Efectos del trasplante Allogeneic Plasma rico en plaquetas (PRP) en el proceso de cicatrización de los tendones de Aquiles seccionado de las ratas: una descripción metodológica

El objetivo general de este procedimiento es observar los efectos de una sola inyección de plasma rico en plaquetas, o PRP, en la resistencia y el proceso de curación de los tendones de Aquiles de rata seccionados quirúrgicamente en varios puntos temporales. Este método puede ayudar a responder preguntas rápidas en el campo musculoesquelético sobre las lesiones tendinosas. La principal ventaja de esta técnica es que los procedimientos quirúrgicos, biomecánicos y de progresión del PRP están bien estandarizados.

Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia el uso de PRP en humanos, ya que este tipo de lesiones y el proceso de cicatrización de los tendones son similares entre ratas y humanos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la preparación del PRP para las lesiones musculoesqueléticas, esta técnica de inyección también se puede aplicar a otros sistemas, como las enfermedades cardíacas o de la piel. La demostración visual del método es muy importante, ya que los pasos quirúrgicos y biomecánicos requieren una reproducibilidad constante para obtener resultados óptimos.

Comienza pesando y marcando las orejas de la rata. Después de confirmar el nivel adecuado de sedación mediante el pellizco de los dedos del pie, aplique gotas de agua sobre las córneas del animal y retire el pelo de la extremidad trasera izquierda. Desinfecte la piel expuesta con una dilución de uno a 10 de la solución de iso-Betadine y coloque al animal en una almohadilla térmica de 20 grados Celsius bajo un microscopio de disección en la posición de decúbito lateral, con la extremidad posterior izquierda en la posición superior.

Agarre la pata de la extremidad trasera izquierda con pinzas y haga una incisión lateral de 20 a 25 milímetros en la piel alrededor del tendón de Aquiles. Con unas tijeras finas, diseccione la fascia para exponer el complejo del tendón de Aquiles y extirpe el tendón plantar. Corta el tendón de Aquiles transversalmente, cinco milímetros proximales a su inserción calcánea, y retira una porción de cinco milímetros de largo.

A continuación, utilice hilo reabsorbible y continúe con suturas para cerrar la fascia y la piel, y coloque la rata bajo una fuente de calor con seguimiento hasta su completa recuperación. Mientras los animales receptores se recuperan, recoja 20 mililitros de sangre entera de un corazón de rata donante por animal de experimentación en tubos individuales que contengan citrato de sodio tamponado al 3,2%. Para obtener el plasma rico en plaquetas, centrifuga la sangre y utiliza una pipeta de transferencia de plástico para recolectar cuidadosamente la fase superior que contiene PRP en un segundo tubo de plástico.

Determine el volumen de PRP recogido y mida el recuento de plaquetas en un analizador de hematología. Vuelva a centrifugar el PRP y transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de plástico. El volumen restante en el tubo de PRP debe ser de alrededor de 2/3 del volumen requerido para lograr 2,5 veces 10 a la sexta plaquetas por microlitro.

A continuación, vuelva a suspender suavemente el pellet de plaquetas con pipeteo. Mida el recuento de plaquetas de este plasma concentrado rico en plaquetas, añadiendo el volumen adecuado de plasma autólogo pobre en plaquetas para alcanzar la concentración objetivo según sea necesario. Activar las plaquetas con 50 microlitros de cloruro de calcio por mililitro de PRP durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente.

A continuación, cargue las plaquetas en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 21 e inyecte 50 microlitros de las plaquetas directamente en el sitio de sutura de cada animal. En el punto final experimental apropiado, afeitar la extremidad trasera izquierda del animal de experimentación anestesiado y colocar la rata bajo un microscopio de disección como se acaba de demostrar. Sosteniendo la pata con los dedos, haga una incisión de 10 milímetros en el sitio quirúrgico para exponer el tríceps sural.

Para extirpar el tendón de Aquiles, corte el hueso calcáneo transversalmente, de cinco a 10 milímetros distal a su inserción y diseccione una pieza del tríceps sural lo suficientemente grande como para caber en la criomandíbula. Utilice pinzas para colocar la muestra inmediatamente en la mandíbula superior de la mandíbula criogénica y cierre el instrumento. Coloque la mandíbula criogénica verticalmente en una máquina de prueba universal y fije el hueso calcáneo entre las pinzas inferiores.

Para calcular el área de la sección transversal, coloque las cámaras perpendiculares entre sí. Agregue nitrógeno líquido en ambas cuencas de la mandíbula superior para congelar el músculo a un orden de magnitud más rígido que el tendón, de modo que no se deforme durante la prueba de tracción. Cuando la zona de congelación alcance el borde de la abrazadera de metal, establezca la tasa de desplazamiento de la máquina a una velocidad constante de un milímetro por segundo hasta la ruptura y comience la prueba de tracción, usando una computadora para registrar la resistencia a la tracción máxima en Newtons.

Para tener en cuenta las diferencias en las áreas de la sección transversal de los tendones en curación, normalice la resistencia máxima a la tracción a un área unitaria que represente la tensión mecánica experimentada por el tejido. Luego, cuando el tendón se rompa, congele las muestras de tendón roto en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 80 grados centígrados hasta la extracción del ARN y el análisis RTPCR. En este experimento representativo, se requirió una mayor fuerza para inducir la ruptura del tendón en el grupo inyectado con PRP que en el grupo de control tratado con solución salina en cada punto de tiempo probado, lo que sugiere un proceso de curación más robusto o mejores propiedades mecánicas dentro de los animales tratados con PRP.

Aunque el grupo de PRP demostró una mayor dispersión intragrupo que el grupo de solución salina, se determinó que el área de la sección transversal de los tendones era mayor en el grupo inyectado con PRP a los 15 y 30 días después de la inducción de la lesión. Además, la tinción tricrómica de Masson reveló una mayor presencia de colágeno fibrilar, un componente clave en la morfología y la resistencia del tendón, en los animales tratados con PRP en los días cinco y 15, con una intensidad similar de tinción observada en ambos grupos el día 30 después de la inyección. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inducir lesiones estándar en ratas y tomar muestras del tendón para evaluar su proceso de curación después de una inyección de PRP.