Name: Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como In Vitro Herramienta de detección en la investigación de la audición (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a preparar cultivos de explantes cocleares murinos neonatales para investigación auditiva. Esta técnica permite estudiar células ciliadas, sinapsis y neuronas en un modelo ex vivo, acelerando el screening de compuestos terapéuticos antes de pruebas in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Sordera y otros trastornos de la comunicación subvenciones R01DC015824 (KMS) y T32DC00038 (apoyo SD), el Departamento de Defensa W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fundación Bertarelli (KMS), el Nancy Sayles Day Foundation (KMS) y el Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Damos las gracias a Jessica E. Sagers, BA por comentarios perspicaces sobre el manuscrito.

El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Massachusetts Eye and Ear. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial. 1. Preparación de la disección <ol><li> Preparación de la mesa quirúrgica <ol><li> Use etanol al 70% para desinfectar la mesa quirúrgica. </li><li> Coloque dos almohadillas de preparación no estériles junto al microscopio. </li><li> Prepare la bandeja del instrumento, incluyendo tijeras de operación esterilizadas por calor, una manija de bisturí, un cuchillo micro, y fórceps (dos de cada uno de # 4 y # 55). Coloque la bandeja del instrumento y una placa de petri de 50 mm de paredes claras con fondo de vidrio sobre una almohadilla no estéril. </li><li> Obtenga una cuchilla de bisturí estéril # 15; Una bolsa o recipiente de plástico sellable (para disponer de las canales de acuerdo con las directrices institucionales); Hielo en un cubo; Y solución de sal equilibrada, fría y estéril Hank (HBSS). Coloque estos elementos en elOtra almohadilla no estéril. </li><li> Transfiera el HBSS en un tubo de laboratorio plástico de 50 ml y colóquelo en hielo. </li></ol></li><li> Preparando el cultivo <ol><li> Prepare todos los materiales en una campana de flujo laminar. Por cada cuatro muestras, coloque cuatro tapas de vidrio redondo de 10 mm en autoclave en las cuatro incrustaciones de la placa de Petri de 4 pocillos de 35 mm. </li><li> Para cada 4 muestras, mezcle un volumen total de 300 μL que conste de lo siguiente en un tubo de microcentrífuga: 10 μl de adhesivo tisular, 285 μL de NaHCO3 y 5 μL de NaOH. </li><li> Colocar 45 μL de la solución resultante en cada cubreobjetos y dejarlo allí durante al menos 20 minutos a TA; Esta solución se puede dejar en el cubreobjeto durante varias horas, pero no se puede dejar O / N. </li><li> Coloque una o dos placas Petri de 4 pocillos de 35 mm en una placa de Petri de 10 cm para crear dos barreras contra la contaminación. </li><li> Preparar un medio de cultivo que contenga 98% de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 1% de N - 2 y 1% de ampicilina (65 μL por pocillo en un tubo (micro) centrífugo). Calentar la solución a 25 ° C antes de su uso. </li></ol></li></ol> 2. Dissección del explante coclear murino <ol><li> Decapitación del ratón neonatal <ol><li> Obtenga una placa de Petri de plástico de 60 mm y rocíe 70% de etanol en su tapa para que la superficie esté mojada. </li><li> Vierta HBSS frío del tubo de laboratorio de plástico en la parte inferior del plástico de 60 mm y la placa de petri de fondo transparente de 50 mm de paredes claras. Guarde el tubo de laboratorio de plástico y las dos placas de Petri sobre hielo para mantener el tejido frío siempre que no se esté disectando. </li><li> Coloque un ratón neonatal de edad P3 - P5 sobre hielo en un dedo de corte de un guante de látex y espere hasta que la hipotermia induzca pérdida de conciencia (aproximadamente 1-3 minutos). </li><li> Decapitar el ratón rápidamente con las tijeras de funcionamiento y disponer del cuerpo en la bolsa de plástico sellable. Coloque la cabeza cortada del recién nacido70% de etanol en la tapa de la placa de petri plástica de 60 mm. </li></ol></li><li> Disección macroscópica del hueso temporal <ol><li> Retire la piel del cráneo haciendo un corte superficial desde el extremo anterior al posterior (directamente sobre la sutura sagital) usando la cuchilla del bisturí. </li><li> Cortar ambos canales auditivos externos con la cuchilla del bisturí y doblar la piel anteriormente para exponer el cráneo entero. NOTA: Aunque normalmente no se necesita un microscopio de disección para este paso, se puede utilizar para una mejor visualización. </li><li> Abra el cráneo a lo largo de la sutura sagital usando la cuchilla # 15 del escalpelo. Asegúrese de cortar el cráneo moviendo suavemente la hoja hacia arriba y hacia abajo desde la parte anterior a la posterior para evitar la compresión de las cócleas. NOTA: El cráneo no debe ser osificado a esta edad y debe cortarse fácilmente. </li><li> Retire y deseche el hocico haciendo un corte vertical directamente posterior a las órbitas usando el escalpelo # 15espada. NOTA: La parte posterior del cráneo debe todavía contener el cerebro y las cócleas. </li><li> Deseche el cerebro anterior, el cerebelo y el tronco encefálico mediante disección romo con pinzas # 4. </li></ol></li><li> Extracción microscópica de las cócleas <ol><li> Ajuste el microscopio (ampliación de 6,5X) y la fuente de luz colocando pinzas bajo el alcance y optimizando la iluminación y el enfoque. </li><li> Coloque las dos mitades del cráneo en la placa de petri de plástico de 60 mm llena de HBSS frío. </li><li> Exponga completamente la cóclea, identificable como adyacente a la arteria estapedial circundante (una arteria tortuosa dentro del hueso temporal), y separe sin rodeos el órgano del hueso temporal usando una pinza # 4. </li><li> Transferir la cóclea en la placa de 50 mm, de paredes claras, de fondo de vidrio petri y la posición del plato bajo el microscopio. </li><li> Coloque la placa de petri de 60 mm de plástico con la otra mitad del cráneo sobre hielo. </Li <li> Retire la cóclea del sistema vestibular y disecar cuidadosamente la cápsula otica coclear (típicamente cartilaginosa a esta edad) con una pinza # 4. Utilice fórceps # 55 para todos los pasos adicionales. </li></ol></li><li> Pasos finales del procesamiento de tejidos <ol><li> Continuar con el procesamiento del tejido del oído interno separando cuidadosamente el ligamento espiral adherente al órgano de Corti del resto de la cóclea y el modiolo usando el micro cuchillo o dos fórceps. <ol><li> Corte en el área más oscura y translúcida en la grieta entre el ligamento espiral y la región de la célula del pelo y proceda a la subsiguiente eliminación del ligamento espiral agarrándolo en el aspecto más basal y desenrollándolo suavemente mientras se mueve apical. </li></ol></li><li> Coloque la muestra para obtener una vista longitudinal y sagital de la cóclea y corte la cóclea en dos o tres secciones utilizando el micro cuchillo, clasificando estas secciones como apical, (medio,) ybSe vuelve Quitar el tejido superior e inferior a la capa real de las células ciliadas y neurites con el fin de lograr una pieza de coclear explante que puede colocar horizontalmente en la placa de Petri. NOTA: Un tamaño apropiado para la adhesión estable al plato de cultivo es aproximadamente la mitad de un giro coclear. </li><li> Retire la membrana tectorial, una capa translúcida muy delgada inmediatamente superior al órgano de Corti, suavemente pelándola con fórceps. </li><li> Quitar la membrana de Reissner, inmediatamente superior a los SGN, por tocarla con fórceps en ambos lados y pelar lejos. NOTA: Retire las áreas de las células del cabello dañadas lateralmente localizadas cortándolas con el micro cuchillo. </li></ol></li></ol> 3. Transferencia de especímenes a las placas de cultivo <ol><li> Retire los 45 μl de solución de adhesivo tisular de los cuatro cubreobjetos. Lavar cada cubreobjetos con 50 μl de H 2 O estéril. Aspirar el agua. </li><li> Recoja la pipeta de 1 ml. Humedezca la punta de la pipeta con aproximadamente 120 μL de DMEM para evitar que la muestra se adhiera al interior de la punta. </li><li> Transferir los especímenes individualmente usando la pipeta de 1 ml. Pipetear un máximo de 70 μL de la placa petri pequeña, de paredes claras, de fondo de vidrio y coloque la muestra junto con el líquido en una de las 4 incrustaciones (preparadas con tapas) en la placa de petri de 4 pocillos . </li><li> Compruebe bajo el microscopio (ampliación 50X) que la muestra está en la orientación correcta. Asegúrese de que el área de las células capilares a partir de la cual se retiró la membrana tectorial está orientada hacia arriba. Asegúrese de que la membrana basilar, junto con la parte basal recortada del modiolo, esté orientada hacia abajo y se adhiera al cubreobjetos. <ol><li> Si el espécimen está orientado al revés tras la inspección, deposite el HBSS que permanece en la punta de la pipeta en la incrustación y reposicione la pieza hasta que esté correctamente orientada. NOTE: Esto evitará que las células capilares floten en el medio de cultivo sin el apoyo estructural de la cubreobjetos, lo que podría conducir a la degeneración. </li></ol></li><li> Aspirar el exceso de HBSS usando la pipeta de 1 ml. Espere 15 s. </li><li> Pipetar 60 μL del medio de cultivo caliente preparado (98% de DMEM, 1% de N-2 y 1% de ampicilina) directamente sobre la muestra. Tenga cuidado de no tocar el espécimen con la pipeta. Reemplazar las cubiertas de la placa de petri interior y exterior e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Coloque todas las soluciones madre en sus lugares apropiados, deseche las canales y los residuos residuales, descontaminar la tabla quirúrgica de acuerdo con las directrices institucionales ( por ejemplo, utilizando etanol o hipoclorito), limpiar y esterilizar en autoclave los instrumentos y descartar los objetos punzocortantes en el recipiente apropiado . </li></ol> 4. Adición de medios de cultivo finales y sustancias de interés NOTA: Los explantes cocleares estarán listos para su uso 10-16 h después. <ol><li> Preparar una mezcla(97% de DMEM, 1% de suero bovino fetal (FBS), 1% de N-2 y 1% de ampicilina (65 μL por pocillo en un tubo de microcentrífuga, calentar la solución a 25 ° C antes de su uso). </li><li> Añadir otras sustancias de interés para las soluciones para los grupos de tratamiento respectivos. Si se añaden sustancias fluorescentes ( por ejemplo, los virus que expresan la proteína fluorescente verde (GFP), en una publicación reciente, se utilizó una concentración de 10 10 GC de virus adeno-asociados (AAV) durante 48 h en 50 μl) 18 , ligero. </li><li> Transferir las placas petri que contienen el explante coclear de la incubadora y colocarlas debajo de la campana de flujo laminar. </li><li> Aspirar el medio de cultivo antiguo (sin FBS) con la pipeta de las incrustaciones. </li><li> Añadir 60 μL por pocillo del medio de cultivo caliente (tratamiento) preparado (97% de DMEM, 1% de FBS, 1% de N-2, 1% de ampicilina y las sustancias de interés). </li><li> Coloque la placa de Petri de nuevo en la incubadora (37 ° C). </li><li> Vista rPor ejemplo, bajo el microscopio para identificar signos de contaminación, migración celular o desprendimiento del explante coclear y realizar tinción después de un máximo de 7 días. </li></ol> 5. Inmunofluorescencia - Día 1 <ol><li> Preparar una solución de bloqueo (solución salina tamponada con fosfato al 94% (PBS), suero normal de cabra o caballo al 5% (NGS / NHS, dependiendo de los anticuerpos secundarios) y un 1% de tensioactivo no iónico (véase la tabla de materiales ) (98,6% de PBS, 1% de NHS y 0,4% de tensioactivo no iónico con los respectivos anticuerpos). NOTA: Los anticuerpos incluyen anti-Myo7A de conejo a una concentración de 1: 400+ (miosina 7A, para células ciliadas interiores y exteriores) y ratón anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulina, para SGNs) OR ratón (IgG1) anti 1: 50+ (densidad postsináptica, para postsinapse), y pollo anti - NF - H 1: 1000+ (neurofilamento, proteína de unión c - terminal para presinapse) Para SGNs y fibras nerviosas). MeaNs &quot;o superior.&quot; </li><li> Aspirar el medio de cultivo con una pipeta. Tenga cuidado de no tocar la muestra. </li><li> Bajo la campana de flujo laminar, enjuague los explantes cocleares dos veces con PBS estéril, colocando los especímenes en un agitador durante 5 min después de cada lavado. </li><li> Fijar el tejido en 4% de paraformaldehído (PFA - PRECAUCIÓN) durante 20 minutos en el agitador (debajo de la campana). Aspirar la PFA. </li><li> Aplique 60 μL de PBS a los explantes cocleares y coloque la placa de Petri en un agitador durante 5 min. Aspirar el PBS. Repita 3x. </li><li> Colocar los explantes cocleares en una solución de bloqueo preparada (94% de PBS, 5% de NHS y 1% de tensioactivo no iónico) durante 30 minutos en el agitador. </li><li> Colocar los explantes cocleares en una solución de anticuerpo de reserva preparada (98,6% de PBS, 1% de NHS y 0,4% de tensioactivo no iónico) con los respectivos anticuerpos primarios (vórtice antes del uso) O / N en un contador a RT. NOTA: Envuelva las placas de Petri con toallas de papel húmedas envueltas en una envoltura de plástico (o papel de aluminio si la solución agregadaIon contiene materiales fluorescentes tales como virus que expresan GFP) para mantener los platos húmedos y para evitar la evaporación de la solución de anticuerpos O / N. </li></ol> 6. Inmunofluorescencia - Día 2 <ol><li> Preparar la tinción 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (300 nM) y utilizar la solución madre de anticuerpo para obtener las mezclas secundarias de anticuerpos correctas, complementarias de los anticuerpos primarios en la etapa 5.1. ( P. Ej ., Cabra anti-ratón 488 1: 200+ y cabra anti-ratón 568 1: 200+ O cabra anti-ratón (IgG1) 568 1: 1000+, cabra anti-ratón (IgG2a) 488 1: 500+, Y cabra anti-pollo 647 1: 200+ OR Phalloidin 568 1: 200+ (para las células ciliadas interiores y exteriores)). </li><li> Aspirar la solución de anticuerpos primarios. </li><li> Aplique 60 μL de PBS a los explantes cocleares y coloque la placa de Petri en un agitador durante 5 min. Aspirar el PBS. Repita 3x. </li><li> Colocar los explantes cocleares en solución madre de anticuerpo preparada (98,6% de PBS, 1% de NHS y 0,4% de tensioactivo no iónico) con la res(Vórtice antes del uso) durante 1,5 h en un mostrador y protegerse de la luz. </li><li> Aspirar la solución de anticuerpos secundarios y enjuagar los explantes cocleares con una tinción DAPI (colocar en un agitador durante 1 min y luego aspirar). </li><li> Aplique 60 μL de PBS a los explantes cocleares y coloque la placa de Petri en un agitador durante 5 min. Aspirar el PBS. Repita 3x. </li><li> Use una pinza para quitar cubreobjetos con muestras de la placa de 4 pocillos, sumerja en un recipiente lleno de H2O destilada y seque los cubreobjetos poniéndolos en contacto vertical con las toallas de papel. </li><li> Coloque una gota de medio de montaje antifade en el portaobjetos del microscopio e invierta los cubreobjetos para sumergir el tejido hacia abajo en el medio. </li><li> Selle el cubreobjetos utilizando un esmalte transparente que cubre circunferencialmente el borde (sin aplastar el espécimen debajo del cristal). Deje las diapositivas acostadas en un área cubierta lejos de la luz durante 15 - 20 min hasta que se sequEn lugar de ellos en una caja o examinar bajo el microscopio confocal. NOTA: La tinción fluorescente se conserva mejor almacenando los portaobjetos a 4 o -20 ° C. </li></ol> 7. Imágenes confocales <ol><li> Obtenga una visión general y imágenes ampliadas para el órgano de la región de Corti, incluyendo neuritas y SGNs. NOTA: Ajustes estándar para el proceso de imagen: Formato de 1.024 x 1.024 píxeles, velocidad de 400 Hz, promedio de fotogramas de 3, 20% de intensidad total del láser y, usualmente, lentes de 20X y 63X con inmersión en aceite (potencialmente combinado con zoom digital de 2X). Los ajustes de canal para el protocolo de tinción DAPI, Myo7A y TuJ1 se describen anteriormente: 405 5% DAPI, &quot;Smart Gain&quot; 766,8V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 488 15% isotiocianato de fluoresceína (FITC), &quot;Smart Gain&quot; 622.2V , &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 561 13% de isotiocianato de tetrametilrhomadina (TRITC), &quot;Smart Gain&quot; 562,4V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0%. </li><li> Combina las imágenes en una pila z con laSoftware para obtener una proyección del eje z. </li></ol>

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<li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los investigadores deben perfeccionar la técnica de disección antes de llevar a cabo experimentos relacionados con explantes cocleares. Las células ciliadas son comúnmente dañadas durante las disecciones realizadas en las primeras etapas de la curva de aprendizaje, y un momento particularmente problemático para su integridad es la eliminación de la membrana tectorial, que requiere manos estables, herramientas adecuadas y experiencia. Para ahorrar tiempo y recursos, se debe realizar un control visual bajo el microscopio ...

La Pérdida Auditiva Sensorineural (SNHL) refleja daños en el oído interno o en la vía auditiva ascendente. Mientras que la pérdida auditiva es el déficit sensorial más común en los seres humanos 1 , las terapias curativas aún no existen 2 . Aunque los implantes cocleares o auditivos del tronco encefálico pueden restaurar un cierto grado de audición a los pacientes con SNHL severa a profunda, la audición proporcionada por estos dispositivos sigue siendo muy diferente de la audición &quot;natural&quot;, especialmente durante los intentos de entender el habla o escuchar música. Si bien la degeneración de las células ciliadas se ha considerado durante mucho tiempo como la consecuencia primaria de los eventos auditivos traumáticos ( por ejemplo, la exposición a ruidos fuertes), existe una creciente evidencia de que las sinapsis que transmiten información de las células capilares al nervio auditivo son al menos tan vulnerables al trauma acústico 3 , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 . Dado que los umbrales audiométricos humanos, el patrón oro actual para la evaluación de la función auditiva, no predicen daño celular específico en el oído interno, se necesitan herramientas más refinadas para detectar la degeneración celular lo antes posible e iniciar un tratamiento adecuado 7 . Los tratamientos farmacológicos prometedores para la pérdida auditiva se prueban a menudo en cultivos celulares homogéneos in vitro , pero estos sistemas no modelan con precisión el microambiente coclear. Se sabe que las células cocleares segregan factores tróficos que influyen en otros tipos de células dentro de la cóclea 8 , 9 , un proceso crucial in vivo que se pierde cuando el órgano de Corti 10 , 11 o neuronas ganglionares espirales (SGN) 12 se cultivan en aislamiento o cuando Se analizan marcadores molecularesSin embargo, los estudios in vivo que pueden ser necesarios para la validación de datos in vitro para establecer nuevos tratamientos personalizados para la pérdida auditiva en la búsqueda de &quot;medicina de precisión&quot; requieren recursos y tiempo significativos, lo que es especialmente relevante cuando se considera Cuánto esfuerzo se requiere para perfeccionar y realizar las inyecciones de membrana de oído medio o de ventana redonda con pruebas auditivas y la subsiguiente disección de monturas cocleares enteras El cribado eficiente de compuestos prometedores en cultivos organotípicos ex vivo conocidos como explantes cocleares proporciona una alternativa económica y confiable 14 , 15 , 16 , 17 . Este artículo detalla un protocolo para generar, mantener y evaluar explantes cocleares tratados. Se destacan las aplicaciones específicas para este modelo, incluyendo su uso en elDe compuestos potencialmente terapéuticos y la evaluación comparativa de vectores virales para la terapia génica. Un ex vivo explante enfoque permite a los investigadores para visualizar los efectos de un determinado tratamiento en diferentes poblaciones celulares in situ , lo que facilita la identificación de los tipos de células específicas de los mecanismos y el posterior perfeccionamiento de la terapéutica objetivo. En general, esta técnica proporciona un modelo para estudiar la cóclea ex vivo, a la vez que preserva vital cruce entre los diferentes tipos de células que coexisten dentro de la cóclea.

<table><tbody><tr><td>Ampicilina, sal de sodio</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-CtBP2, ratón (IgG1)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Myo7A, conejo</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-NF-H, pollo</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-PSD95, ratón(IgG2a)</td><td>Anticuerpos Inc.</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-TuJ1 de ratón,</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak de ratón Adhesivo para células y tejidos, 5 mg</td><td>Tubos de</td> centrífuga Corning <td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR de 15 mL, fondo cónico, graduación, estéril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Placa de cultivo celular, 100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Plato de cultivo celular, 35 x 10 mm, 4 anillos interiores</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Plato de cultivo celular, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Tubos de centrífuga, fondo cónico, graduación, estéril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas transparente</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio de pared transparente (vidrio de 40 mm), PELCO&reg;, Funda/20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, Redondos, Vidrio, 10 mm de diámetro, Espesor #1, 0.13 - 0.16mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td></td><td></td>260368</tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), alto contenido de glucosa, piruvato, sin glutamina, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzas (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico (EtOH), puro, 200 grados, anhidro, &ge; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L Suero</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovino (FBS), calificado, regiones aprobadas por el USDA, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&nbsp;</td><td>Alícuota en tubos de 50 mL y almacenar en -20&deg; C congelador</td></tr><tr><td>anti-pollo de cabra-647 anticuerpo secundario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón de cabra (IgG)-568 anticuerpo secundario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón de cabra (IgG1)-568 anticuerpo secundario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón de cabra (IgG2a)-488 anticuerpo secundario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo secundario anti-conejo-488 para cabras</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H2O, estéril, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank's (HBSS), calcio, magnesio, rojo sin fenol, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de instrumentos con tapa Acero inoxidable</td><td>Mountainside Medical</td><td>TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>Micro (disección) cuchillo &ndash; angulado 30&deg;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio, VistaVision, codificados por colores, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm de grosor, blanco, paquete de 72</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100X), 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, solución de bicarbonato de sodio al 7,5 %, 100 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, solución de hidróxido de sodio, 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal para caballos (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de operación</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA), grado reactivo, cristalino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Antes de usar: Establezca procedimientos operativos estándar basados en protocolos disponibles en línea</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&nbsp;</td><td>Autoclave antes de su uso</td></tr><tr><td>Faloidina, Alexa Fluor 568&nbsp;</td>Almohadilla de preparación <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>, no estéril&nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 0,5 mL</td><td>Autoclave Eppendorf</td><td>022363719</td><td>antes de usar</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 1,5 mL</td><td>Autoclave Eppendorf</td><td>022363204</td><td>antes de usar</td></tr><tr><td>Hojas de bisturí - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal TCS SP5</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (tensioactivo no iónico)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje antidecoloración VectaShield para fluorescencia</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa con Cremallera, Resellable, 4 x 6'' - 2 mm de grosor</td><td>Zipline 0609132541599</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

técnica de explante coclear murino neonatal como<em&gt; in vitro</em&gt; herramienta de detección en la investigación de la audición

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Aunque ha habido notables avances en la investigación auditiva durante las últimas décadas, todavía no hay cura para la Pérdida de la Audición Sensorineural (SNHL), una condición que típicamente implica daño o pérdida de las delicadas estructuras mecanosensoriales del oído interno. Los ensayos sofisticados in vitro y ex vivo han surgido en los últimos años, permitiendo la selección de un número creciente de compuestos potencialmente terapéuticos, al tiempo que se minimizan los recursos y se aceleran los esfuerzos para desarrollar curas para SNHL. Aunque los cultivos homogéneos de ciertos tipos de células siguen desempeñando un papel importante en la investigación actual, muchos científicos ahora se basan en cultivos organotípicos más complejos de orejas internas murinas, también conocidas como explantes cocleares. La preservación de estructuras celulares organizadas dentro del oído interno facilita la evaluación in situ de diversos componentes de la infraestructura coclear, incluyendo las células ciliadas internas y externas, neuronas ganglionares espirales, neuronasItes y células de soporte. Aquí presentamos la preparación, cultivo, tratamiento e inmunotinción de los explantes cocleares murinos neonatales. La cuidadosa preparación de estos explantes facilita la identificación de mecanismos que contribuyen al SNHL y constituye una herramienta valiosa para la comunidad de investigadores de audición.

Mientras muchos protocolos se centran en el órgano de los explantes de Corti, esta técnica intenta preservar la anatomía de todo el giro coclear, incluyendo los SGN. Esto da a los investigadores la oportunidad de analizar los efectos de un determinado tratamiento en neurites y somata de SGNs además del órgano de Corti. Realizar una disección que conserva parte del modiolo, como se describe aquí, es técnicamente más difícil que explantar el órgano de Corti solo. Sin embargo, la neurita y ...

El objetivo de este protocolo es demostrar la preparación, cultivo, tratamiento e inmunotinción de los explantes cocleares murinos neonatales. La técnica puede utilizarse como una herramienta de cribado in vitro en la investigación auditiva.

Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como<em&gt; In Vitro</em&gt; Herramienta de detección en la investigación de la audición

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

El objetivo general de este procedimiento es la preparación, cultivo, tratamiento y inmunomarcado de explantes cocleares murinos neonatales para su uso como herramienta de cribado in vitro en la investigación auditiva. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación auditiva, como permitir el estudio simultáneo de células ciliadas cocleares, sinapsis, neuritas y neuronas en un modelo ex vivo, y proporcionar información sobre los mecanismos de acción de moléculas nuevas para la cóclea, incluidos factores presentes en secreciones humanas. La principal ventaja de esta técnica es que el proceso de cribado de compuestos terapéuticos candidatos puede acelerarse antes de su evaluación in vivo.Comience con una cabeza de recién nacido recién recolectada, contenida en etanol al 70 % en la tapa de una placa de Petri. Utilice una hoja de bisturí para realizar un corte superficial en la piel desde el extremo anterior hasta el extremo posterior del cráneo. Luego corte ambos conductos auditivos externos y doble la piel hacia delante para exponer todo el cráneo.A continuación, abra el cráneo a lo largo de la sutura sagital moviendo suavemente la hoja del bisturí de delante hacia atrás, de anterior a posterior, para evitar la compresión de la cóclea. Retire y deseche el hocico realizando un corte vertical directamente posterior a las órbitas. La parte posterior del cráneo aún debe contener el cerebro y la cóclea.Luego, utilice 4 pinzas para diseccionar y desechar el prosencéfalo, el cerebelo y el bulbo raquídeo. Coloque las dos mitades del cráneo en una placa de Petri de plástico de 60 milímetros llena con HBSS frío. A continuación, use 4 pinzas para exponer completamente la cóclea, que está adyacente a la arteria estapedial circundante, y separe el órgano de manera roma del hueso temporal.Transfiera la cóclea a una placa de Petri de vidrio transparente de 50 milímetros con fondo de vidrio que contenga HBSS y coloque la placa bajo el microscopio. Coloque la placa de Petri de plástico de 60 milímetros con la otra mitad del cráneo sobre hielo. A continuación, utilice 4 pinzas para diseccionar cuidadosamente la cápsula ótica coclear.Ahora, utilice un microcuchillo o dos pinzas de 55 para separar cuidadosamente el ligamento espiral, que está adherido al órgano de Corti, del resto de la cóclea y del medialis. Esto puede hacerse agarrando el ligamento espiral por su parte más basal y desenrollándolo suavemente mientras se avanza hacia la parte apical. Después de retirar el ligamento espiral, coloque la muestra para obtener una vista sagital longitudinal de la cóclea.Luego, corte la cóclea en dos o tres secciones utilizando el cuchillo microscópico, clasificando estas secciones como giros apical y basal. Retire el tejido superior de la pieza más apical y el tejido inferior de la pieza más basal, hasta llegar a la capa real de células pilosas y neuritas, para permitir que el explante coclear se coloque horizontalmente sobre la placa de Petri. A continuación, use pinzas para agarrar suavemente y separar la membrana tectorial, una capa muy delgada y translúcida ubicada inmediatamente por encima del órgano de Corti.El paso técnicamente más desafiante probablemente sea la eliminación de la membrana tectorial delgada y translúcida, ya que es fácil dañar las células pilosas situadas debajo. Al comenzar desde los bordes del tejido, se conservan las células pilosas a lo largo de toda la extensión del explante, excepto en el borde mismo donde se inició el desprendimiento de la membrana tectorial. Por último, elimine la membrana de Reissner inmediatamente superior a las neuronas del ganglio espiral tocándola con pinzas por ambos lados y desprendiéndola. El espécimen coclear ya está listo para el cultivo tras eliminar las áreas dañadas en los bordes. Comience el procedimiento de cultivo humedeciendo la punta de una pipeta de un mililitro con aproximadamente 120 microlitros de DMEM para evitar que el explante se adhiera al interior de la punta. Luego, utilice la punta previamente humedecida para pipetear un máximo de 70 microlitros del plato de Petri con fondo de vidrio y coloque el espécimen junto con el líquido en uno de los cuatro insertos del plato de Petri de cuatro pocillos.Compruebe bajo el microscopio que el explante esté en la orientación correcta. Asegúrese de que la zona de células pilosas de la que se eliminó la membrana tectorial quede orientada hacia arriba y de que la membrana basilar junto con la parte basal recortada de la medialis quede orientada hacia abajo y adhiera al inserto del cubreobjetos. Si al inspeccionar el espécimen se observa que está colocado boca abajo, como se muestra aquí, agregue HBSS desde la punta de la pipeta y reposicione el fragmento hasta que esté correctamente orientado.Una vez que el explante esté correctamente orientado, aspire el exceso de HBSS y espere 15 segundos. A continuación, agregue mediante pipeta 60 microlitros de medio de cultivo tibio directamente sobre la muestra, teniendo cuidado de no tocar la muestra con la pipeta. Vuelva a colocar las tapas interna y externa de la placa de Petri e incube durante la noche a 37 grados Celsius.Al día siguiente, transfiera el explante coclear contenido en las placas de Petri desde el incubador hasta la cabina de flujo laminar. Aspire el medio de cultivo viejo que no contiene suero bovino fetal (FBS) del inserto. Añada 60 microlitros por pocillo del medio de tratamiento tibio preparado.Coloque la placa de Petri nuevamente en el incubador hasta la tinción de los cultivos después de un máximo de siete días. Como se observa en esta imagen confocal, esta técnica preserva la anatomía de toda la vuelta coclear, incluidos los neuronas del ganglio espiral o SGNs, permitiendo el análisis de los efectos del tratamiento sobre los neuritos y los somas de los SGNs, además del órgano de Corti. Como se muestra aquí, estos explantes pueden utilizarse para comparar simultáneamente el efecto del tratamiento en las vueltas apical y basal tras la tinción inmunofluorescente.Las células pilosas se muestran en verde y las estructuras neuronales aparecen en rojo. Las sinapsis intactas pueden evaluarse mediante la marcación de proteínas presinápticas mostradas en rojo y proteínas postsinápticas mostradas en verde, junto con la tinción de estructuras neuronales en azul. Esta figura muestra imágenes representativas de explantes cocleares apicales y basales después de siete días en cultivo, con 3 %FBS a la izquierda o 1 %FBS a la derecha.Las células incubadas en 3 %FBS comienzan a migrar entre los días cuatro y cinco, como lo indican las flechas grises claras para las células pilosas y las flechas rojas para los neuritos. Los explantes en 1 %FBS mantienen la integridad organizacional hasta el día siete. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar visualmente la integridad estructural y la orientación del tejido coclear antes de añadir el medio de cultivo final y las sustancias de interés.Tras seguir este procedimiento, se puede realizar una reconstrucción tridimensional para confirmar la localización específica del tipo celular de las células que expresan GFP dentro del medialis.

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Investigación

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Medicine

Medicina

Este procedimiento describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti murino con o sin el limbo espiral y las neuronas del ganglio espiral. También demostramos un método para la expresión de un gen reportero exógenos en el órgano de Corti explante de la electroporación.

Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino.

La oreja de ratón interno es un órgano sensorial placoda derivada del desarrollo cuyo programa se elaboró ​​durante la gestación. Se define...

Transferencia de genes a la oreja del ratón en desarrollo por el interior<em&gt; En Vivo</em&gt; La electroporación

Imágenes en vivo de la cóclea de mamíferos embrionario es un reto porque los procesos de desarrollo en la mano operan en un gradiente temporal de más de diez días. Aquí presentamos un método para cultivar y luego la formación de imágenes de embriones tejido explante coclear tomado de un ratón reportero fluorescente en cinco días.

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Presentamos un método que describe el aislamiento y cultivo de explantes cocleares del oído interno de ratones embrionarios.  También demostramos un método para la transferencia de genes a explantes cocleares a través de electroporación de onda cuadrada. El cultivo in vitro de explantes, junto con la técnica de transferencia de genes, permite a los investigadores estudiar los efectos de la alteración de la expresión génica durante el desarrollo.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Existen varios métodos para introducir agentes ototóxicos en las cócleas de modelos animales. Se presenta un protocolo quirúrgico para la administración de agentes ototóxicos en el nicho de ventana redonda. El procedimiento es fiable, crea lesiones intracocleares específicas y evita daños mecánicos en la microarquitectura. Es posible examinar la autorreparación/regeneración coclear.

El Enfoque del ratón Ronda-ventana para ototóxicos Agente de entrega: Una rápida y técnica fiable para la inducción de degeneración de las células cocleares

En este estudio, describimos el enfoque del canal semicircular posterior como un método confiable para la entrega del gene de oído interno en ratones neonatales. Mostramos que entrega del gene a través del canal semicircular posterior es capaz de inundar todo oído interno.

Enfoque del Canal Semicircular posterior para la entrega del Gene de oído interno en ratón Neonatal

Modelos animales de implantes cocleares pueden avanzar el conocimiento de los fundamentos tecnológicos de tratamiento de la pérdida permanente de audición neurosensorial con estimulación eléctrica. Este estudio presenta un protocolo quirúrgico de implantación coclear de una matriz de electrodos en ratones, así como la evaluación funcional con respuesta auditiva del médula oblonga y agudo ensordecedor.

Cirugía de implante coclear y eléctricamente evocada médula oblonga auditivo respuesta grabaciones en ratones C57BL/6

El pollito es un organismo modelo rentable, accesible y ampliamente disponible para una variedad de estudios. Aquí, se detalla una serie de protocolos para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la regeneración del oído interno aviar.

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Los cerdos miniatura (mini-cerdos) son un modelo animal grande ideal para la investigación de implantes cocleares. La cirugía de implantación coclear en mini-cerdos se puede utilizar para proporcionar evidencia inicial de la seguridad y el rendimiento potencial de nuevas matrices de electrodos y enfoques quirúrgicos en un sistema vivo similar al de los seres humanos.

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El protocolo actual actualiza los protocolos anteriores e incorpora enfoques relativamente sencillos para el cultivo de explantes cocleares de alta calidad. Esto proporciona una adquisición de datos fiable e imágenes de alta resolución en células vivas y fijas. Este protocolo apoya la tendencia actual de estudiar las células del oído interno.

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En este artículo, presentamos un protocolo detallado para aislar y cultivar células ciliadas cocleares primarias de ratones. Inicialmente, el órgano de Corti se diseccionó de cócleas murinas neonatales (de 3 a 5 días de edad) bajo un microscopio. Posteriormente, las células se digierieron enzimáticamente en una suspensión unicelular y se identificaron mediante inmunofluorescencia después de varios días en cultivo.

Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

Aprende a preparar cultivos de explantes cocleares murinos neonatales para investigación auditiva. Esta técnica permite estudiar células ciliadas, sinapsis y neuronas en un modelo ex vivo, acelerando el screening de compuestos terapéuticos antes de pruebas in vivo.

Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como

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