Aislamiento de murino tejido adiposo derivado de microvascular Fragmentos como Unidades Vascularización para ingeniería de tejidos

El objetivo general de este procedimiento es aislar fragmentos microvasculares del tejido adiposo murino para la generación de unidades de vascularización para la ingeniería de tejidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos sobre la vascularización in vivo de sustitutos de tejidos. Una ventaja de esta técnica es que produce segmentos microvasculares completamente funcionales sin procesamiento in vitro complejo que pueden sembrarse en andamios e implantarse en defectos tisulares.

Este método también se puede aplicar a otros sistemas, como los ensayos de angiogénesis in vitro, para desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la formación y remodelación de redes microvasculares. Comience colocando un ratón macho C57 negro seis anestesiado en posición supina bajo un microscopio estereoscópico quirúrgico y confirme la falta de respuesta al pinzamiento de los dedos del pie. Inmovilizar las patas con cinta adhesiva y desinfectar el abdomen.

A continuación, utilice unas tijeras de disección para separar la capa abdominal del tejido muscular subyacente y realizar una laparotomía de la línea media. Despliega lateralmente los colgajos de la pared abdominal e identifica bilateralmente los testículos, el epidídimo y las almohadillas de grasa del epidídimo. Luego use tijeras de preparación pequeñas y pinzas finas para recolectar las almohadillas de grasa, teniendo cuidado de no acumular ningún tejido epididimario y coloque las almohadillas de grasa en una placa de Petri que contenga 15 ml de DMEM de 37 grados centígrados.

En una campana de flujo laminar, lave las almohadillas de grasa en tres placas de Petri separadas que contengan 15 ml de PBS y coloque la grasa lavada en un tubo de polipropileno vacío de 14 ml. Utilice una báscula de tubo para determinar el volumen de grasa recolectada. Luego use tijeras finas para picar mecánicamente el tejido graso.

Cuando se obtenga una suspensión de tejido homogénea, se utilizará una pipeta dosificadora de 10 mL para transferir el tejido picado con dos volúmenes de collaginasa NB 4G a un matraz erlenmeyer de 50 mL que contenga una barra agitadora de 25 milímetros. Coloque el matraz en una incubadora de cultivos celulares durante 10 minutos bajo agitación vigorosa. Luego, observe 10 mcL del tejido digerido bajo un microscopio.

El paso más difícil en este procedimiento de aislamiento es identificar el momento adecuado para detener la digestión. La digestión de las almohadillas de grasa durante demasiado tiempo dará como resultado una suspensión de una sola célula sin fragmentos microvasculares. Si el digestato contiene fragmentos microvasculares derivados del tejido adiposo libre junto a células individuales, neutralice la enzima con dos volúmenes de PBS suplementados con 20% de FCS y transfiera la suspensión de los vasos celulares a nuevos tubos de polipropileno.

Incubar la solución durante cinco minutos a 37 grados centígrados para separar los fragmentos microvasculares de la grasa restante por gravedad. A continuación, utilice una pipeta de precisión de un ml para extraer con cuidado un ml del sobrenadante de grasa principal, seguido de una pipeta de precisión de 100 ml para eliminar el resto del sobrenadante hasta que la suspensión parezca estar libre de grasa. Cuando se haya eliminado toda la grasa, utilice una pipeta medidora de 10 mL para filtrar la suspensión del vaso celular a través de un colador de 50 micras sobre un tubo cónico de 50 mL y transfiera la suspensión filtrada a un nuevo tubo de polipropileno de 14 mL para cada fragmento microvascular aislado individual.

Recoja los gránulos de fragmentos microvasculares por centrifugación y extraiga todo el sobrenadante de cada tubo, excepto el último. Vuelva a suspender los gránulos en los supernatos restantes. A continuación, transfiera cada suspensión a tubos de microcentrífuga cónicos individuales de 1,5 mL y vuelva a granular los fragmentos microvasculares para su resuspensión en el volumen final adecuado de PBS y 20% de FCS para el análisis posterior planificado.

Aquí, se muestra la distribución de la longitud de los fragmentos microvasculares recién aislados de ratones negros C57 de seis, siete a doce meses de edad, con una longitud promedio de aproximadamente 42 micrómetros. Como demuestra este frotis representativo de suspensión de vasos celulares, se observan fragmentos microvasculares grandes, medianos y pequeños, así como células individuales, cuando el tejido graso se ha digerido lo suficiente. Un aumento mayor revela que los fragmentos microvasculares exhiben una morfología de microvasos madura con segmentos de microvasos jerárquicos.

La caracterización de los fragmentos microvasculares por citometría de flujo indica que contienen células endoteliales CD31 positivas, células paravasculares alfa lisas acton positivas y células madre mesenquimales CD117 positivas, células marcadoras expresoras. Después de la siembra en un sustituto dérmico de la piel, los fragmentos microvasculares más grandes se localizan principalmente en la superficie del implante y se detectan algunos segmentos de vasos capilares dentro de los núcleos del implante. La tinción inmunohistoquímica de los fragmentos microvasculares sembrados revela además configuraciones fisiológicas de microvasos con fragmentos arteriolares, venulares y capilares.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar fragmentos microvasculares del tejido adiposo murino como unidades de vascularización para la ingeniería de tejidos.