Expansión y Adipogénesis Inducción de Progenitores Adipocíticos de Tejido Adiposo Perivascular Aislado por Clasificación de Células Magnéticas Activadas

Los objetivos generales de estos protocolos de aislamiento y diferenciación son obtener células progenitoras de adipocitos a partir de tejidos adiposos perivasculares e inducir su diferenciación en adipocitos maduros. Este método permite el análisis de poblaciones de células progenitoras de adipocitos específicas y definidas a partir de tejido adiposo perivascular, con un impacto mínimo en su morfología, viabilidad y potencial de proliferación y diferenciación. La principal ventaja de esta técnica es que permite un mayor aislamiento de las células presentadoras de antígenos por gramo de tejido adiposo, en comparación con la clasificación de células activadas por fluorescencia.

Después de confirmar una falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie, haga una incisión vertical en la línea media a lo largo del esternón hasta el área perineal de la rata, para acceder a la cavidad abdominal. Exponga la arteria mesentérica superior, los pequeños vasos de resistencia mesentérica y la aorta torácica, y corte todas las conexiones con el mesenterio y la aorta. Recoja el tejido adiposo gonadal y transfiera las almohadillas de grasa aisladas a un nuevo recipiente de tampón de bicarbonato Krebs-Ringer, o solución KRBB, suplementado con montones de 10 milimolares.

Transfiera los vasos a una placa de Petri que contenga una solución de KRBB y coloque la placa bajo un microscopio de disección. Extirpar el tejido adiposo perivascular de los pequeños vasos de resistencia mesentérica y la aorta. En una campana de bioseguridad, transfiera unos 50 miligramos de tejido a un tubo de 1,7 mililitros que contenga 1 mililitro de solución de colagenasa tipo I y pique el tejido en trozos de 1 a 3 milímetros.

Es importante picar adecuadamente el tejido adiposo para permitir que la colagenasa se infiltre completamente en el tejido conectivo. Incubar los fragmentos a 37 grados centígrados agitando durante 1 hora. A continuación, filtre secuencialmente el material digerido a través de filtros de células individuales de 100 y 40 micras en un tubo de 50 mililitros.

Recoja el filtrado resultante por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 1 mililitro de tampón de lisis eritrocitaria. Transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo Microfuge de 1,7 mililitros para una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. A continuación, recoja las células de la fracción vascular estromal con otra centrifugación y vuelva a suspender el pellet en el medio basal de la fracción vascular estromal para su recuento.

Para aislar las células progenitoras de los adipocitos mediante clasificación de células activadas magnéticamente, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un tampón de bloqueo de clasificación de células activado magnéticamente a una concentración de 1 por 10 a la sexta célula por mililitro para una incubación de 20 minutos a 4 grados Celsius. Es esencial que todos los pasos del aislamiento se realicen a 4 grados centígrados, y no sobre hielo. A continuación, incube las células con 5 microlitros de anti-CD34 de ratón conjugado con FITC durante 30 minutos.

Recoger las células por centrifugación. A continuación, incubar las células con 4 microlitros de MicroBeads anti-FITC en 96 microlitros de tampón de clasificación de células activado magnéticamente durante 5 minutos en la oscuridad. Mientras las células se incuban, coloque una columna de clasificación múltiple en el separador magnético con un tubo de desecho de 5 mililitros debajo de la columna.

Enjuague la columna con 500 microlitros de tampón de clasificación de celdas activadas magnéticamente y deseche el efluente y el tubo de desechos. A continuación, coloque un nuevo tubo debajo de la columna y cargue las células en la parte superior de la columna, recogiendo las células negativas CD34 sin etiquetar en el nuevo tubo de recolección. Cuando todas las células hayan pasado por la parte superior de la columna, lave la columna 3 veces con 500 microlitros de tampón de clasificación de células activado magnéticamente desgasificado, continuando acumulando el eluido en el tubo de recolección.

Después del último lavado, transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección y use el émbolo de la columna para enjuagar 1 mililitro de tampón de clasificación de celdas activado magnéticamente a través de la columna hacia el tubo, para recolectar las celdas CD34 positivas. Recoger las células progenitoras de los adipocitos por centrifugación. A continuación, incubar la fracción positiva CD34 en 10 microlitros de receptor alfa del factor de crecimiento antiplaquetario derivado de conejo durante 30 minutos.

Al final de la incubación, vuelva a centrifugar las células e incube el pellet en 4 microlitros de MicroBeads de IgG anti-conejo en 96 microlitros de tampón de clasificación celular activado magnéticamente para el aislamiento de perlas magnéticas de las células alfa positivas del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, como se acaba de demostrar. Para cultivar las células progenitoras de adipocitos alfa positivas del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas CD34, siembre las células en placas de cultivo de tejidos individuales de 6 pocillos en medio basal y coloque las placas en una incubadora de cultivo celular de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de 3 pasos en serie, siembre las células en placas de cultivo de tejido negro de 96 pocillos a 1 por 10 a las 2 células por pocillo, y evalúe su proliferación a las 8, 24, 48 y 96 horas a 5 veces 10 por 4 células por pocillo, en placas de ensayo de 24 pocillos, de acuerdo con los protocolos estándar de ensayo de proliferación.

Para inducir la adipogénesis, cuando el cultivo de células progenitoras de adipocitos alcanza la confluencia, se alimentan las células con medio basal progenitor de adipocitos durante 48 horas, luego se tratan los cultivos con proteína morfogénica ósea 4 durante otras 48 horas. Al tercer día, reemplace el medio con medio de inducción de células progenitoras de adipocitos, sin IBMX y exametasona durante 14 días. El grado de adipogénesis en los cultivos se puede evaluar de 1 por 10 a la cuarta célula por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos, de acuerdo con los protocolos estándar de ensayo de adipogénesis.

Aunque ambos métodos demuestran una distribución y viabilidad de la población celular similar, el aislamiento de clasificación celular activado magnéticamente produce un mayor número de células para cultivo, en comparación con la clasificación celular activada por fluorescencia. En este experimento representativo, se evaluó la proliferación in vitro de la fracción vascular estromal y las células progenitoras de adipocitos aisladas de la aorta torácica, los pequeños vasos de resistencia mesentérica y el tejido adiposo gonadal de ratas macho, a las 8, 24, 48 y 96 horas después de la siembra, utilizando un ensayo cuantitativo de ADN. No se observaron diferencias en las tasas de expansión de la fracción vascular estromal en ningún momento, excepto para las células progenitoras de los adipocitos de la aorta torácica, que demostraron una menor proliferación a las 96 horas, en comparación con las células vasculares estromales del mismo sitio.

La estimulación de las células progenitoras de adipocitos confluentes con proteína morfogénica ósea 4 durante 48 horas induce la diferenciación de los adipocitos, evidenciada por una mayor acumulación de lípidos en las gotas, según lo evaluado tanto por el ensayo de captación de lípidos fluorescentes como por la tinción con Oil Red O. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 8 horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener temperaturas de 4 grados centígrados durante los pasos de aislamiento.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y diferenciar las células progenitoras de los adipocitos.