroendocrinas, ya que esto permite el uso de técnicas de electrofisiología de célula individual y de imágenes en células vivas. Quien demostrará el procedimiento será Cheryl Brighton, una becaria posdoctoral en nuestro laboratorio.Para comenzar, transfiera un duodeno de ratón aislado a una placa de Petri de 10 centímetros llena con PBS. Usando pinzas, sujete cuidadosamente un extremo del fragmento intestinal e introduzca la punta de una pipeta de Pasteur en su luz. Luego, enjuague el contenido intestinal con PBS frío.Repita para ambos extremos intestinales hasta que se haya eliminado la mayor parte del contenido. Transfiera el intestino lavado a una placa de Petri limpia llena con PBS frío fresco. Bajo un microscopio estereoscópico, elimine cualquier tejido adiposo y el mesenterio del fragmento intestinal, evitando que se desprenda la capa muscular.A continuación, identifique un colgajo de la capa muscular en el extremo proximal del tejido. Luego, utilizando dos juegos de pinzas finas, retire suavemente una pequeña cantidad de la capa alrededor de todo el intestino. Sujete el intestino y la mayor cantidad posible del colgajo muscular, luego separe con cuidado las capas y comience a desprender la capa muscular alrededor del intestino.Mantenga las pinzas juntas para evitar que se rompa la capa muscular y el epitelio. Retire la capa muscular de toda la longitud del fragmento intestinal. Posteriormente, abra el intestino cortándolo longitudinalmente y transfiéralo a una placa de Petri limpia que contenga PBS frío fresco.Agite el tejido para eliminar cualquier residuo de quimo o moco. Una vez lavado, corte el tejido con una hoja de bisturí quirúrgico para obtener cuadrados de aproximadamente uno a dos milímetros cuadrados. Luego, utilizando una pipeta de Pasteur previamente humedecida con la punta previamente cortada, transfiera los fragmentos obtenidos a un tubo cónico de 50 mililitros lleno con aproximadamente 20 mililitros de PBS frío.Agite suavemente el tubo para lavar adicionalmente los fragmentos de tejido y deje sedimentar el tejido. Una vez que el tejido se haya asentado, aspire la mayor parte del PBS y lave la muestra con PBS fresco una vez más. Para digerir el intestino, utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para transferir los fragmentos de tejido a un tubo cónico estéril de 50 mililitros que contenga DMEM estéril frío, agite suavemente la suspensión, permita que el tejido se asiente y luego retire el medio.Añada 7 mililitros del medio de digestión a los fragmentos de tejido y agite suavemente la suspensión. Incube la suspensión en un baño de agua a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Después de la incubación, agite suavemente el tubo durante aproximadamente tres segundos.Sedimente el tejido no digerido y transfiera el medio de digestión a un tubo cónico de 15 mililitros. Deje que cualquier tejido recolectado accidentalmente se sedimente y, utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros, transfiera este tejido de vuelta al tubo cónico de 15 mililitros que contiene el tejido no digerido. Guarde un pequeño volumen del medio de digestión para la observación microscópica y deseche el resto.Observe el contenido del medio de digestión bajo el microscopio óptico para asegurarse de que la suspensión no contenga muchas críptas. A continuación, agregue 7 mililitros de medio de digestión fresco y realice el procedimiento de digestión una vez más. Para preparar la suspensión de fragmentos de críptas, agregue 7 mililitros de medio de digestión fresco a los fragmentos de intestino.Incube el tejido en un baño de agua a 37 grados Celsius durante diez minutos. Agite la muestra durante más tiempo y con mayor intensidad esta vez, cada cinco minutos. Sedimente el tejido no digerido y transfiera el medio de digestión a un tubo cónico de 15 mililitros.Deje que cualquier tejido recolectado accidentalmente se sedimente y, utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros, transfiéralo de vuelta al tubo centrífugo de 50 mililitros que contiene el tejido no digerido. Añada 7 mililitros de medio de digestión fresco a los fragmentos de intestino e inicie la siguiente digestión. Luego, centrifugue el medio recolectado de la digestión anterior a 100 × g a temperatura ambiente durante 3 minutos.Después de desechar el sobrenadante, re-suspenda el botón celular en 5 mililitros de medio de cultivo precalentado, mediante pipeteo suave. A continuación, deje la muestra aparte y recoja una pequeña alícuota de la suspensión celular. Mediante microscopio de luz, confirme que la muestra contiene fragmentos aislados de criptas.Repita la digestión del tejido otras 2-3 veces o hasta que la mayor parte del tejido haya sido digerida. Una vez recolectados los sobrenadantes de la digestión, combínelos todos y centrifugue la muestra a 100x g a temperatura ambiente durante tres minutos. Descarte el sobrenadante y re-suspenda el sedimento pipeteando suavemente hasta que no sean visibles grumos y agregue 5 mililitros de medio de cultivo precalentado suplementado con 10 micromolar de Y-27632, que previene la anoiquis.Finalmente, filtre la suspensión celular a través de un filtro de 100 micrones para eliminar cualquier tejido no digerido. Lave el filtro con 2 mililitros adicionales del medio de cultivo precalentado suplementado con Y-27632. Antes de sembrar las células, retire la placa recubierta con matriz de membrana basal del incubador.Retire el exceso de solución de matriz de membrana basal de la placa y agregue 250 microlitros del medio de cultivo precalentado suplementado con 10 micromolar de Y-27632 a cada pocillo. Siembre 250 microlitros de la suspensión celular por pocillo de la placa de 24 pocillos, mediante pipeteo gota a gota realizado en un movimiento lento en zigzag. Incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.Se presentan aquí imágenes microscópicas de monocapas de células primarias del intestino delgado obtenidas tras 18 a 24 horas de cultivo. Las células primarias del intestino delgado cultivadas in vitro respondieron a estímulos que elevan el calcio intracelular o el AMP cíclico, lo que resultó en un aumento de dos veces en la liberación de péptido similar al glucagón-1 cuando las células fueron tratadas con bombesina, y un aumento de once veces en la secreción cuando se estimularon simultáneamente con forskolina y IBMX. Finalmente, utilizando cultivos generados a partir de ratones transgénicos que expresan GCAMP 3 bajo el control del promotor del proglucagón, se demostró que las células primarias enteroendocrinas L responden a la estimulación con bombesina y cloruro de potasio mediante un incremento en el calcio citosólico, tal como se observa por la fluorescencia aumentada.El procedimiento demostrado se centra en las células del intestino delgado de cultivo, que muchos laboratorios han encontrado difícil. También utilizamos un procedimiento similar para el cultivo de otros segmentos intestinales, tanto de origen murino como humano. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro horas, si se lleva a cabo correctamente.No hay dos preparaciones iguales, por lo que es importante recordar examinar alícuotas de cada digestión bajo el microscopio. Esto permite evaluar el progreso y ajustar en consecuencia la intensidad de la agitación y el número de digestiones.

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Mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el Estudio de Gut Hormone secreción y Imágenes de células vivas de células enteroendocrinas (Video) | JoVE Journal

Mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el Estudio de Gut Hormone secreción y Imágenes de células vivas de células enteroendocrinas

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