Agujas personalizadas para microinyecciones en el cerebro de roedor

El objetivo general de esta metodología es refinar un protocolo para la microinyección cerebral utilizando una aguja de cuarzo personalizada y reutilizable que no produzca daño tisular detectable y garantice una administración confiable incluso en regiones profundas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la fisiopatología de las enfermedades neurodegenerativas y psiquiátricas y los efectos de la terapia génica y celular a través de vectores virales e injertos celulares. La principal ventaja es que estas agujas no producen ningún daño tisular detectable, lo que garantiza una entrega fiable en las regiones profundas del cerebro.

Son rentables, ya que se pueden limpiar y reutilizar. Para comenzar este procedimiento, limpie y esterilice los capilares de cuarzo colocándolos durante cinco minutos en agua destilada. Cinco minutos en etanol al 99%, seguidos de cinco minutos en éter dietílico.

A continuación, deje los capilares bajo el capó durante al menos una hora para que se sequen por completo. Mientras tanto, prepare las agujas largas y finas con un tirador láser. A continuación, coloque las agujas en una placa de Petri previamente limpia con etanol al 70%.

Cubra el plato con una película de parafina de plástico. A continuación, corte los capilares en el micro disector. Fije firmemente la aguja en la mesa del microscopio y coloque su punta en el centro de la pantalla de la computadora.

En la barra de menú, haga clic en el icono del lápiz y utilícelo para dibujar una marca para la aguja que se va a cortar. En la función de la barra lateral, seleccione la bandera que contiene el botón Start Cut para permitir que el láser corte el punto previamente marcado. Si es necesario, corte los orificios laterales dibujando una marca y repitiendo los procedimientos de corte sin volver a colocar la aguja.

Después de cortar la aguja, conéctela a una bomba de vacío a través de un tubo de plástico. A continuación, encienda la bomba y ajuste manualmente el caudal de avance a tres microlitros por minuto. A continuación, aspire el etanol al 99% seguido del agua destilada para eliminar las impurezas debidas al corte.

Después de eso, aspire el etanol al 99% nuevamente para facilitar el secado. Posteriormente, guarde las agujas en una placa de Petri debidamente cubierta hasta el día de la cirugía. Para reutilizar las agujas, al final del experimento, límpialas con los detergentes adecuados y etanol al 70% para eliminar la solución inyectada y los posibles residuos de tejido.

Si es necesario, estas agujas incluso se pueden hervir en frascos de vidrio dedicados llenos de agua destilada. En este paso, seleccione el menú de configuración para calibrar la bomba de acuerdo con el diámetro por volumen de la jeringa de microinyección. Y ajuste el caudal a 0,3 microlitros por minuto.

Luego llene una jeringa de 10 mililitros con agua estéril. Y utilícelo para llenar la jeringa de microinyecciones y el kit de piezas de ensamblaje de inyección para la bomba manual de microninjection. Después de eso, conecte la aguja al kit de bomba de microinyección manual.

Desconecte la jeringa de 10 mililitros de la jeringa de microinyección mientras empuja lentamente el pistón, para dejar una gota de agua en la parte superior de la jeringa de microinyección. A continuación, inserte el pistón en la jeringa de microinyección. Ahora, conecte la jeringa de microinyección a la bomba y ajuste el caudal a 0,3 microlitros por minuto.

Posteriormente, cambie el caudal a 0,1 microlitros por minuto e inicie el procedimiento quirúrgico. Para realizar la cirugía, afeita la cabeza del animal y límpiala con una toallita con alcohol. A continuación, coloque a la rata en el marco estereotáxico.

Haz un corte longitudinal sobre el cráneo con un bisturí esterilizado. Sea suave para evitar el sangrado excesivo. Después de eso, abra el cuero cabelludo con una espátula plana y aplique clips quirúrgicos en los colgajos de la piel para mantenerlo abierto.

Muy suavemente, separe el periostio para exponer el bregma y el área del cráneo a través de la cual se insertará la aguja. Posteriormente, monta el brazo en el marco estereotáxico y mueve la punta de la aguja justo por encima del bregma, prestando atención a no romper su punta. Anote las coordenadas anteroposterior y lateral medial del bregma y mueva la aguja a las coordenadas deseadas.

Luego, baje la aguja hasta que su punta casi toque el cráneo, marcando el punto de perforación después de levantar un poco el brazo estereotáxico. Taladre el cráneo en el lugar marcado, teniendo cuidado de no dañar las meninges y el cerebro. A continuación, corta un pequeño trozo de película plástica de parafina y colócalo sobre el cráneo.

Con la pipeta de 10 microlitros, haga una gota de la solución para aplicar sobre la película de parafina plástica. Detenga la bomba, recupere ligeramente el empujador de la bomba y cree una pequeña burbuja de aire en el capilar tirando suavemente del pistón de la jeringa de microinyección. Baje la punta de la aguja hasta que llegue a la gota.

Extraiga la muestra tirando del pistón de la jeringa de microinyección muy lentamente, evitando la formación de burbujas. Reemplace el empujador de la bomba en contacto con el pistón y encienda la bomba a un caudal de 0,3 microlitros por minuto. Luego, espere hasta que se forme una gota antes de continuar con el siguiente paso.

Después, baje el caudal a 0,1 microlitros por minuto. Corta la duramadre con una aguja de acero inoxidable con punta biselada y baja lentamente la aguja para que penetre en el tejido cerebral. Cuando se alcance la posición deseada, baje 0,1 milímetros más y, a continuación, detenga la bomba.

Eleve el brazo estereostático 0,1 milímetros y vuelva a poner en marcha la bomba a 0,3 microlitros por minuto. Después de eso, inicie el temporizador y la inyección. Controle el movimiento de las burbujas mientras inyecta.

Al final, detenga la bomba y espere cinco minutos antes de recuperar lentamente la aguja. Cuando la aguja de cuarzo esté completamente extraída de nuevo, vuelva a poner en marcha la bomba y compruebe la formación de una gota en la punta de la aguja. A continuación, selle la abertura en la superficie del cráneo con cera para huesos.

Retire las pinzas homeostáticas y suture el cuero cabelludo. Cubra el área alrededor de la herida con una crema antibiótica y devuelva al animal a la jaula de la casa. Estas son las secciones coronales de ocho micrómetros de los cerebros de las ratas a nivel del cuerpo estriado.

En esta imagen se muestran los daños producidos por la inyección de dos microlitros de ACSF, utilizando una aguja de acero inoxidable de calibre 26. Por el contrario, el cuerpo estriado inyectado con una aguja de cuarzo, no mostró ningún daño detectable. Estas otras imágenes muestran los daños inducidos por las dos agujas a nivel del hipocampo dorsal.

Pero la aguja de cuarzo no produjo ningún daño detectable. El éxito de las inyecciones con ambas agujas se demostró mediante la distribución de azul de tripán. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas, si se realiza correctamente.

Después de estos procedimientos, todo lo que importa, como las cirugías adicionales, se puede realizar para responder a diferentes preguntas, como el efecto inducido por el medicamento. Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran el efecto de las toxinas y los medicamentos y, más recientemente, los productos de terapia génica y celular en modelos animales. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar microinyecciones en regiones cerebrales más profundas sin lesiones detectables utilizando agujas de cuarzo personalizadas.

No olvide que el uso de reactivos y/o patógenos diseccionados con láser puede ser extremadamente peligroso. Y siempre se deben tomar precauciones, como los procedimientos de seguridad con láser y el equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.