Seguimiento de la liberación de calcio ER / SR con el Ca ²⁺ Sensor de Captura

El objetivo general de este experimento es mostrar nuestros protocolos para el cultivo y la transfección de células HEK293 y C2C12 con CatchER plus y su aplicación para el seguimiento de los transitorios de calcio mediados por el receptor ERSR en la medición del NC2KD. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la señalización del calcio y la obtención de imágenes, como la concentración basal de calcio y sus rápidos cambios en la ERSR de células definidas y cómo aplicar el biosensor CatchER plus para estas mediciones. La principal ventaja de esta técnica es que la respuesta de fluorescencia de las células individuales se puede registrar en tiempo real con una cinética rápida.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de enfermedades relacionadas con el calcio ERSR porque CatchER plus puede monitorear los transitorios anormales de calcio en estos orgánulos que surgen de elementos de señalización de calcio disfuncionales. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de transfección celular e imágenes de fluorescencia son difíciles de aprender porque el cultivo celular y la microscopía tienen múltiples áreas de error. La demostración del procedimiento estará a cargo de Florence Reddish, post-doc de nuestro laboratorio.

Para comenzar este experimento, siembre células HEK293 en los portaobjetos de microscopio de vidrio esterilizados en las placas de seis centímetros y cultive durante uno o dos días hasta que tengan aproximadamente un 70% de confluente el día de la transfección. A continuación, vacíe el DMEM de la placa y añada tres mililitros del medio sérico reducido. A continuación, añada la mezcla de reactivos de transfección de ADN a la placa e incube durante cuatro a seis horas a 37 grados centígrados.

La transfección de las células HEK293 es generalmente más fácil que la de otras líneas celulares, pero las células son menos resistentes a las condiciones adversas. Por lo tanto, es fundamental exponerlos solo a los reactivos de transfección durante cuatro a seis horas para evitar la apoptosis. Después de cuatro a seis horas, lave las células con cinco a seis mililitros de HBSS.

Deseche el HBSS del plato y reemplácelo con tres mililitros de DMEM fresco. Posteriormente, incubar las células durante 48 horas a 37 grados centígrados para permitir la expresión de GECI. En el caso de las células mioblastos C2C12, tripsinícelas añadiendo uno o dos mililitros de tripsina para cubrir el fondo de la placa.

A continuación, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante dos a seis minutos para permitir que la tripsina afloje las células del fondo de la placa. Una vez completada la incubación, retire la tripsina y aspire las células en ocho mililitros de DMEM. Pipetear las células a fondo con DMEM para dispersarlas uniformemente y volver a suspenderlas.

A continuación, se siembran en los cubreobjetos estériles en placas de cultivo de seis centímetros y se añaden tres mililitros de DMEM para conseguir una confluencia final del 60%A continuación, transfectar las células el mismo día. Incubarlos durante 24 horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, lave las células con cinco a seis mililitros de HBSS.

Deseche el HBSS del plato y reemplácelo con tres mililitros de DMEM fresco. Luego, incubarlos a 37 grados centígrados durante 48 horas para permitir la expresión del GECI. En este procedimiento, encienda el microscopio y la fuente de luz, luego abra el programa PCI simple.

Con un hisopo de algodón, cubra la parte inferior de la cámara de imágenes de baño de diamante abierto de bajo perfil con una capa delgada de sellador. A continuación, saque de la incubadora un portaobjetos que contenga las células transfectadas y enjuáguelo suavemente tres veces con alrededor de un mililitro de tampón de Ringer con 10 milimolares de glucosa y 1,8 milimolares de calcio precalentado a 37 grados centígrados. Deje aproximadamente un mililitro de tampón de Ringer en el plato para evitar que las células se sequen y use pinzas para sacar el portaobjetos del plato.

Absorba el exceso de solución tocando el borde del portaobjetos con un pañuelo de laboratorio. Luego, colóquelo en el costado de la cámara con las celdas hacia la grasa. A continuación, fije la cámara en el soporte del escenario con un destornillador.

Agregue alrededor de un mililitro de tampón de Ringer a la cámara para evitar que las células se sequen mientras lo monta en la platina y completa la configuración del microscopio. Cambie el objetivo del microscopio al objetivo de inmersión en aceite de 40 veces. Añade una gota de aceite de inmersión al objetivo.

A continuación, coloque la montura en la platina del microscopio. Luego, coloque la punta de vacío en la cámara para mantener la solución nivelada y evitar que se llene en exceso. A continuación, eleve el objetivo utilizando el ajuste de rumbo hasta que el aceite del objetivo toque la parte inferior del tobogán.

Con el modo de campo claro, ajuste la ganancia a 175 y el tiempo de exposición a 0,03 segundos para enfocar las celdas. Una vez que las células estén enfocadas, cambie al modo de fluorescencia con una excitación de 488 nanómetros y cambie el tiempo de exposición a 0,07 segundos. Localice un campo de visión que tenga suficientes células sanas con una fluorescencia adecuada para la obtención de imágenes.

A continuación, tome fotografías en modo de fluorescencia y campo claro. Encierre en un círculo una región de interés en las celdas o encierre en un círculo toda la celda para registrar la intensidad del área elegida. Ahora, inicie la medición de la intensidad con la velocidad de fotogramas establecida en uno cada cinco segundos.

Permita que la intensidad de referencia se estabilice durante 20 a 30 fotogramas. A continuación, calcule la cantidad de 4-CMC necesaria de un stock de 20 milimolares en función del volumen final de la cámara de 450 microlitros para hacer una concentración final de 200 micromolares. Luego, transfiera con cuidado 60 microlitros de tampón de Ringer de la cámara a un tubo de microcentrífuga.

Diluya la cantidad calculada de 4-CMC con esta solución y vuelva a añadirla a la cámara para evocar la respuesta prevista de las células que se están tomando en imagen. Deje tiempo para que el fármaco se una al receptor y la consiguiente disminución de la señal. A continuación, lave las células con tres a seis mililitros de tampón de Ringer mientras añade simultáneamente el marcador de evento.

Repita los procedimientos para 100 micromolares de ATP y 15 micromolares de CPA utilizando un nuevo portaobjetos de las células transfectadas para cada ensayo. Una vez completada la medición, finalice la recopilación de datos en la ventana de medición de intensidad en el programa PCI simple. Posteriormente, tome las imágenes de fluorescencia y campo claro de las células.

A continuación, abra el archivo de datos del experimento. Vuelva a rodear las celdas o regiones de interés para volver a calcular los valores de intensidad si es necesario. Para determinar las células de mioblastos NC2KD y C2C12, repita el procedimiento de transfección y agregue un mililitro de tampón de Ringer sin calcio en la cámara.

Permeabilizar las células con 0,002 a 0,005% de saponina y tampón intracelular durante 15 a 30 segundos para vaciar las células de cualquier CatchER plus que pueda haber en el citosol. A continuación, lave las células con tres a seis mililitros de tampón KCL que contenga EGTA y 10 micromolares de ionomicina. Deja que la intensidad disminuya hasta llegar a una meseta.

Después de eso, enjuague las células con tres a seis mililitros de tampón KCL con ionomicina 10 micromolares y permita que la intensidad se estabilice. Después, agregue diferentes soluciones de calcio para permitir que la intensidad alcance una meseta entre cada adición. Para calibrar el sensor para la cuantificación de la concentración basal de calcio, utilice EGTA y un tampón de calcio de 100 milimolares para obtener la intensidad de fluorescencia mínima y máxima.

Aquí se muestran los rasgos representativos de la intensidad normalizada recogida de las células de mioblastos C2C12 permeabilizadas transfectadas con CatchER plus. Las células se permeabilizaron con saponina al 0,005% en el tampón intracelular durante 15 a 30 segundos. Las soluciones de EGTA y calcio se prepararon en tampón KCL y N se refiere al número de células fotografiadas.

Estas imágenes de fluorescencia insertadas son los representantes de las células antes y después del tratamiento. Se añadieron 0,2, 0,6, dos, cinco, 10, 20, 50 y 100 milimolares de calcio a las células de mioblastos C2C12 permeabilizadas en presencia de 10 micromolares de ionomicina para obtener una KD de 3,1 más o menos 1,4 milimolares. Esta figura muestra una medición representativa de la intensidad de las células transfectadas con CatchER más los valores mínimos y máximos después de la adición de un milimolar de EGTA y 100 milimolares de calcio con 10 micromolares de ionomicina cada uno, respectivamente.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 a 60 minutos para la toma de imágenes o tres días si se incluye la transfección. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que siempre debe manipular las células en un entorno estéril, preparar los reactivos antes del experimento, aplicar una capa uniforme de grasa a la cámara y tener la aspiradora conectada antes de comenzar. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el Western blot, para responder a preguntas adicionales, como el nivel de expresión de CatchER plus.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la señalización y la imagen del calcio exploraran la dinámica del calcio ERSR en células de mamíferos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar células y obtener imágenes de ellas con CatchER plus.