Mínimamente invasiva músculo incrustación (MIME) - una nueva técnica Experimental para facilitar la miogénesis mediada por células de donantes

El objetivo general de esta técnica es implantar un pequeño segmento de tejido muscular donante en un músculo huésped, con el fin de promover la miogénesis mediada por células del donante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología muscular regenerativa, como por ejemplo, si el tejido muscular recolectado post-mortem puede promover la miogénesis mediada por células donantes en un músculo huésped. La principal ventaja de esta técnica es que es mínimamente invasiva.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para las distrofias musculares no letales, ya que una combinación de incrustación muscular, ejercicio e inmunoterapia podría ser capaz de rejuvenecer el potencial regenerativo de ciertos músculos afectados. Como fisioterapeuta e ingeniero biomédico, creo que la naturaleza mínimamente invasiva del procedimiento MIME es clave porque proporciona una fuente de células miogénicas, junto con un andamio de tejido natural sin alterar excesivamente la estructura y función muscular del huésped. La señorita Morium Begam, asistente de investigación en mi laboratorio, demostrará el procedimiento.

Para comenzar, eutanasia de ratones donantes negros C57 de 12 a 16 semanas de edad como se describe en el protocolo de texto. Use un par de tijeras quirúrgicas para abrir la piel sobre la superficie anterior de la pata trasera. Después de encontrar el músculo TA, retírelo para visualizar el músculo EDL ubicado detrás del músculo TA.

Deslice la punta de un par de pinzas detrás del músculo y tire suavemente para ver si los dedos de los pies se extienden, confirmando que el músculo es el EDL. Después de identificar el músculo EDL, use segmentos de seda 4-0 de aproximadamente 10 centímetros de largo para atar suturas guía a los tendones distales y proximales. Realizar dos nudos dobles en las suturas de los tendones proximal y distal del músculo.

Corta el tendón EDL distal y refleja el músculo. Luego, corta el tendón proximal para liberar el músculo. Coloque los músculos EDL recolectados en una placa de Petri llena de solución de timbre de ratón.

Anestesiar al ratón huésped NSG-GFP macho de ocho a 10 semanas de edad, de acuerdo con el protocolo de texto. Aplica vaselina en los ojos para evitar la sequedad. Para preparar la piel, aplicar la crema depilatoria sobre la cara anterior de la pata trasera izquierda y dejar actuar durante dos minutos.

Con toallitas empapadas en PBS, retire la crema depilatoria junto con el pelaje. Para limpiar la piel, alterne el frotado con tres toallitas de solución de povidona yodada y etanol al 70%. Para crear un tracto de aguja en el músculo AT huésped, pase una aguja quirúrgica a través del centro del músculo, a lo largo del eje largo del músculo.

Asegúrese de pasar la aguja en dirección cefalo-caudal, a lo largo de la longitud del músculo TA y a través del centro del vientre muscular. Después de la inserción de la aguja, pase las suturas guía desde un extremo del tejido donante, a través de la luz de la aguja quirúrgica en dirección caudocefálica. Retraiga la aguja del músculo huésped en dirección caudocefálica, para guiar el tejido donante a través del tracto de la aguja.

Coloque correctamente el tejido muscular EDL donante dentro del músculo TA del huésped, use las suturas guía en los extremos caudal y cefálico del músculo donante. Después de la inclusión del tejido del donante, corte las suturas guía y haga los ajustes necesarios con pinzas de punta fina. Finalmente, selle las heridas de la aguja en el tejido muscular cerrando la abolladura de la herida con pinzas y aplicando adhesivo de tejido veterinario con la punta de una aguja quirúrgica de calibre 27.

Después de la MIME, inyecte de 50 a 60 microlitros de cloruro de bario al 1,2% en el músculo TA huésped en tres sitios a lo largo del músculo, proximal, medio y distal en un tercio del vientre muscular. Después de la inyección, limpie la pata del ratón huésped con etanol y proteja la piel aplicando una fina capa de vaselina. Coloque al ratón en una jaula de recuperación solitaria sin ropa de cama.

Se debe colocar una almohadilla térmica de gel isotérmica debajo de la mitad de la jaula para proporcionar soporte térmico al ratón anfitrión y, al mismo tiempo, permitir que el mouse se mueva a la mitad no calentada. Una vez completada la recuperación, devuelva el ratón a su jaula original. Use un par de tijeras quirúrgicas para abrir la piel sobre la superficie anterior de la pierna.

Después de localizar el músculo TA, corte su tendón distal y refleje el músculo. Corta el tendón del músculo proximal para liberar el músculo TA. Recoja tanto los músculos TA izquierdos o tratados como los derechos o de control.

Pesa los músculos cosechados colocándolos en un papel de pesaje y una báscula. Para la crioprotección, sumerja los músculos brevemente en aceite mineral y luego seque el exceso de aceite. Para congelar los músculos, colóquelos sobre papel de aluminio y sumérjalos rápidamente en un matraz doble lleno de nitrógeno líquido.

Transfiera las muestras congeladas a viales criogénicos etiquetados. La incrustación precisa del tejido donante dentro del músculo huésped es fundamental para el éxito de MIME. Después de tres días, el músculo EDL donante permanece implantado en el músculo TA del huésped con marcas de agujas aún visibles en el músculo huésped.

Además, las secciones transversales de los músculos donantes no muestran fluorescencia verde. Mientras que, la sección transversal de los músculos del huésped sí lo hace. En las secciones transversales de los músculos implantados, hay un borde claro entre las fibras musculares de la cáscara positivas para GFP y las fibras musculares donantes negativas para GFP.

14 días después del tratamiento, todas las fibras musculares y los músculos no tratados son GFP positivos. Pero no en los músculos del huésped tratados. Se ha demostrado que muchas de estas fibras negativas de GFP son viables con el marcado de desmina roja.

Esto demuestra que la MIME conduce a la miogénesis derivada de las células del donante. Hay fibras musculares quiméricas presentes en el músculo TA. Se detectan por su fluorescencia baja a moderada, probablemente derivada de la fusión de las células miogénicas del huésped y del donante.

Su presencia en todo el diámetro del músculo huésped sugiere que las células miogénicas del donante pueden migrar varios cientos de micras dentro del músculo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 15 a 20 minutos, si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la técnica MIME para incrustar un segmento de músculo donante en un músculo huésped, con el fin de facilitar la miogénesis mediada por células del donante.

La técnica MIME allana el camino para que estudiemos si el músculo humano cadavérico puede promover la miogénesis mediada por células donantes en un ratón huésped. También ayuda a evaluar si la estimulación eléctrica neuromuscular es capaz de mejorar la miogénesis mediada por células del donante. Este método también se puede aplicar a otros sistemas, como la generación de modelos animales de enfermedades humanas mediante la incorporación de músculo humano de biopsia en animales huéspedes y para probar si los miméticos del tejido muscular que contienen células miogénicas pueden promover la miogénesis.