Agujas personalizadas para microinyecciones en el cerebro de roedor

El objetivo general de esta metodología es perfeccionar un protocolo para microinyección cerebral mediante una aguja de cuarzo personalizada y reutilizable que no produzca daño tisular detectable y garantice una administración confiable incluso en regiones profundas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la fisiopatología de las enfermedades neurodegenerativas y psiquiátricas, y los efectos de la terapia génica y celular mediante vectores virales e injertos celulares. La principal ventaja es que estas agujas no producen daño tisular detectable, lo que asegura una administración confiable en regiones profundas del cerebro.

Son rentables ya que pueden limiarse y reutilizarse. Para comenzar este procedimiento, limpie y esterilice los capilares de cuarzo colocándolos durante cinco minutos en agua destilada, cinco minutos en etanol al 99 %, seguidos de cinco minutos en éter etílico.

Luego, deje los capilares bajo la campana al menos una hora para que sequen completamente. Mientras tanto, prepare las agujas largas y delgadas utilizando un extractor láser. A continuación, coloque las agujas en una placa de Petri previamente limpiada con etanol al 70%.

Cubra el recipiente con una película de parafina de plástico. A continuación, corte los capilares en el microdiseccionador. Fije firmemente la aguja en la mesa del microscopio y coloque su punta en el centro de la pantalla del ordenador.

En la barra de menú, haga clic en el icono del lápiz y utilícelo para dibujar una marca donde se realizará el corte en la aguja. En la función de la barra lateral, seleccione la bandera que contiene el botón Start Cut para permitir que el láser corte el punto marcado previamente. Si es necesario, corte los orificios laterales dibujando una marca y repitiendo los procedimientos de corte sin reposicionar la aguja.

Después de cortar la aguja, conéctela a una bomba de vacío mediante un tubo de plástico. A continuación, encienda la bomba y ajuste manualmente la velocidad de flujo directo a tres microlitros por minuto. Luego aspire el etanol al 99 % seguido por agua destilada para eliminar las impurezas producidas por el corte.

Después de eso, aspire nuevamente el etanol al 99 % para facilitar el secado. Posteriormente, almacene las agujas en una placa de Petri adecuadamente cubierta hasta el día de la cirugía. Para reutilizar las agujas, al final del experimento, límpielas con detergentes apropiados y etanol al 70 % para eliminar la solución inyectada y cualquier residuo tisular posible.

Si es necesario, estas agujas incluso pueden hervirse en frascos de vidrio dedicados llenos con agua destilada. En este paso, seleccione el menú de configuración para calibrar la bomba según el diámetro por volumen de la jeringa de microinyección. Y establezca el caudal en 0,3 microlitros por minuto.

Luego, llene una jeringa de 10 mililitros con agua estéril. Y utilícela para llenar la jeringa de microinyección y las piezas del kit de ensamblaje de inyección para la bomba de microinyección manual. Después de eso, conecte la aguja al kit de la bomba de microinyección manual.

Desconecte la jeringa de 10 mililitros de la jeringa de microinyección mientras empuja lentamente el émbolo, con el fin de dejar una gota de agua en la parte superior de la jeringa de microinyección. A continuación, inserte el émbolo en la jeringa de microinyección. Ahora, conecte la jeringa de microinyección a la bomba y ajuste el caudal a 0,3 microlitros por minuto.

Posteriormente, cambie el caudal a 0,1 microlitros por minuto e inicie el procedimiento quirúrgico. Para realizar la cirugía, afeite la cabeza del animal y límpiela con una toallita con alcohol. A continuación, coloque la rata en el marco estereotáxico.

Realice un corte longitudinal sobre el cráneo utilizando un escalpelo esterilizado. Sea cuidadoso para evitar sangrado excesivo. A continuación, abra el cuero cabelludo usando una espátula plana y coloque pinzas quirúrgicas en los bordes de la piel para mantenerla abierta.

Con mucha suavidad, desprenda el periostio para exponer el bregma y la zona del cráneo a través de la cual se insertará la aguja. Posteriormente, monte el brazo en el marco estereotáxico y coloque la punta de la aguja justo encima del bregma, teniendo cuidado de no romperla. Anote las coordenadas anteroposteriores y mediales-laterales del bregma y mueva la aguja hasta las coordenadas deseadas.

Luego, baje la aguja hasta que su punta casi toque el cráneo, marcando el punto de perforación después de elevar ligeramente el brazo estereotáxico. Perfore el cráneo en el punto marcado, teniendo cuidado de no dañar las meninges ni el cerebro. A continuación, corte un pequeño trozo de película de parafina plástica y colóquelo sobre el cráneo.

Utilizando la pipeta de 10 microlitros, haga una gota de la solución para aplicar sobre la película de parafina plástica. Detenga la bomba, retire ligeramente el empujador de la bomba y cree una pequeña burbuja de aire en el capilar tirando suavemente del pistón de la jeringa de microinyección. Baje la punta de la aguja hasta que alcance la gota.

Extraiga la muestra tirando muy lentamente del pistón de la jeringa de microinyección, evitando la formación de burbujas. Reemplace el empujador de la bomba en contacto con el pistón y encienda la bomba a un caudal de 0,3 microlitros por minuto. Luego, espere hasta la formación de una gota antes de pasar al siguiente paso.

A continuación, reduzca el flujo a 0,1 microlitros por minuto. Haga una pequeña incisión en la duramadre con una aguja de punta biselada de acero inoxidable y baje lentamente la aguja para penetrar en el tejido cerebral. Cuando se alcance la posición deseada, descienda adicionalmente 0,1 milímetros y luego detenga la bomba.

Eleve el brazo estereostático en 0,1 milímetros e inicie nuevamente la bomba a 0,3 microlitros por minuto. Después de eso, inicie el temporizador y la inyección. Monitoree el movimiento de la burbuja durante la inyección.

Al final, detenga la bomba y espere cinco minutos antes de retirar lentamente la aguja. Cuando la aguja de cuarzo esté completamente extraída, encienda la bomba nuevamente y verifique la formación de una gota en la punta de la aguja. A continuación, selle la abertura en la superficie del cráneo con cera ósea.

Retire los clips homeostáticos y sutúre el cuero cabelludo. Aplique una crema antibiótica en la zona alrededor de la herida y devuelva el animal a su jaula de alojamiento. Estas son las secciones coronales de ocho micrómetros de los cerebros de rata a nivel del estriado.

Esta imagen muestra los daños producidos por la inyección de dos microlitros de ACSF, utilizando una aguja de acero inoxidable roma de calibre 26. Por el contrario, el estriado inyectado con una aguja de cuarzo no mostró ningún daño detectable. Estas otras imágenes muestran los daños inducidos por las dos agujas a nivel del hipocampo dorsal.

Pero la aguja de cuarzo no produjo ningún daño detectable. Las inyecciones exitosas con ambas agujas se evidenciaron mediante la distribución del azul de tripano. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas, si se lleva a cabo correctamente.

Tras seguir estos procedimientos, todo lo que sea necesario, como cirugías adicionales, puede realizarse para responder diferentes preguntas, como el efecto inducido por fármacos. Tras este avance, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran el efecto de toxinas y fármacos y, más recientemente, productos de terapia génica y celular en modelos animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo realizar microinyecciones en regiones cerebrales profundas sin lesiones detectables, utilizando agujas de cuarzo personalizadas.

No olvide que el uso de reactivos y/o patógenos disecados con láser puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como procedimientos de seguridad con láser y equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.