Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como

El objetivo general de este procedimiento es la preparación, cultivo, tratamiento y inmunomarcado de explantes cocleares murinos neonatales para su uso como herramienta de cribado in vitro en la investigación auditiva. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación auditiva, como permitir el estudio simultáneo de células ciliadas cocleares, sinapsis, neuritas y neuronas en un modelo ex vivo, y proporcionar información sobre los mecanismos de acción de moléculas nuevas para la cóclea, incluidos factores presentes en secreciones humanas. La principal ventaja de esta técnica es que el proceso de cribado de compuestos terapéuticos candidatos puede acelerarse antes de su evaluación in vivo.

Comience con una cabeza de recién nacido recién recolectada, contenida en etanol al 70 % en la tapa de una placa de Petri. Utilice una hoja de bisturí para realizar un corte superficial en la piel desde el extremo anterior hasta el extremo posterior del cráneo. Luego corte ambos conductos auditivos externos y doble la piel hacia delante para exponer todo el cráneo.

A continuación, abra el cráneo a lo largo de la sutura sagital moviendo suavemente la hoja del bisturí de delante hacia atrás, de anterior a posterior, para evitar la compresión de la cóclea. Retire y deseche el hocico realizando un corte vertical directamente posterior a las órbitas. La parte posterior del cráneo aún debe contener el cerebro y la cóclea.

Luego, utilice 4 pinzas para diseccionar y desechar el prosencéfalo, el cerebelo y el bulbo raquídeo. Coloque las dos mitades del cráneo en una placa de Petri de plástico de 60 milímetros llena con HBSS frío. A continuación, use 4 pinzas para exponer completamente la cóclea, que está adyacente a la arteria estapedial circundante, y separe el órgano de manera roma del hueso temporal.

Transfiera la cóclea a una placa de Petri de vidrio transparente de 50 milímetros con fondo de vidrio que contenga HBSS y coloque la placa bajo el microscopio. Coloque la placa de Petri de plástico de 60 milímetros con la otra mitad del cráneo sobre hielo. A continuación, utilice 4 pinzas para diseccionar cuidadosamente la cápsula ótica coclear.

Ahora, utilice un microcuchillo o dos pinzas de 55 para separar cuidadosamente el ligamento espiral, que está adherido al órgano de Corti, del resto de la cóclea y del medialis. Esto puede hacerse agarrando el ligamento espiral por su parte más basal y desenrollándolo suavemente mientras se avanza hacia la parte apical. Después de retirar el ligamento espiral, coloque la muestra para obtener una vista sagital longitudinal de la cóclea.

Luego, corte la cóclea en dos o tres secciones utilizando el cuchillo microscópico, clasificando estas secciones como giros apical y basal. Retire el tejido superior de la pieza más apical y el tejido inferior de la pieza más basal, hasta llegar a la capa real de células pilosas y neuritas, para permitir que el explante coclear se coloque horizontalmente sobre la placa de Petri. A continuación, use pinzas para agarrar suavemente y separar la membrana tectorial, una capa muy delgada y translúcida ubicada inmediatamente por encima del órgano de Corti.

El paso técnicamente más desafiante probablemente sea la eliminación de la membrana tectorial delgada y translúcida, ya que es fácil dañar las células pilosas situadas debajo. Al comenzar desde los bordes del tejido, se conservan las células pilosas a lo largo de toda la extensión del explante, excepto en el borde mismo donde se inició el desprendimiento de la membrana tectorial. Por último, elimine la membrana de Reissner inmediatamente superior a las neuronas del ganglio espiral tocándola con pinzas por ambos lados y desprendiéndola.

El espécimen coclear ya está listo para el cultivo tras eliminar las áreas dañadas en los bordes. Comience el procedimiento de cultivo humedeciendo la punta de una pipeta de un mililitro con aproximadamente 120 microlitros de DMEM para evitar que el explante se adhiera al interior de la punta. Luego, utilice la punta previamente humedecida para pipetear un máximo de 70 microlitros del plato de Petri con fondo de vidrio y coloque el espécimen junto con el líquido en uno de los cuatro insertos del plato de Petri de cuatro pocillos.

Compruebe bajo el microscopio que el explante esté en la orientación correcta. Asegúrese de que la zona de células pilosas de la que se eliminó la membrana tectorial quede orientada hacia arriba y de que la membrana basilar junto con la parte basal recortada de la medialis quede orientada hacia abajo y adhiera al inserto del cubreobjetos. Si al inspeccionar el espécimen se observa que está colocado boca abajo, como se muestra aquí, agregue HBSS desde la punta de la pipeta y reposicione el fragmento hasta que esté correctamente orientado.

Una vez que el explante esté correctamente orientado, aspire el exceso de HBSS y espere 15 segundos. A continuación, agregue mediante pipeta 60 microlitros de medio de cultivo tibio directamente sobre la muestra, teniendo cuidado de no tocar la muestra con la pipeta. Vuelva a colocar las tapas interna y externa de la placa de Petri e incube durante la noche a 37 grados Celsius.

Al día siguiente, transfiera el explante coclear contenido en las placas de Petri desde el incubador hasta la cabina de flujo laminar. Aspire el medio de cultivo viejo que no contiene suero bovino fetal (FBS) del inserto. Añada 60 microlitros por pocillo del medio de tratamiento tibio preparado.

Coloque la placa de Petri nuevamente en el incubador hasta la tinción de los cultivos después de un máximo de siete días. Como se observa en esta imagen confocal, esta técnica preserva la anatomía de toda la vuelta coclear, incluidos los neuronas del ganglio espiral o SGNs, permitiendo el análisis de los efectos del tratamiento sobre los neuritos y los somas de los SGNs, además del órgano de Corti. Como se muestra aquí, estos explantes pueden utilizarse para comparar simultáneamente el efecto del tratamiento en las vueltas apical y basal tras la tinción inmunofluorescente.

Las células pilosas se muestran en verde y las estructuras neuronales aparecen en rojo. Las sinapsis intactas pueden evaluarse mediante la marcación de proteínas presinápticas mostradas en rojo y proteínas postsinápticas mostradas en verde, junto con la tinción de estructuras neuronales en azul. Esta figura muestra imágenes representativas de explantes cocleares apicales y basales después de siete días en cultivo, con 3 %FBS a la izquierda o 1 %FBS a la derecha.

Las células incubadas en 3 %FBS comienzan a migrar entre los días cuatro y cinco, como lo indican las flechas grises claras para las células pilosas y las flechas rojas para los neuritos. Los explantes en 1 %FBS mantienen la integridad organizacional hasta el día siete. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar visualmente la integridad estructural y la orientación del tejido coclear antes de añadir el medio de cultivo final y las sustancias de interés.

Tras seguir este procedimiento, se puede realizar una reconstrucción tridimensional para confirmar la localización específica del tipo celular de las células que expresan GFP dentro del medialis.