Cuantificación de la Pigmentación Abdominal en Drosophila melanogaster
1 de junio de 2017
Este trabajo presenta un método para cuantificar de forma rápida y precisa la pigmentación abdominal de Drosophila melanogaster mediante el análisis de imágenes digitales . Este método agiliza los procedimientos entre la adquisición del fenotipo y el análisis de los datos e incluye el montaje de las muestras, la adquisición de imágenes, la extracción de valores de píxeles y la medición de rasgos.
El objetivo general de esta metodología es cuantificar rápidamente la pigmentación abdominal en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología evolutiva, como la identificación de los loci genéticos que subyacen a su vez en la morfología de la variación específica de la confianza y la comprensión del desarrollo y la evolución de los fenotipos morfológicos. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los usuarios medir de forma no destructiva varios aspectos de la pigmentación abdominal, incluida la extensión y la profundidad de la pigmentación.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la pigmentación abdominal de Drosophila melanogaster, también se puede aplicar a otras especies de Drosophila y se puede adaptar fácilmente para medir los patrones de pigmentación en otros insectos y taxones animales. Antes de la obtención de imágenes, las moscas se pueden almacenar en etanol al 70% para mantener su pigmentación. La visualización requiere una almohadilla de montaje.
Cargue una placa de Petri de 60 milímetros con unos 10 mililitros de agar al 1,25% en agua. Bajo un microscopio, use pinzas finas para cavar una zanja de 20 milímetros de largo, dos milímetros de ancho y un milímetro de profundidad en el gel. Se pueden hacer varias zanjas en un plato.
A continuación, incruste las moscas en la zanja con la superficie para el análisis situada justo encima de la superficie del gel. En este caso, el lado dorsal es de interés. Ahora, llene el plato con etanol al 70% hasta que las moscas estén completamente sumergidas.
Esto reduce los reflejos de la cutícula que pueden oscurecer el patrón de pigmentación. Ahora, inicie el software de imágenes y la cámara digital conectada al microscopio. Para una fuente de luz, la luz fría de un dispositivo de doble cuello de cisne es suficiente.
En el software de análisis de imágenes, establezca el tipo de imagen en 8 bits. Luego, en el software de captura de imágenes, cambie la configuración En vivo para abrir una ventana de vista de la cámara. Establezca el tipo de imagen en Escala de grises.
Ahora, ajuste la fuente de luz a su intensidad máxima y coloque las luces a unos 120 milímetros del escenario. Ajuste el microscopio a 60 aumentos para que el campo de visión sea de tres milímetros de ancho. A continuación, coloque el micrómetro de etapa de dos milímetros en el campo de visión y concéntrelo.
Volviendo al software, ajuste el tiempo de exposición para ver el micrómetro utilizando el campo que se encuentra en el cuadro de exposición. A continuación, ajuste la escala. Abra la herramienta de línea recta y dibuje la longitud de dos milímetros a lo largo del micrómetro de la etapa.
A continuación, introduzca esa longitud en la opción Establecer escala. A continuación, la ventana debería mostrar la escala en píxeles por micra. Tome nota de la escala y apruebe los ajustes.
Ahora, regrese al software de captura de imágenes y use los comandos Detener y Ajustar para capturar una imagen del micrómetro de la etapa. A continuación, vuelva al software de análisis de imágenes y guarde la imagen como un archivo Tiff. Ahora, concéntrate en la línea media dorsal de una mosca montada.
La línea media debe colocarse recta para obtener los mejores resultados de imagen. Empuja a un lado las alas y cualquier otra estructura que sobresalga y ajusta la iluminación para iluminar mejor la cutícula. A continuación, establezca la exposición en el software de captura de imágenes utilizando el histograma de valor de píxel como guía para capturar el rango completo de píxeles de la imagen sin saturación, maximizando así el contraste.
Conserva esta exposición e iluminación durante todo el experimento. Ahora, antes de capturar una imagen, asegúrese de que los segmentos abdominales de interés estén a la vista. A continuación, capture una imagen y guarde la imagen con el número de ID de muestra en el nombre del archivo.
Utilice el formato descrito en el protocolo escrito. Este análisis hace uso de una macro proporcionada por los autores. La serie de imágenes a analizar debe estar contenida en la misma carpeta de archivos.
Ahora, inicie la macro y siga los comandos solicitados. Primero, identifique la ubicación de los archivos almacenados. A continuación, identifique la ubicación en la que se deben almacenar los datos de análisis.
A continuación, introduzca el número de caracteres que se utilizaron en los nombres de archivo para que el software lea correctamente la serie de imágenes. La siguiente solicitud es para el ancho de la región de interés. Aquí, ingrese el número de píxeles a lo largo de la tira anteroposterior que debe analizarse.
Ahora, en el indicado, elija analizar la primera imagen de la serie. Las otras opciones son analizar la siguiente imagen de la serie o salir del análisis. La herramienta de línea se selecciona automáticamente.
Úselo para identificar la línea media en la imagen dibujando una línea a lo largo de ella en la dirección anterior a posterior. A continuación, siga las indicaciones de la macro para identificar el borde posterior de Tergite4 utilizando la herramienta de línea. La herramienta de línea está disponible para dibujar la línea desde el borde posterior de la línea media hasta el borde lateral derecho, de modo que el centro de la línea esté justo después del borde posterior de la banda de pigmento.
A continuación, defina el borde anterior de Tergite4 con la herramienta de línea. Dibuja una línea desde el borde anterior de la línea media hasta el borde lateral derecho. El centro de la línea definida por un cuadrado blanco debe quedar en el borde anterior de la cutícula ligeramente pigmentada.
Con esta información, la macro genera ahora un perfil de pigmentación. Sin embargo, el perfil puede ser inexacto si las cerdas u otras imperfecciones atraviesan la tira a lo largo de la cual se mide el perfil. Para corregir esto, seleccione la vista previa en vivo en la ventana del histograma y ajuste la línea de modo que el perfil sea suave.
Para que la tira de análisis de imagen capture con precisión los diversos aspectos de la pigmentación, es vital identificar una región de análisis que tenga un ruido mínimo causado por las irregularidades de la imagen o la muestra. Ahora proceda a analizar Tergite3 en la misma imagen y luego pase a la siguiente imagen. El procedimiento descrito se utilizó para explorar un cambio conocido en la pigmentación abdominal causado por la temperatura de la cría.
La tercera y cuarta tergitas fueron examinadas varias veces bajo diversas iluminaciones y exposiciones. Se exploraron varios aspectos de la pigmentación. Y específicamente, se encontró que las bandas de pigmentación eran más anchas cuando las moscas se criaban a temperaturas más frías.
A continuación, los valores calculados se compararon con las medidas subjetivas generales realizadas en las mismas moscas por cinco observadores diferentes. En la evaluación de 45 moscas hembras, la clasificación promedio observada del ancho de la cuarta banda de pigmentación abdominal se correlacionó estrechamente con la medición automatizada del macro. La misma banda de pigmentación también se midió manualmente utilizando un software de imagen.
Estos resultados también se correlacionaron fuertemente con las mediciones generadas utilizando la macro. A continuación, se probó el software para medir la pigmentación en mutantes de ébano femeninos, que se sabe que han aumentado la pigmentación en la tercera y cuarta bandas de pigmento. El método también se utilizó para medir la quinta y sexta banda abdominal de las hembras de tipo silvestre.
La técnica automatizada siempre proporcionó mediciones útiles de la densidad del pigmento y el tamaño de la banda. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar de manera rápida y precisa la pigmentación abdominal en Drosophila. El dominio de la técnica requiere principalmente el uso de fórceps en profundidad.
Una vez dominada, la parte de imagen de esta técnica se puede realizar a una velocidad de 50 muestras por hora. La extracción de las medidas de pigmentación de estas imágenes se puede realizar a un ritmo de 70 imágenes por hora.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este trabajo presenta un método para cuantificar rápida y precisamente la pigmentación abdominal de Drosophila melanogaster mediante análisis de imágenes digitales. Esta técnica permite la medición no destructiva de la extensión y profundidad de la pigmentación, aportando información sobre la biología evolutiva.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología evolutiva
- Genética
Antecedentes
- Drosophila melanogaster es un organismo modelo en estudios genéticos y evolutivos.
- Comprender la pigmentación puede revelar loci genéticos relacionados con la variación morfológica.
- Las técnicas de imagen no destructivas son esenciales para el análisis preciso del fenotipo.
- El almacenamiento previo en etanol al 70 % ayuda a mantener la pigmentación para la obtención de imágenes.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rápido para cuantificar la pigmentación abdominal.
- Facilitar el estudio de preguntas genéticas y evolutivas en Drosophila.
- Proporcionar una técnica aplicable a otras especies de Drosophila e insectos.
Métodos Utilizados
- Análisis de imagen digital para cuantificar la pigmentación.
- Montaje del espécimen en una almohadilla de visualización.
- Adquisición de imágenes y extracción de valores de píxeles.
- Medición de características de pigmentación.
Resultados principales
- El método permite la cuantificación precisa de los rasgos de pigmentación.
- Simplifica el proceso desde la adquisición del fenotipo hasta el análisis de datos.
- Los resultados pueden orientar estudios sobre la evolución morfológica.
- La técnica es adaptable para su uso en diversos táxones de insectos.
Conclusiones
- Esta metodología mejora el estudio de la pigmentación abdominal en Drosophila.
- Proporciona un marco para investigaciones futuras en biología evolutiva.
- El enfoque puede extenderse a otras especies y caracteres morfológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis fenotípico cuantitativo permite la medición precisa de rasgos morfológicos, apoyando la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Este método proporciona extracción de datos reproducible y escalable para patrones de pigmentación, facilitando la colaboración entre distintas funciones y la confianza predictiva en estudios genotipo-fenotipo. Su adaptabilidad a lo largo de diferentes táxones de insectos mejora la continuidad traslacional y la relevancia en carteras de trabajo dentro de los flujos de trabajo de cribado fenotípico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de loci genéticos subyacentes a la variación morfológica mediante la medición de caracteres cuantitativos.
- Valor operativo: Proporciona imágenes no destructivas y de alto rendimiento compatibles con líneas de cribado genético.
- Valor estratégico: Apoya la comprobación de hipótesis sobre vías del desarrollo que afectan la expresión fenotípica.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas estandarizadas para la intensidad de la pigmentación y el ancho de las bandas en diferentes especímenes.
- Valor operativo: Utiliza macros de software de código abierto para la extracción consistente de datos en distintos sistemas de imagen.
- Valor estratégico: Permite que el ensayo esté listo para la detección de modificadores genéticos de las vías de pigmentación.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la modelización de sistemas relevantes para enfermedades mediante la cuantificación de rasgos morfológicos adaptativos.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad entre laboratorios mediante protocolos estandarizados de montaje e imagen.
- Valor estratégico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la correlación entre genotipo y resultados fenotípicos medibles.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de biología del descubrimiento al permitir el análisis cuantitativo de rasgos tras una perturbación genética o una modulación ambiental.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la cuantificación morfológica precisa.
- Selección: Ofrece estandarización de ensayos y resultados cuantitativos reproducibles para la evaluación de compuestos o modificadores genéticos.
- Análisis: Proporciona mediciones basadas en píxeles y resultados estadísticos para comparar distribuciones fenotípicas.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante rasgos medibles y evolutivamente relevantes.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable de imágenes y análisis para diversas aplicaciones de cribado morfológico.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en las relaciones genotipo-fenotipo mediante la medición objetiva y cuantificable de rasgos.
- Valor operativo: Alta reproducibilidad y escalabilidad, con imágenes a razón de 50 especímenes por hora y análisis a razón de 70 imágenes por hora.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de continuar o descartar mediante la reducción de ambigüedades en la evaluación fenotípica.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización basada en riesgos de objetivos genéticos utilizando umbrales fenotípicos cuantitativos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de Drosophila, microscopía y software de análisis de imágenes.
- Depende de una iluminación estandarizada, aumento y calibración de escala para mediciones precisas.
- Necesita el cumplimiento del protocolo entre equipos para un montaje consistente de especímenes y almacenamiento en etanol.
- Las consideraciones de adaptación incluyen el ajuste del ancho de la región de interés para diferentes especies o tipos de tejido.
- Las limitaciones prácticas incluyen la susceptibilidad al ruido causado por setas u otras irregularidades en el espécimen, lo que requiere corrección manual del perfil.
